Introduction
Bryst kræftceller metastaserer til knoglemarven før sygdommen er detekterbar 1, så snart små tumorer udvikle blodkar 2,3. Den metastatiske proces er hurtig men ineffektiv. Celler indtaste nye blodkar hurtigt på millioner per dag 4, men kun få overlever turen til fjerne organer 5. Ikke desto mindre, nogle mikrometastaser overleve i knoglen og kan findes som enkelte celler eller små celleklumper i knoglemarvsaspirater fra nydiagnosticerede patienter 1. Disse celler modstå adjuverende kemoterapi, som administreres for selve formålet med at fjerne dem 6. Denne modstand er udstyret, betydeligt, ved at overleve signalering initieret af interaktioner med knoglemarvens mikromiljø 7,8. Mikrometastaser kan findes i omkring en tredjedel af kvinder med lokaliseret brystcancer og udgør en uafhængig indikator for overlevelse ved analyse ved univariate analyse 9. Nogle micrometastases er vækst indledt, men tilbagefald mønstre afhænger af celletype. Patienter med kræft triple negativ brystkræft tendens til at gentage sig på mellem 1 til 4 år, hvilket tyder på dårlig kontrol over sovende tilstand. Andre celletyper, herunder ER / PR + celler, kan forblive i dvale i op til 20 år, med en stabil, kontinuerlig sats for fornyet 10. Mens forskelle i hviletilstand genekspression signaturer mellem ER + og ER- bryst cellelinjer og tumorer afspejler forskellige hviletilstand potentialer 11, interaktioner med knoglemarvsstroma sandsynligvis udgør et væsentligt bidrag til hviletilstand.
Studiet af hviletilstand in vivo er usædvanligt vanskeligt, fordi micrometastases er sjældne og er undertal hæmatopoietiske celler med mere end 10 6 fold. Derfor skal de relevante modeller genereres der giver in vitro data, der kan foreslå mekanismer og generere testbare hypoteser in vivo. En række hviletilstand modeller, herunder Mathematisk modeller 12,13, in vitro modeller 7,8,14,15, in vivo xenograftmodeller 16, kombinationer af in vitro og xenograftmodeller 17,18 og spontane tumor og metastase-modeller 19, har givet et indblik i kræftcellen vækstdvale 20 . Hver af disse modeller har deres egne begrænsninger og er af sig selv primært nyttig til at generere hypoteser vedrørende molekylær signalering og interaktioner, der styrer hviletilstand, der skal testes i mere biologisk relevante modeller.
Med det overordnede mål at definere de molekylære mekanismer i vækstdvale, interaktionerne med mikromiljø, der resulterer i cyklus anholdelse, redifferentiation og terapeutisk modstand og mekanismer, der resulterer i tilbagefald i ER + celler, udviklede vi en in vitro model, der giver udvalgte relevante dele af stromale mikromiljø 7. Denne model, mens relativt sparsomme i sin komponenter, er tilstrækkeligt robust til at tillade efterforskere til at udlede specifikke molekylære mekanismer, der påvirker væsentlige funktioner vækstdvale. Disse eksperimenter generere hypoteser, der direkte kan testes in vivo. Modellen bygger på et par vigtige elementer, som vi vist sig at være relevant i dvale. De omfatter anvendelse af østrogen-afhængige brystcancerceller, dyrkning af celler ved en klonogen tæthed hvor deres interaktion primært med underlaget og opløselige komponenter i mediet, et fibronectin substrat og tilstedeværelsen af basisk fibroblast vækstfaktor (FGF-2) i mediet.
Vi kendetegnet mekanismer, der styrer systemet in vitro, herunder induktion af standsning af cellecyklus ved FGF-2 21, medieret gennem TGFp 22, overlevelse signalering gennem PI3 kinase 7,8 og ERK 8 og morfogene differentiering til en epitelial fænotype, der afhang af RhoA inaktivering integrin45; 5β1 opregulering og ligering af stromal fibronectin for overlevelse 7,15 (Figur 1). De in vitro cellecyklus virkninger af FGF-2 på MCF-7-celler begynder ved koncentrationer mindst en log under 10 ng / ml 21,23. Rationalet var baseret på den tidsmæssige styring af FGF-2-ekspression regulerer mamma ductal morfogenese, cyklisk ekspansion og recession i en række af mammale systemer 24-27. Vi viste, at FGF-2 inducerer differentiering, herunder duktalt morfogenese i 3D kultur 28, og at FGF-2-ekspression er generelt tabt med malign transformation af humane tumorer 29. Ekspressionen af FGR1 forblev intakt i brystcarcinomer adspurgte 29 og MCF-7-celler fortsætter med at udtrykke alle 4 FGF-receptorer 30. I forbindelse med hvileperioden er FGF-2 eksporteres af og stærkt aflejret på knoglemarvsstroma 31,32 hvor det fungerer på bevarelsen af hæmatopoietiske stamceller 33. Vi demonstrated at FGF-2 inducerer en sovende tilstand i ER + brystkræft celler dyrket på fibronectin substrater, også rigeligt i marven, hvor det inducerer morfogen differentiering 7. I modellen, brystkræftceller er vækst hæmmes, inaktivere Rho A gennem RhoGap GRAF, redifferentiate en epitelial fænotype og re-express integriner α5β1 lost med ondartet progression. De binder fibronectin gennem integrin α5β1 og aktivere overlevelse signalere, at gøre dem resistente over for cytotoksisk terapi 7,8,15 (figur 1). Inhibering af Rho klasse GTPaser er blevet påvist tidligere at inducere en hvilende fænotype 34.
Her vil vi skitsere de specifikke procedurer, der vil tillade efterforskerne at etablere modellen og studere specifikke molekylære og cellulære mekanismer, der styrer hviletilstand af ER + brystkræft celler. I eksperimenterne præsenteret her for at illustrere anvendelsen af modellenVi målrettet PI3K pathway (figur 1B) med en Akt inhibitor og en PI3K-hæmmer og alle medlemmer af Rho familie (figur 1B) med en pan-Rho-hæmmer og en Rho-kinase (ROCK) hæmmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klongenicitetsassayet
- Forberede en enkelt celle suspensioner af østrogenafhængige brystkræft cellelinier MCF-7 og T47D-celler under anvendelse nedenstående trin
- Aspirer dyrkningsmedium (DMEM / 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum / glutamin og pen / strep) fra en 10 cm vævskulturskål, der er ikke mere end 50% konfluente med MCF-7 eller T-47D-celler. Skyl med PBS. Inkuber med trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA opløst i DMEM høj glucose ved 37 ° C i 1-4 min.
- Check celler med 1 minuts intervaller under et fasekontrastmikroskop at sikre en enkelt celle distribution. Resuspender cellerne med en 2 ml pipette ved pipettering op og ned adskillige gange for at forstyrre celle-celle-kontakt for at opnå en næsten uvægerligt, enkelt celle status.
- Fortsæt med at inkubere cellerne i trypsin ved 37 ° C i op til 4 min, hvis du observere klumper af celler efter kun 2 minutters inkubation. Brug ikke disse celler til klonogene undersøgelser, hvis de forbliver klæbende til eanden efter 4 min af trypsinisering ACH fordi fejl vil blive indført i kolonien nummer udbytte.
BEMÆRK: Hvis cellerne klumpet, vil antallet af dannede kolonier afspejle produktet af færre celler end antallet inkuberes. Hvis celler overdrevent trypsiniseres, kan deres klonogen potentiale mindskes. - Der fremstilles en enkelt cellesuspension af 1.500 celler / ml dyrkningsmedium til plader med 24 brønde eller mindre (+ 500 celler / ml, afhængigt af den celletype eller passage nummer), ved serielle fortyndinger i en master rør indeholdende hele nødvendig for volumen alle variabler i eksperimentet.
BEMÆRK: Målet er en endelig celletæthed på 800 celler / cm2 (rækkevidde på ca. 500 til 1.100 celler / cm2). Målet er at give cirka 100 + 50 kolonier, der tillader relativt let optælling, forhindrer fortrængning og tillader et tilstrækkeligt antal kolonier til at resultere i signifikante statistiske forskelle, når kolonier øges eller mindskes ved eksperimentel perturbationer.
- Cellerne inkuberes ved Klonogen Density Brug nedenstående trin
- Cellerne inkuberes i firdobbelte brønde på 24 brønds fibronectin-overtrukne plader ved en klonogen densitet på 1.500 celler / brønd fra en master enkelt cellesuspension rør på 1.500 celler / ml. Udriv medium indeholdende celler med en 5 ml pipette ved at udarbejde 3 ml og dispensering 1 ml medium i hver af 2 brønde.
BEMÆRK: fibronectincoatede plader skal købes præ-coatet fra en kommerciel leverandør. Coating plader uden for en kvalitet kontrolleret, automatiserede proces resulterer i en ujævn overflade uegnede til denne analyse. - Bland suspensionen ved pipettering op og ned med en 5 ml pipette, udarbejder 3 ml cellesuspension og fyld 2 brønde med 1 ml hver. Fyld kun 2 brønde på én gang fra en pipette. Retur det resterende volumen i pipetten til cellesuspensionen i master rør, resuspender cellerne igen ved pipettering op og ned og udarbejde en anden 3 ml til at fylde en anden 2 wells med 1 ml hver.
BEMÆRK: Kontinuerlig blanding af master røret er nødvendig, fordi celler kontinuerligt vil sedimentere. Udarbejdelse tilstrækkeligt volumen til at fylde kun 2 boringer er nødvendigt at tilføje lignende celletal til hver brønd, fordi cellerne sediment i pipetten så godt. - Arbejde hurtigt at fordele de store mængder af celler, fordi tillader celler at sidde i suspension ved stuetemperatur og CO 2 -koncentration vil modulere deres klonogene potentiale (upublicerede observationer).
- Optimer den rumlige fordeling af celler under den handling at pipettering dem i brønde til koloni analyser. Gøre det ved langsomt pipettering af suspensionen indeholdende den endelige cellekoncentration ind i midten af brønden. Udsæt ikke pladen til yderligere bevægelse, før cellerne afregne til bunden. Må ikke hvirvel pladen, fordi cirkulære blanding effektivt vil centrifugere cellerne til omkredsen af godt skabe høje celledensiteter og utallige sammenflydende kolonier på 6 dage.
BEMÆRK: Bland ikke medmindre det er nødvendigt, da dette er mindre ønskeligt end ingen blanding på alle efter at indføre lydstyrken med cellerne i suspension. Hvis det er nødvendigt at blande celler, gøres det ved at bevæge pladen frem og tilbage i vinkelrette retninger, mens det hviler på en flad overflade. - Cellerne inkuberes ved 37 ° C 5% CO2 uden medier ændring i 6 dage. Det lille antal celler i en brønd efter 6 dage, vil ikke i væsentlig grad påvirker næringsstof eller cytokin sammensætning eller pH af den oprindelige medium.
- Designe tidsforløbet af assayet som følger: Inkuber celler på fibronectin belagte substrater på dag 1. Erstat eksisterende medium med 1 ml frisk medium eller frisk medium indeholdende FGF-2 10 ng / ml på dag 0. Farv celler på dag 6 som nedenfor i 1.4). Gennemføre eventuelle eksperimentelle forstyrrelser på dag 3, som nedenfor i 1.3).
- Cellerne inkuberes i firdobbelte brønde på 24 brønds fibronectin-overtrukne plader ved en klonogen densitet på 1.500 celler / brønd fra en master enkelt cellesuspension rør på 1.500 celler / ml. Udriv medium indeholdende celler med en 5 ml pipette ved at udarbejde 3 ml og dispensering 1 ml medium i hver af 2 brønde.
- Set Up Eksperimentelle forstyrrelser af Molecular Signaling eller adhæsionsmolekyler
- På dag 3, tilsættes 10056 l af en opløsning indeholdende 10x af det endelige koncentration af det forstyrrende middel til 1 ml medium i brøndene. Må ikke blandes. Fortsæt med at inkubere cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i yderligere 3 dage.
BEMÆRK: forstyrrende midler kan indbefatte en række forskellige inhibitorer og blokerende midler af adhæsionsmolekyler, receptorer eller andre overfladeproteiner, inhibitorer af intracellulære signalveje, molekyler, faktorer, cofaktorer eller strukturelle proteiner, som kan spille roller i at støtte sovende tilstand. - Farv kolonier på dag 6 som følger.
- På dag 3, tilsættes 10056 l af en opløsning indeholdende 10x af det endelige koncentration af det forstyrrende middel til 1 ml medium i brøndene. Må ikke blandes. Fortsæt med at inkubere cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i yderligere 3 dage.
- Stain Kolonier
- Farv celler efter 6 dage i kultur med en frisk gjort 0,1% krystalviolet i 2% ethanol / 10 mM natriumborat (pH 9,0) opløsning. Aspirer medier og tilføje en ml krystalviolet løsning til hver brønd i 20 min.
- Vask plader ved at nedsænke dem med de godt åbninger nedad i en spids vinkel i en isspand fyldt med kontinuerligt rindendevand i vasken. Vip pladen til en vandret vinkel, når vandet, godt åbne ned, og derefter vippe tilbage til en spids vinkel, når du fjerner i en blid flydende bevægelse.
- Gentag nedsænkning 2 eller 3 gange, indtil vandet i bunden af brøndene er ikke længere blå. Energiske vasker fjerne celler eller kolonier, der er mindre klæbende grund eksperimentel indgriben, tilføjer væsentligt til fejlen i at tælle og data.
- Tørre plader natten ved at placere dem på hovedet på håndklæder på bænken top støder op til deres tilsvarende mærkede dæksler.
- Tæl Kolonier
- Tæl antallet af voksende og sovende kolonier i hver brønd efter 6 dages inkubation, farvning og tørring. Tæl kolonier optimalt ved 40X forstørrelse i et omvendt fasekontrastmikroskop. Tælle kolonier af> 30 celler som voksende og kolonier af 12 eller færre celler, med den morfologiske udseende af meget stor størrelse i forhold til voksende celler, store expanded cytoplasma med stor cytoplasma til kerne-forhold, der er vist i figur 1 7,15.
BEMÆRK: Klynger af 13-29-celler normalt ikke medregnes, da de ikke er meget hyppige i ukomplicerede hviletilstand assays. De kan tælles hvis perturbationer forskyde potentiale enten voksende eller hvilende celler vækst. Disse resultater skal derefter være korreleret med biologisk betydning.
- Tæl antallet af voksende og sovende kolonier i hver brønd efter 6 dages inkubation, farvning og tørring. Tæl kolonier optimalt ved 40X forstørrelse i et omvendt fasekontrastmikroskop. Tælle kolonier af> 30 celler som voksende og kolonier af 12 eller færre celler, med den morfologiske udseende af meget stor størrelse i forhold til voksende celler, store expanded cytoplasma med stor cytoplasma til kerne-forhold, der er vist i figur 1 7,15.
2. Klonogen Inkubering i Immunofluorescens Studies
- Juster celletal til ca. 7,500-8,000 celler / brønd i plader med 6 brønde, at svare til celleantal / overfladeareal analog med 24 brønde eksperimenter.
- Placer en rund, steril, fibronectin-overtrukne dækglas i hver brønd base af 6 brøndsplader for billeddannende undersøgelser før celle tilsætning. Pipetter celler i 3 ml volumener i hver brønd 2 brønde ad gangen ved koncentrationer skitseret, som beskrevet for klonogene forsøg ovenfor i 1.2).
- Inkuber celleri 6 dage, som ovenfor i 1.2.4 og 1.2.5. Tilføj forstyrrende faktorer på dag 3 ved 10x koncentrationer i ul bind 300, som beskrevet i koloni assayprocedurer i 1.3).
- Farv celler på dag 6 med antistoffer mod adhæsionsmolekyler celle, såsom integriner α4, α5, α6, β1, β3, f.eks fokal adhæsion komplekse molekyler FAK, paxillin og vinculin, fx proteiner involveret i motilitet, såsom α-tubulin, for eksempel signalvejen medlemmer såsom phospho-Akt, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, for eksempel, eller en hvilken som helst andet protein, som er målet for undersøgelsen for sin rolle i hviletilstand, anvendelse af standardteknikker til direkte eller indirekte immunfluorescensfarvning.
- Fjern slides med pincet dag 6. Fix i acetone / methanol 1: 1 ved -20 ° C i 20 minutter og lufttørre. En alternativ fiksativ, såsom paraformaldehyd, kan anvendes, hvis det er nødvendigt. Permeabilisere celler med 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumcitrat i 2 min feller detektion af intracellulære antigener. Vask cellerne med PBS.
- Til indirekte immunofluorecence farvning, blok slides i 1 time ved stuetemperatur med 5% BSA eller med 10% præimmunserum fra de arter, hvor det sekundære antistof blev genereret.
- Der inkuberes natten over ved 4 ° C med primære antistoffer til adhæsionsmolekyler, fokale komplekse molekyler celle, signalering pathway eller eventuelle andet protein, der er målet for undersøgelsen for sin rolle i hviletilstand fortyndet til specifikke fortyndinger anbefales af producenten i PBS 0,1% TRITON X -100.
- Vask 3 gange med PBS. Inkuber dækglas med fluorofor-konjugerede antistoffer ved stuetemperatur i 2 timer. Som et eksempel kan Alexa Fluor 488 Donkey anti-muse IgG antistof anvendes til at detektere murine monoklonale primære antistoffer. Mount dækglas celle nedad på objektglas under anvendelse af et antifade middel med Dapi. Forsegl påbudt med neglelak.
- Til direkte immunofluorescens, udføre BSAblokering som ovenfor i 2.4.2), inkuberes med fluorofor-konjugeret primært antistof natten over ved 4 ° C. Vask 3 gange med PBS. Glassene inkuberes med et antifade agent og Dapi og tætning med neglelak.
- Cover slide bakker med aluminiumsfolie og opbevares ved 4 ° C til billeddannelse og fotografering anytime op til flere uger senere. Se og fotografi celler ved hjælp af nogen fluorescens mikroskopiske billeddannende systemer, der er udstyret med et kamera på 1.000 x forstørrelse.
- For fibrillært actin-farvning, blok objektglassene i 1% bovint serumalbumin (BSA) i 30 minutter og inkuberes i BODIPY FL-phallacidin (grøn) eller rhodamin phalloidin (rød) ved stuetemperatur i 20 minutter. Tilføj et antifade agent og forsegle som ovenfor.
3. Klonogen Inkubation for Molecular Studies
- Western blots
- Inkuber ER + brystcancerceller MCF-7 eller T47D ved klonogene densiteter på 20.000 celler / 60 mm plade og 50.000 celler / 100 mm plade på fibronectin-coatede plader ved 37 ° C i 5% CO2.
- Inkuber cellerne ved lidt højere tætheder af 75.000 celler / 100 mm plade for molekylære studier kræver mg beløb for protein fra lysater. Brug op til ti plader pr eksperimentelt punkt at indsamle tilstrækkeligt protein til molekylære studier anvender Western blots eller til RNA isolering for Northern blots.
- Celletal baseret gel loading er et nødvendigt supplement til sammenligning proteinekspression i vidt forskellige størrelse voksende og hvilende celler. Indsamle celler ved trypsinbehandling og tælle en portion i et hæmocytometer i 0,2% trypanblåt til fremstilling af lysater for Western blots i stedet for afskrabning af cellerne med en enkelt kant klinge.
- Centrifuger cellerne ved 10.000 xg i 2 min, fjerne mediet ved aspiration, tilsættes 200 ul lysepuffer, sonikeres cellerne i lysepuffer og bestemme proteinkoncentrationen.
- Beregne mængden af protein per celle ved at dividere proteinudbyttet med antallet af cellerder genererede dette beløb. Indlæse lysatet i hver brønd på separate polyacrylamidgeler som repræsenterer både a) ækvivalente mængder af protein og b) protein tal, der repræsenterer ækvivalente celletal. Mindst 25 ug protein skal indlæses i hver brønd.
BEMÆRK: Dette vil muliggøre sammenligninger mellem voksende og hvilende celler, der er betydeligt forskellige i størrelse og proteinindhold (figur 1).
- Flowcytometri
- Indsamle celler fra 100 mm plader ved trypsinisering, som i 3.1 og analysere ved standard fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) under anvendelse af protokoller primær eller sekundær immunofluorescensfarvning for enten intracellulære eller ekstracellulære antigener, som skitseret i 2.4.
BEMÆRK: Aftagning celler fra vævskulturplader ved trypsinisering påvirker ikke koncentrationen af membranproteiner som bestemt ved antistof mærkning.
- Indsamle celler fra 100 mm plader ved trypsinisering, som i 3.1 og analysere ved standard fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) under anvendelse af protokoller primær eller sekundær immunofluorescensfarvning for enten intracellulære eller ekstracellulære antigener, som skitseret i 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimenter blev udført for at rekapitulere assayet. Tidsforløbet for eksperimentet er vist i figur 2A. Cellerne inkuberes ved klonogene densitet på dag -1, tilsættes FGF-2 i frisk medium på dag 0, og celler dyrkes indtil dag 6, når de farves, og kolonier tælles. Eventuelle forstyrrelser af systemet administreres på dag 3 i 100 pi volumener på 10x endelige koncentrationer ønskes. Figur 2B viser den typiske udseende voksende og sovende kolonier. Voksende kolonier indeholder> 30 celler og hvilende kolonier indeholder 12 eller færre celler, som er mange gange større end voksende celler med store cytoplasma / nucleus forhold. Figur 2C viser en typisk eksperimentelle resultat udført i fire eksemplarer. Den overvejende fordeling af celler uden tilsætning af FGF-2 er repræsenteret ved voksende kloner, mens, i nærvær af FGF-2, det store flertal af kloner er i dvale.
Indholdsproduktion "> Figur 3 er et eksempel på et eksperiment, hvor forstyrrende midler blev tilsat på dag 3. Figuren viser den dosisafhængige inhibering af hvilende kloner ved inhibering af Rho-familien af GTPaser af en pan-Rho-inhibitor C3 transferase og en Rho-kinase (ROCK) inhibitor Y27632. Assayet kan vurdere ED50 af tilsatte inhibitorer på hvilende kloner samt voksende kloner. I dette eksperiment blev virkningen på voksende kloner ikke bestemt, eftersom den kun for at illustrere metoden.Figur 4 og 5 viser, at assayet kan anvendes til at vurdere de kombinerede virkninger af inhibitorer på overlevelse af hvilende kloner. Vores tidligere undersøgelser har vist, at PI3K pathway undergår en vedvarende aktivering i hvilende celler i denne model og hæmning af både PI3K og Akt delvist inhiberer overlevelse af hvilende kloner 7. Her, indledende bemærkninger, demonstreret that uspecifik inhibering af Rho-familien af små GTPaser også delvist inhiberer overlevelse af hvilende kloner. Data præsenteret i figur 4 og 5 viser, at kombinere inhibering af PI3K og et af dets nedstrøms effektorer, AKT, med inhibering af Rho familie med C3-transferase og en ROCK inhibitor kan næsten helt eliminere overlevelsen af hvilende kloner i visse omstændigheder. Vi har tidligere vist, at hvilende kloner overlevende inhibering af PI3K, men ikke af Akt består af celler, der ikke længere udviser den hvilende fænotype, men snarere forekommer mesenchymale og nødstedte 7. Celler i hvilende kloner, hvor Rho familie er blevet bredt hæmmet af C3 transferase og ROCK inhibitor mister også den typiske hvilende udseende, antager fibrolastoid optrædener og pjusket membraner, og også synes nødstedte (figur 6). Disse eksperimenter viser en model, der kan forespørges i en meget brOAD måde at opnå en forståelse af de elementer, der styrer hviletilstand og modstandsdygtighed over for terapi.
Figur 1: mekanismer, der styrer vores in vitro hviletilstand model (A) Dyrkning og hvilende MCF-7-kloner efter 6 dages inkubation ved klonogene tæthed på fibronectincoatede plader med og uden FGF2 10 ng / ml 7 (100X forstørrelse).. (B) Resume skema skitserer de data, FGFR og integrin α5β1 parallelle steady state signalering er nødvendig for at aktivere og vedligeholde vækstdvale 7. FGF-2 opregulerer cyclin-afhængige kinaseinhibitorer resulterer i G1 arrest 21, aktiverer ERK 8 og PI3 kinase 7, som initiatesurvival signalering og opregulere integrin α5β1 7, som når steady state efter flere dage. Dual signalering through FGFR gennem PI3K og uafhængigt gennem ligering af integrin α5β1 ved fibronectin er nødvendige for aktivering af FAK og membran lokalisering og aktivering af RhoA GAP GRAF 15. Dette resulterer i inaktivering af RhoA og en eftergivende steady state for kortikal omlægning af F-actin (phalloidin-farvet mikrofotografi), epitelial re-differentiering og vækstdvale 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Elementer af in vitro hviletilstand assay (A) Skematisk af de tidsmæssige komponenter i hviletilstand assay.. Celler inkuberes på fibronectin belagte vævskulturplader ved klonogene tæthed, ved en maksimal tæthed på 1.500 celler / brønd på en plade med 24 brønde i et incubator ved 37 ° C og 5% CO2 på dag 1. Mediet udskiftes på dag 0 med frisk medium eller frisk medium indeholdende FGF-2 10 ng / ml og cellerne inkuberet igen. Celler farves med krystalviolet løsning, som beskrevet, på dag 6. Eventuelle inhibitorer eller forstyrrelse agenser tilføjes på dag 3 i 100 l gl på 10x ønskede koncentrationer og cellerne igen inkuberes indtil dag 6. (B) Fremkomsten af farvede voksende og hvilende MCF-7-kolonier. Voksende kolonier indeholder> 30 celler og hvilende kolonier indeholder 12 eller færre celler. Hvilende celler er pandekage formet, mange gange større end voksende celler med store cytoplasma / nucleus nøgletal. (100X forstørrelse). (C) Graf demonstrere klonogene potentiale på 1.500 MCF-7 brystcancerceller humane inkuberet med og uden FGF-2 10 ng / ml på fibronectin-overtrukne plader med 24 brønde. Uden FGF-2 er den overvejende fordeling af celler repræsenteret af voksende kloner mens i nærvær af FGF- 2 langt størstedelen af kloner er i dvale. Eksperimenter blev udført i fire eksemplarer. (Fejl barer + SD)
Figur 3: Dosisafhængig inhibering af hvilende kloner ved pan-Rho familie inhibitorer C3 transferase og ROCK inhibitor Y27632 T-47D-celler blev inkuberet ved den klonogene densitet på 1.000 celler per brønd på 24 godt fibronectin-coatede plader med FGF-2. 10 ng / ml i 6 dage. Medier, C3 transferase 3 eller 5 ug / ml, og ROCK inhibitor Y27632 0,1, 1 eller 10 ug / ml var på dag 3 og hvilende kloner blev talt på dag 6. Grafen viser en dosisafhængig hæmning af farvede hvilende kloner på dag 6. ED50 C3 var ca. 3 ug / ml, mens den for ROCK inhibitor var mellem 1 og 10 um i dette assay. Eksperimenter blev udført i fire eksemplarer. (Fejl barer + SD)
Figur 4:. Kombinerede virkninger af pan-Rho familie inhibitor C3 med en Akt inhibitor eller med en PI3 kinase inhibitor på overlevelse af hvilende T-47D-kloner T-47D-celler blev inkuberet ved den klonogene densitet på 1.000 celler per brønd på 24 brønds fibronectin overtrukne plader med FGF-2 10 ng / ml i 6 dage. Medier, C3 transferase 5 ug / ml, Akt inhibitor 25 pM og LY294002 20 uM blev tilsat enkeltvis eller sammen på dag 3 og hvilende kloner blev talt på dag 6. Den samlede virkning af C3 og AKT inhibitoren synes at være additiv ved disse koncentrationer, men den kombinerede effekt af C3 og PI3K-inhibitoren synes at være synergistisk i disse forsøg med hæmning af hvilende klon overlevelse. Eksperimenter blev udført i fire eksemplarer. (Fejl barer + SD)
= "Figur 5" src = "/ files / ftp_upload / 52672 / 52672fig5.jpg" />
Figur 5:. Kombinerede virkninger af ROCK inhibitor Y27632 med en Akt inhibitor eller med en PI3 kinase inhibitor på overlevelse af hvilende T-47D-kloner T-47D-celler blev inkuberet ved den klonogene densitet på 1.000 celler per brønd på 24 godt fibronectin-coatede plader med FGF-2 10 ng / ml i 6 dage. Medier, ROCK inhibitor Y27632 3 ug / ml, Akt inhibitor 25 pM og LY294002 20 uM blev tilsat individuelt eller i kombination på dag 3 og hvilende kloner blev talt på dag 6. Den samlede virkning af Y27632 og AKT inhibitoren ikke synes at være additiv ved disse koncentrationer, men den kombinerede effekt af Y27632 og PI3K-inhibitoren forekommer mere end additiv i disse forsøg med hæmning af hvilende klon overlevelse. Eksperimenter blev udført i fire eksemplarer. (Fejl barer + SD)
.jpg "/>
Figur 6:. Udseendet af overlevende hvilende T-47D-kloner efter behandling med C3 transferase og ROCK inhibitor Y27632 Colony assays blev etableret i fire eksemplarer i 24 brønd fibronectin overtrukne vævskulturplader ved 1.000 celler / brønd med FGF-2, som beskrevet, inhibitorer blev sat på dag 3 ved de koncentrationer, der er vist, blev cellerne farvet og fotograferet på dag 6. Celler behandlet med pan-Rho familie hæmmere mistede deres spredning udseende, blev små, dendritiske og optrådte bedrøvet. (100X forstørrelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores model består af flere centrale elementer i vækstdvale i knoglemarven. Den består af estrogen sensitive celler, som er den type, forventes at forblive hvilende i marven i længere perioder 10 består det af fibronectin, et centralt strukturelt element af marv, FGF-2, en vækstfaktor rigeligt syntetiseret ved knoglemarvsstroma og stærkt deponeret i den ekstracellulære matrix af knoglemarven 31,32 og inkubation af celler ved klonogen tæthed, hvor deres interaktion primært med underlaget. Mens knoglemarvens mikromiljø er langt mere kompleks, kan denne simple system opbygges med så meget ekstra kompleksitet efter behov for at stille specifikke mekanistiske spørgsmål.
Modellen kan anvendes til at sammenligne hvilende med voksende celler i en række måder, herunder celle-biologiske teknikker, molekylære teknikker og in vivo teknikker. Cellulære fænotyper kan analyseres ved re-kloning, motilitetog invasion studies 35, nonadhærente tumorfremkaldende spherule dannelse 36 eller ved funktionelle undersøgelser for interaktion med mikromiljø hjælp bestemte blokerende antistoffer eller peptider 7.
Den primære output klongenicitetsassayet er en numerisk tælling af kolonier, enten voksende eller hvilende, hvilket svarer til den voksende eller hvilende klonogen potentiale af cellerne. Som antydet ovenfor er en lang række variabler har potentiale til at påvirke dette resultat, som alle skal kontrolleres så strengt som muligt til opnåelse af reproducerbare resultater. Disse omfatter kilden til celler, samlet passagenummer, kryopræservering teknik og kvaliteten af de cellekulturer, der var kryopræserveret, antallet af passager siden optøning, sammenløbet af kulturer, hvorfra enkeltcelle-præparater blev opnået, kilden og kvaliteten af føtalt kalveserum, varigheden af trypsinbehandling og deres reproducerbarhed, varighedenaf celler efterladt ved stuetemperatur, fingerfærdighed af pipettering ækvivalente celletal i hver brønd, fingerfærdighed eller jævn fordeling celler over hele overfladearealet af en brønd, hvor mange gange en plade fjernes fra inkubatoren til observation, blandt snesevis af andre. Ud over at repræsentere almindeligt anerkendte vævskultur kvalitetskontrol, disse variabler påvirker hvilende klonogen potentiale fra eksperiment til eksperiment. Intra-eksperimentel variabilitet er typisk mindre end 8-10%, imidlertid resulterer i procentvise ændringer fra eksperiment til eksperiment, der er meget reproducerbar. Typisk er variansen af data begynder at falde med en direkte korrelation med forøget oplevelse af forsøgslederen med systemet og den tid udførelse af dette assay.
Genekspression i hvilende og voksende celler kan vurderes ved RT-PCR, Northern blot, Western blot, immunfældning / Western og funktionelle kompleks udfældning / Western, Immunofluorescens eller immunhistokemi, multiplexing ved mikrofluidik, Raman spektroskopi, flowcytometri og andre teknikker. Disse teknikker kan anvendes til at bestemme roller specifikke receptorer, andre membranproteiner, signalveje, transkriptionsfaktorer, histon modifikatorer, organeller og mitokondrielle proteiner, metaboliske veje og energiudnyttelse, spænding og kraft og interaktion med mikromiljøet på utallige måder på rolle vækstdvale.
Vores tidligere undersøgelser har vist betydelige roller for de PI3K veje i overlevelse af hvilende kloner 7 samt i at opretholde den hvilende fænotype med epitelial fordeling af kortikal actin 15. Vi demonstrerede også, at RhoA specifikt skal spærres, for at hvilende fænotype skal aktiveres. Dette er i modsætning til de data, som præsenteres her, hvor inaktivering af Rho familie med pan-hæmmere formindsker overlevelse af hvilende kloner. Thans understregninger den fare for at bruge kemiske inhibitorer at dissekere mekanismer og behovet for at bruge genetiske metoder til at hæmme eller aktivere specifikke veje. Til dette formål metoden egner sig til genetisk manipulation af cellerne, enten ved permanent transfektion eller transduktion eller ved transient transfektion 15, siRNA eller nanopartikler. Eftersom assayet er 6 dage i varighed, transient genekspression eller forstyrrer det vil resultere i betydelige fænotypiske virkninger efter 6 dage, kan måles.
Erkender sit potentiale for at studere mekanismer indtastning samt spændende dvale, er vi i øjeblikket undersøger mekanismer for disse celler at undslippe vækstdvale. Mens du indtaster vækstdvale er dårligt forstået, en forståelse af de mekanismer, der styrer udgangen fra sovende tilstand er endnu mere undvigende. Vi har rapporteret foreløbige bemærkninger, at inflammatoriske reaktioner fra tilskadekomne stroma kan bidrage til genopvågnen af dormant MCF-7 celler ved hjælp af denne model 37. Modellen kan anvendes til T-47-celler samt, en anden ER + brystkræft-cellelinie. Mens ER- celler ikke bliver hvilende som reaktion på FGF-2, kan det være muligt at tilpasse metoden til andre kræft celletyper med forskellige differentiering agenter i fremtidige undersøgelser.
Trods en meget nyttig teknik til identificering nøglemekanisme involveret i hviletilstand, er det stadig en in vitro model. Imidlertid kan celler, der har undergået hviletilstand eller in vitro manipulation testes for xenograft tumor dannelse kapacitet. Den største potentielle fordel af systemet, er imidlertid at identificere mekanismer, der vil tillade udviklingen af en hypotese, der kan testes i meget komplekse in vivo hviletilstand modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Støttet af Institut for Defense Grants DAMD17-01-C-0343 og DAMD17-03-1-0524, New Jersey State Kommissionen om Cancer Research 02-1140-CCR-E0 og Ruth Estrin Goldberg Memorial for Cancer Research (RW)
Acknowledgments
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).
