Abstract
trouble de consommation d'alcool (AUD) est un grave problème de santé. Malgré une forte composante héréditaire à AUD, quelques gènes ont été clairement mis en cause dans leur étiologie. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un modèle puissant pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents génétique des comportements liés à l'alcool et détient donc une grande promesse pour l'identification et la compréhension de la fonction des gènes qui influencent AUD. L'utilisation du modèle de Drosophila pour ces types d'études dépend de la disponibilité de dosages qui mesurent de façon fiable les réponses comportementales de l'éthanol. Ce rapport décrit un dosage approprié pour évaluer la sensibilité de l'éthanol et de la tolérance rapide de mouches. la sensibilité à l'éthanol mesurée dans ce dosage est influencé par le volume et la concentration d'éthanol utilisé, une variété de manipulations génétiques signalés précédemment, et également la durée de vol sont logés sans nourriture immédiatement avant l'essai. En revanche, l'éthanol sensitivity mesurée dans ce dosage ne est pas affectée par la manipulation de la vigueur à la mouche, sexe du vol, et de suppléments de milieu de croissance avec des antibiotiques ou des levures vivantes. Trois méthodes différentes pour quantifier la sensibilité de l'éthanol sont décrits, tous conduisant à des résultats de sensibilité d'éthanol essentiellement indiscernables. La nature évolutive de ce test, combiné avec sa simplicité globale de set-up et relativement faible coût, le rendent approprié pour petits et grands analyse génétique à grande échelle de la sensibilité de l'éthanol et de la tolérance rapide chez la drosophile.
Introduction
trouble de consommation d'alcool (AUD) est un problème de santé dans le monde énorme (examiné en 1). Bien que les mécanismes favorisant le développement de AUD sont complexes, ces troubles ont une composante génétique importante (par exemple, 2). La grande héritabilité de l'AUD et les réponses comportementales conservés à l'éthanol dans de nombreuses espèces (3,4) examinés en ont généré un vif intérêt dans l'utilisation des organismes modèles génétiques pour enquêter sur l'implication de gènes spécifiques dans les comportements liés à l'éthanol vers une meilleure compréhension de la base moléculaire de AUD. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a émergé comme un organisme modèle leader pour explorer les mécanismes moléculaires génétique de comportements liés à l'éthanol (examinés dans 3,4). Des études ont mis en évidence chez les mouches rôles pendant plusieurs voies de signalisation dans les réponses comportementales à l'éthanol (examinés dans cinq). Curieusement, certains des gènes et les voies qui influencent responsab comportementaleses à l'éthanol dans les mouches ont également été impliqués dans les comportements liés à l'éthanol rongeurs et / ou AUD humain (par exemple, 6-14). La conservation des mécanismes de conduire les comportements liés à l'éthanol à travers les espèces, couplés avec la suite d'outils génétiques disponibles dans le système de modèle de drosophile, soulignent l'utilité du modèle de la mouche des fruits pour étudier la génétique des réponses comportementales à l'éthanol.
Sensibilité 15,16 et la tolérance (revue dans 17) à l'éthanol chez l'homme est lié au développement de AUD. Ces deux réponses comportementales à l'éthanol peut être modélisée en vol via une variété de tests de laboratoire (revue dans 3,4). Tous les tests de mouches connues des auteurs sont fondés sur des dépendant du temps induite par l'éthanol sédation / incoordination ou la récupération en fonction du temps à partir d'éthanol sédation.
Dans un précédent article de notre groupe sur la génétique de la sensibilité à l'éthanol et rla tolérance de apid chez la drosophile, un test de comportement à base d'éthanol sédation induite vapeur de mouches a été utilisé 18. Les tests dans ce dosage a été initié en transférant adulte vivant vole sans anesthésie pour vider des flacons de produits alimentaires, le piégeage des mouches dans les flacons avec un bouchon en acétate de cellulose, l'addition d'éthanol à la partie supérieure (c.-à-face non volantes) de la bougie d'acétate de cellulose, et sceller le flacon contenant les mouches, bouchon en acétate de cellulose et de l'éthanol avec un bouchon de silicone (voir schéma de la figure S3, référence 18). Plusieurs flacons représentant différents groupes de mouches ont été évalués en parallèle, augmenter le débit de cet essai. Les flacons ont été donnés un code anonyme et expérimentateurs ont été aveuglés au groupe de traitement pour prévenir biais involontaire dans l'évaluation de la sédation. Dans une expérience standard, les mouches dans des flacons ont été frappa doucement à intervalles de 6 min et, après une récupération de 30 secondes, le nombre de mouches sous sédation dans chaque flacon a été compté et converted pour cent vol actives. Les mouches absorbés vapeur d'éthanol à partir de la prise d'acétate de cellulose de façon dépendante du temps, entraînant des augmentations progressives dans l'éthanol interne 18 et la sédation (cf de référence 18 et la figure 1A et 1B dans ce rapport). Sédation dans cet essai a été opérationnel défini comme mouches (i) permanent en l'absence de la marche ou (ii) couché sur le dos avec ou sans battant des ailes. Ici, ce dosage de la sédation de l'éthanol est décrite en détail, outre l'optimisation opérationnelle pertinente à l'utilisation, il est prévu, et le test est utilisé pour traiter la contribution d'options de supplémentation alimentaire sur la sensibilité mouche de sédation.
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Protocol
1. Jour avant le test
- Recueillir les mouches dans des flacons de produits frais dans des groupes de 11 (même sexe) sous brève (1-5 min) CO 2.
- Permettre aux mouches de récupérer O / N dans des flacons de produits alimentaires dans un espace à environnement contrôlé (généralement 25 ° C, 60% d'humidité relative, 12 h cycle lumière / obscurité).
- Préparer la solution (s) de l'éthanol en diluant pur (100%) dans de l'éthanol purifié (≥18 MQ) de l'eau à la concentration finale (s) approprié à l'essai prévu. Laisser la solution (s) pour revenir à RT O / N.
Remarque: La dilution de l'éthanol est exothermique.
2. jour de l'analyse
- Pour chaque flacon de mouches à tester, préparer (i) un endroit propre, vide alimentaire flacon; ce est à dire, les tests flacon, (ii) une nouvelle fiche d'acétate de cellulose, (iii) un bouchon en silicone et (iv) 1 ml de solution d'éthanol (voir le tableau 3).
- Préparer chambre d'essai en ajustant la température à 20-25 ° C et une humidité relative de 55-65%.
- Avoir un autre travailleurattribuer un code unique à chaque groupe de flacons et d'enregistrer le code pour plus tard. Placez flacons codés avec des mouches dans la salle de test pour se acclimater pendant quelques minutes.
- Étiqueter les flacons d'essai vides pour correspondre codes sur les flacons de mouches de 2,3.
- Construire un disque journal de test de copie en introduisant les codes dans les colonnes (une colonne / flacon) dans une feuille de calcul semblable au tableau 1.
- Utilisation du journal de test comme un guide, organiser des flacons alimentaires codés avec des mouches et des flacons d'essai vides en correspondant à des tableaux dans la salle d'examen.
Remarque: Un nombre maximum raisonnable de flacons à tester est 24 (ce est à dire, six séries de quatre flacons chacun). - Transfert d'oiseau de flacons d'aliments dans appariés flacons d'essai vide / étiquetés et insérer immédiatement cellulose bouchons d'acétate dans des flacons d'essai jusqu'à ce que la cellulose d'acétate bouchons sont 2 cm en dessous de la cime des flacons.
- Ci-après, traiter chaque rangée de quatre flacons comme un ensemble au quinconce des intervalles de 1 min.
- Pour l'évaluation du temps 0, saisir chaque flacon individuellement wième pouce et l'index, appuyez doucement sur la table trois fois pour frapper les mouches au fond du flacon, attendez 30 secondes puis de compter le nombre de mouches qui sont immobiles / morts. Notez le nombre de mouches immobiles / morts pour chaque flacon au temps 0 min dans le journal de test papier.
- Commencez minuterie compter en continu au temps 0 et commencer immédiatement ajoutant 1 ml d'éthanol à la cellulose d'acétate bouchons dans les flacons pour la première ligne / ensemble de 4 flacons. Ajouter 1 ml d'éthanol aux bougies d'acétate de cellulose dans les flacons à intervalles de 5 secondes dans l'ordre où elles seront testés. Ajouter de l'éthanol pour les bouchons d'acétate de cellulose dans un mouvement circulaire de sorte que l'éthanol est absorbé uniformément dans les bouchons d'acétate de cellulose. Lorsque l'éthanol a été ajouté à tous les quatre flacons d'essai dans le jeu, insérez un bouchon de silicone dans chaque flacon pour le sceller.
- Parfois, 1, 2, 3, 4 et 5 min, ajouter 1 ml d'éthanol à la seconde, troisième, quatrième, cinquième et ensembles de quatre flacons sixième, respectivement. Continuer introduction de bouchons en silicone aprèsajouter de l'éthanol à chaque jeu de quatre flacons.
- Au moment de 6 min, tester la première série de quatre flacons en saisissant chaque flacon avec le pouce et l'index, tapotant doucement sur la table trois fois pour frapper les mouches au fond du flacon, en attendant 30 secondes, puis en comptant et en enregistrant le nombre total de mouches qui sont sous sédation. Score vole comme sédatif se ils (i) se tiennent sur le plancher de la fiole, mais ne marchent pas ou (ii) se trouvent sur le dos avec ou sans battant des ailes.
- Tenez chaque flacon dans l'ensemble à intervalles de 5 secondes en utilisant le calendrier dans le tableau 2.
- Parfois, 7, 8, 9, 10 et 11 min, de tester les deuxième, troisième, quatrième, cinquième et sixième ensembles de fioles, respectivement, comme cela se fait pour le premier ensemble.
- Au moment 12 min, tester la première série de quatre flacons à nouveau comme décrit dans 2.12 et continuer à tester les deuxième, troisième, quatrième, ensembles, cinquième et sixième de flacons à 13, 14, 15, 16 et 17 minutes, respectivement.
- Continuer essai mouches comme décrit dans 2.12 jusqu'à ce que toutes les mouches sont sedated.
- Entrez le nombre total de mouches dans chaque flacon dans le disque journal de test de copie. Censurer mouches immobiles / morts au temps 0 à partir du nombre total de mouches.
- Calculer le pourcentage mouches actifs à chaque évaluation point dans le temps et que les données des placettes% mouches actifs (axe des ordonnées) en fonction du temps (axe des x). Quantifier éthanol sédation par interpolation sédation Durée 50 valeurs (ST50, le temps de 50% la sédation) du troisième ordre courbe polynomiale ou sigmoïde se adapte ou calculer l'aire sous la courbe.
- Compiler les données décodées de flacons et effectuer des analyses statistiques (par exemple, une analyse de la variance avec Bonferroni test de comparaison multiple) en fonction de la conception expérimentale.
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Representative Results
Les données brutes à partir de ce dosage de l'éthanol sédation est le nombre de mouches qui sont sédation en fonction de la vapeur d'éthanol temps d'exposition. Les données brutes sont converties au pourcentage vol actif en fonction du temps (données primaires, les figures 1A, B, D - F). Sensibilité à la sédation éthanol à partir des données primaires peut être quantifiée comme sédation Temps 50 (ST50), le temps nécessaire pour 50% des mouches pour devenir sous sédation ou AEA sous la courbe (AUC), par interpolation de la courbe se adapte. Auparavant rapporté 18 troisième ordre courbes polynomiales correspondent aux données primaires bien que prévu (moyenne R 2 = 0,934, n = 24, figure 1A), bien que les courbes sigmoïdales correspondent aux données primaires un peu mieux (de moyenne R 2 = 0,997, n = 24; Figure 1B). Comme alternative à la détermination de valeurs de ST50 à partir de la courbe unique, la sensibilité de l'éthanol sédation à partir des données primaires peut également être quantifiée en tant que zonesous la courbe (AUC,% vol Active X temps) (figure 1C). Les résultats de ces trois méthodes de quantification corrélation extrêmement bien avec l'autre (Pearson r 2 ≥0.998, n = 24) et sont essentiellement indiscernables (figure 1C), bien que les unités sont nécessairement différentes pour ST50 (min) et l'ASC (% actif mouches x temps). Les détails concernant tous les calculs, des feuilles de calcul utilisées, etc. sont disponibles auprès de l'auteur correspondant. Notez que les valeurs supérieures et inférieures de ST50 (ou SSC) indiquent émoussés et une sensibilité accrue à l'éthanol sédation, respectivement. Par souci de cohérence avec le rapport précédent 18, les valeurs de ST50 dérivés de troisième ordre unique de la courbe polynomiale ont été utilisés tout au long du reste de cette study.Importantly, le test détecte les effets de l'ARNi contre Cnx14D (figure 1D) et des mutations dans scb (figure 1E) , Aru et Hppy (figure 1F),
Au cours de l'utilisation systématique de cet essai, le taraudage de flacons avec des bouchons d'acétate de cellulose en contact avec 2 ml d'éthanol a provoqué l'acétate de cellulose se branche à se déplacer vers le fond de certains flacons dans quelques expériences individuelles (non représentés), ainsi potentiellement changeant libre "vol l'espace et la concentration de vapeur d'éthanol. En outre, environ 0,25 ml d'éthanol atteint le fond (du côté voler) des bouchons d'acétate de cellulose quand ils ont été mouillés avec 2 ml d'éthanol (figure 2A), ce qui soulève la possibilité opérant dans ces essais ont été exposés à l'éthanol liquide en plus de l'éthanol en phase vapeur. La diminution du volume d'éthanol dans le bouchon en acétate de cellulose à partir de 2 ml à 1 ml éliminé la migration vers le bas des cellulose bouchons d'acétate au cours de l'essai, même après vigoureuse taraudage (non représenté) et également éliminé des quantités mesurables d'une solution d'éthanol sur le fond des bouchons d'acétate de cellulose (figure 2A). Sédation de vol est sensible au volume d'éthanol utilisé même avec un volume inférieur à 1 ml (Figure 1A - C). Utilisation de 1 ml d'éthanol donc permet de maintenir un espace libre pour les mouches constante au cours de l'essai et se assure que de l'éthanol liquide est pas ingérée. Les mouches sont donc vraisemblablement exposées à l'éthanol uniquement sous forme de vapeur dans cet essai. Un ml de 85% d'éthanol (ce est à dire, de la vapeur à partir de 1 ml de 85% (vol / vol) d'éthanol) et de 1 à 5 jours vieux w [A] mouches ont été utilisés dans toutes les études ultérieures rapportées ici, sauf indication contraire.
Dans les expériences avec 24 flacons, les mouches sont exploitées doucement à intervalles de 6 min pour permettre à l'expérimentateur d'évaluer (ce est à dire, faire défiler) sur tous les flacons, un Schedul raisonnable prescritee. ST50s des études avec des mouches de commande en utilisant moins de flacons et les intervalles de 5 minutes étaient comparables à ST50s études avec des intervalles de 6 min (données non présentées). Les mouches sont évalués pour la sédation 30 secondes après avoir appuyé pour laisser le temps de l'expérimentateur à exploiter un ensemble de quatre flacons dans l'ordre avant de déterminer l'état de sédation des mouches dans chaque flacon. Pour déterminer si les différences de taraudage vigueur ou le temps de récupération après avoir tapé la sédation sensibilité l'impact de l'éthanol, les valeurs de ST50 en mâles et femelles mouches de contrôle ont été mesurées tout en étant exploité normalement (régulier) ou très forte (Hard) et après un 30 sec standard ou plus 60 sec la récupération. Exploiter la vigueur (figure 2B) et le temps de récupération (figure 2C) n'a eu aucun effet mesurable sur les valeurs de ST50 chez les mâles ou les femelles témoins.
Les antibiotiques peuvent être utilisés pour supprimer la croissance bactérienne dans un milieu de nourriture de mouche. Pour déterminer si la supplémentation du milieu avec des antibiotiques alimentaire affecte éthanol sédation sensibilité,ST50 valeurs ont été mesurées dans les mouches élevés pour une génération en présence ou en l'absence de trois antibiotiques (ampicilline 100 pg / ml; tetracycline, 20 pg / ml; chloramphenicol, 125 ug / ml). Mouches d'élevage sur ces trois antibiotiques ne ont aucun effet sur l'éthanol sédation sensibilité (Figure 2D).
Les mouches sont transférés à des flacons vides alimentaires et sont donc privés de nourriture et d'eau pendant ~ 5 min-immédiatement avant d'être exposé à la vapeur d'éthanol dans l'essai de la sédation. Pour déterminer si la quantité de mouches de temps sont conservées dans des flacons vides de nourriture avant de lancer la sédation sensibilité impacts de dosage de l'éthanol, les mouches ont été affamés pendant 6 heures (au moins 70 fois la normale), puis les valeurs de ST50 ont été mesurés. La famine pendant 6 heures a diminué significativement dans les deux ST50s mouches de contrôle mâles et femelles (figure 2E). Bien que l'effet de la famine sur ST50 était relativement faible (9-14% dans ces expériences), la quantité de temps vole SPEe dans des flacons vides avant d'être exposée à la vapeur d'éthanol dans l'essai devraient être tenus uniforme d'un groupe au sein d'une expérience et aussi entre les expériences.
Laboratoire mouche alimentaire peut être complétée avec de la levure en direct (par exemple, 18,20,23,24) pour promouvoir la production de la progéniture. Par exemple, les flacons alimentaires complétées par des levures vivantes (Saccharomyces cerevisiae) produit adultes plus tôt que ceux avec de la levure tué par la chaleur ou pas de levures vivantes (comparer d10-d11, barres blanches, figure 3A), bien que le nombre total de descendants a produit plus de 20 jours était impossible à distinguer dans des flacons complétées par les levures vivantes et tuées par la chaleur (figure 3A). Pour faire face à la possibilité que les levures vivantes, produisent des quantités significatives de l'éthanol sur les aliments à la mouche, les effets de la levure vivante (i) d'éthanol dans le milieu alimentaire, (ii) de l'éthanol en vol, et (iii) la sensibilité de l'éthanol de la sédation chez les mouches ont été mesurés. milieu alimentaire complétée par sous levures vivantes contenuesStantial quantités d'éthanol par rapport à l'alimentation additionné de levure tué par la chaleur ou non (figure 3B). Néanmoins, les mouches de contrôle cultivés sur un milieu supplémenté avec direct, pas de levure tuées ou non distincte eu de faibles concentrations d'éthanol interne (figure 3C). En outre, la sensibilité de la sédation éthanol ne se distinguait pas de mouches de contrôle cultivés sur milieu additionné de tués par la chaleur ou de levures vivantes (Figure 3D).
Figure 1. (AC) dosage de sédation options d'analyse de données. Contrôle w [A] femelles (w 1118 isogénique, Bloomington Indiana Drosophila Stock Center stock # 5905) ont été exposés à la vapeur à partir des volumes de 85% (vol / vol) éthanol indiquées. Données (A) Sédation temps-cours se adaptent avec troisième polynômes d'ordre. (B)Données sédation temps-cours correspondent aux courbes sigmoïdes. (C) Éthanol sédation sensibilité quantifiée comme (axe de gauche) valeurs ST50 interpolées à partir du troisième ordre polynômes et courbes sigmoïdes ou zone (Y-axe de droite) sous la courbe (AUC,% mouches Active X temps). volume d'éthanol, mais pas méthode d'analyse, la sensibilité à l'éthanol impacté (ANOVA à deux voies; effet de volume, p <0,0001; effet de la méthode d'analyse, ns; données AUC transformées 1/100 pour tenir compte de la différence; n = 8 / groupe grandeur des valeurs). (DF) des données représentant le temps de cours. (D) Expression de Cnx14D ARNi dans le système nerveux (elav-Gal4 / v5597) émoussé éthanol sensibilité par rapport aux témoins (v5597 / + et elav-Gal4 / + ). (E et F) Mutation de s cb (SCB Vol2) et aru (aru 8,128) éthanol amélioré la sensibilité de la sédation et la mutation des Hppy (HppyKG5537) émoussé la sensibilité de la sédation éthanol par rapport aux témoins. Les données contenues dans EF ont déjà été signalés comme des valeurs ST50 18.
Figure 2. L'évaluation de paramètres de fonctionnement dans le dosage de la sédation. (A) quantité d'éthanol dans le fond 2 mm de bouchons d'acétate de cellulose. Le volume d'éthanol ajouté au sommet de cellulose bouchons d'acétate eu un effet significatif sur le volume d'éthanol qui se est déplacé dans le fond 2 mm de bouchons d'acétate de cellulose au cours d'une expérience de 60 min maquette (une ANOVA, p <0,0001; * Bonferroni Test de comparaison multiple, 2 ml vs 0 et 1 ml, p <0,05 n = 4). L'éthanol a été quantifiée comme un changement de masse des bouchons d'acétate de cellulose. (B) Ni la vigueur de taper les flacons pendant l'essai (régulier, Hard) ni le sexe des mouches testé ST50s touchés (deux way ANOVA; effet de taraudage, ns; effet de sexe, ns; n = 12) (C) Ni le temps de récupération après avoir tapé ni le sexe des effets significatifs sur ST50s (Two-Way ANOVA;. effet de temps de récupération, ns; effet du sexe, ns;. n = 6) (D) inclusion d'antibiotiques (ATC; ampicilline, la tétracycline et chloramphénicol) dans le milieu de croissance ne avaient aucun effet global sur ST50s, mais il y avait un effet du sexe sur ST50 (ANOVA à deux voies; effet de l'ATC, ns; effet du sexe, p = 0,001; interaction , ns;. n = 6) (E) Effet de la famine sur la sensibilité à l'éthanol de la sédation. ST50s étaient significativement plus faible chez les mouches privées de nourriture et d'eau pendant 6 heures (Starved) par rapport à normalement alimenté (Fed) vole; ST50s chez les mâles et les femelles étaient indiscernables globale (ANOVA à deux voies; effet de la famine, p <0,0001; effet du sexe, ns; n = 12; * Bonferroni multiples tests de comparaison, l'effet de la famine chez les mâles et les femelles, p <0,05) .
Figure 3. Effet de la levure en direct sur la croissance, la teneur en éthanol et la sensibilité de la sédation. (A) progéniture adulte à partir de flacons contenant le milieu alimentaire supplémenté sans levure (Non Y), la levure de chaleur tué (Tué Y) ou de la levure en direct (Live Y). Les barres blanches, descendance adultes émergent pendant les jours de 10 à 11; barres grises, 12-20 jours. Globalement, le traitement de levure a eu un effet significatif sur la production de la descendance (une analyse de variance; tous (10-20) jours, p <0,0001; 10-11 jours, p <0,0001; 12-20 jours, p = 0,0002; n = 5 ). Nombre total de descendants produits durant toutes (10-20) jour était supérieur de flacons avec Tué Y et Y vivre que No Y (test de comparaison multiple de Bonferroni, p <0,05). Pendant les jours de 10 à 11, les flacons avec Live Y ont produit plus de descendance tués Y et flacons avec Tué Y ont produit plus de descendance Non Y (barres blanches, tests de comparaison multiple de Bonferroni, p <0,05). Pendant les jours de 12 à 20, les flacons wie Killed Y a produit plus progéniture de flacons de n Y ou en direct Y (barres grises, Bonferroni test de comparaisons multiples, p <0,05). (B) d'éthanol dans le milieu alimentaire était significativement plus élevée dans des flacons supplémenté avec Live Y par rapport aux flacons de n Y et tué Y (une ANOVA, p <0,0001, n = 5; Bonferroni test de comparaison multiple, p <0,05) (C) éthanol interne en W [A] mouches femelles ne ont pas été significativement affectés par la supplémentation avec de la levure (de une. -way ANOVA, ns, n = 5-10). Teneur en éthanol en B et C déterminée comme décrit 18 (D) valeurs ST50 ne ont pas été significativement affectés par la supplémentation du milieu de croissance avec de la levure en mâle ou femelle w [A] (ANOVA à deux voies;. effet de la levure, ns; effet du sexe, ns; n = 12).
| flacon → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Code → | ||||||||
| # total → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 min | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tableau 1: journal de test typique. Voir le protocole étape 2.5.
| Ampoule | Robinet | Évaluer |
| 1 | 6 min 0 sec | 6 min 30 sec |
| 2 | 6 min 5 sec | 6 min 35 sec |
| 3 | 6 min 10 sec | 6 min 40 sec |
| 4 | 6 min 15 sec | 6 min 45 sec |
Tableau 2:. Taraudage typique et le calendrier d'essai Voir protocole étape 2.13.
| Nom du Matériel / Equipement | Société | Numéro de catalogue | Commentaires / Description |
| flacons alimentaires | VWR | 89092-772 | étroit |
| Flugs | Genesee / Flystuff.com | 49-102 | étroit |
| bouchon de silicone | Fisher Scientific | 09-704-1l | N ° 4 |
| éthanol | Pharmaco-AAPER | 111000200 | 200 proof |
Tableau 3: Matériaux.
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Discussion
Tests simples qui quantifient de manière reproductible phénotypes significatives sont d'une grande valeur pour l'analyse du comportement. Les travaux décrits ici traite de plusieurs aspects pratiques d'un test pour mesurer la sensibilité de l'éthanol de sédation et la tolérance rapide chez la drosophile. Bien que pas un objectif de ce travail, des analyses comportementales sont facilitées par le maintien de l'environnement et génétique constante de fond pour les sujets de test dans une étude. De plus, les comparaisons doivent généralement être effectués entre des groupes de mouches élevées et testés côte à côte. À cette fin, toutes les mouches dans les expériences individuelles dans ce travail avaient le même fond génétique et ont été élevés côte à côte dans des conditions environnementales uniformes (25 ° C, l'humidité relative de 60%, 12 h cycle lumière / obscurité) avec le milieu de la nourriture standard (10 % de saccharose, 3,3% de farine de maïs, 2% de levure et 1% de gélose) à l'exception des expériences dans lesquelles le support d'aliments a été explicitement manipulé.
Le ethanol test de sédation décrit ici ne nécessite que très peu de matériaux (plastiques, les bouchons des flacons d'acétate de cellulose, de bouchons en silicone et éthanol), qui sont tous peu coûteux et facilement disponibles auprès de sources commerciales (tableau 3). Ce test éthanol de sédation est similaire à et dans une large mesure basé sur des méthodes précédemment rapportés (par exemple, 6,20,25-27, globalement évalués 3,28). Bien que tous ces tests ont une utilité pour mesurer l'éthanol sédation sensibilité, les avantages de l'analyse décrite ici comprennent (i) les mouches ne sont pas exposés à l'éthanol liquide pendant l'essai, (ii) la possibilité réduite qui vole peut se emmêler dans le coton ou autre matériau dans le flacon d'essai pendant le test, (iii) la possibilité de tester de nombreux groupes de vol en parallèle, et (iv) trois options pour la quantification objective de la sensibilité à l'éthanol à partir de jeux de données primaires. Ensemble, ces avantages éliminer largement la possibilité qui vole boisson éthanol, that éthanol pourrait mouiller les surfaces externes de mouches, inhibant ainsi leurs capacités globales de l'appareil locomoteur, et que la performance de mouches dans l'essai pourrait être confondu par les difficultés associées aux matériaux d'enchevêtrement dans l'environnement de test. En outre, ces avantages augmentent le débit global et la reproductibilité du dosage. En outre, la sensibilité à l'éthanol mesurée dans cet essai ne est pas influencée par l'expression endogène de blanc ou le marqueur transgénique mini-white 18, ce qui convient pour les études avec des transgènes et des fonds génétiques couramment utilisés dans les analyses génétiques de Drosophila.
Plusieurs paramètres clés doivent être contrôlées pour obtenir des résultats fiables de tests éthanol de sédation. En plus de contrôler l'environnement de la croissance et le fond génétique des souches testé (voir ci-dessus), le volume et la concentration d'éthanol sont bien sûr extrêmement important pour la quantification de l'éthanol sensitiviTy. Notez que la dilution de l'éthanol dans l'eau est exothermique. Par conséquent, des solutions d'éthanol dilué devraient être autorisés à se équilibrer à température ambiante avant le début des essais de sédation. Un paramètre supplémentaire qui doit être rendue uniforme pour tous les groupes à l'essai est la longueur de temps que les mouches sont logés dans des flacons de produits alimentaires vides avant le début du dosage de la sédation. Deux paramètres supplémentaires devraient également être contrôlés. Le nombre de mouches par flacon devrait idéalement être (a) la même dans tous les flacons et les groupes, (b)
un nombre qui peut être facilement compté rapidement, et (c) un nombre assez grand pour permettre sédation temps-cours relativement lisses. Onze vole / flacon fonctionne bien dans notre laboratoire et est un point de départ suggéré. Un dernier paramètre à considérer est l'âge de vol utilisés dans les analyses de sédation. Bien qu'aucun effet reproductibles de l'âge sur la sensibilité à l'éthanol de sédation dans 1-10 jours vieilles mouches a été trouvé (données non présentées), l'utilisation de jeunes animaux appariés selon l'âge semblejustifiées étant donné la grande littérature sur les changements de comportement liés à l'âge chez les mouches 29,30.
D'autres paramètres ne semblent pas aussi critique dans des dosages de sédation, au moins lors de l'essai de contrôle vol en utilisant les gammes de paramètres décrits ici. Sexe, la force de taper, le temps de puiser de récupération, et la supplémentation de l'alimentation à la mouche avec des antibiotiques (ampicilline, la tétracycline et chloramphénicol) ou levures vivantes ne modifient pas la sensibilité de l'éthanol mesurée comme décrit ici. De même, la quantification de la sensibilité de l'éthanol par interpolation à partir du troisième ordre courbes polynomiales, interpolation à partir de courbes sigmoïdales, ou la détermination de l'ASC à partir des données de temps de cours sédation primaire conduit à des interprétations essentiellement indiscernables. Bien qu'aucun effet du sexe a été régulièrement observée dans les études décrites ici, effets du sexe sur la sensibilité de l'éthanol dans plusieurs milieux génétiques chez la drosophile ont été signalés 31. Ainsi, il est possible que les effets étaient du sexetout simplement masquée par la variance génétique dans le w [A] fond utilisée ici. En variante, il est possible que la mesure des effets du sexe sur les réponses comportementales chez la drosophile exigent des conditions de dosage ou à la croissance non encore identifiés. Dans tous les cas, la recommandation est de faire tous les paramètres aussi uniforme que possible dans les essais de sédation, y compris le sexe de tous les groupes étant explicitement rapport.
Étant donné que les levures vivantes produire des quantités importantes d'éthanol dans les aliments à la mouche, il était quelque peu surprenant que la supplémentation des aliments avec de la levure en direct n'a pas augmenté éthanol interne dans les mouches. Une explication possible est que l'éthanol ne est pas produit de manière uniforme sur toute la surface de la denrée alimentaire et les mouches peuvent ingérer des aliments donc sélectivement avec ou sans des concentrations relativement faibles d'éthanol. Des études supplémentaires seront nécessaires pour régler cette question et d'autres explications possibles de cette constatation.
Un grand nombre de modifications à la describ de dosageed ici sont possibles en fonction des objectifs de l'expérience en cours. Par exemple, le nombre de flacons testés dans une expérience, le nombre de mouches testés dans chaque flacon, la concentration et le volume d'éthanol utilisé, la durée de l'exposition à l'éthanol, l'intervalle de temps entre les évaluations de sédation, l'âge et le sexe de vol testé , et les critères pour la sédation peuvent tous être modifiés pour répondre aux besoins d'un laboratoire. La recommandation est de commencer avec un ou deux groupes de quatre flacons lors de l'apprentissage d'abord le test et ensuite évoluer jusqu'à en utilisant le nombre de flacons qui fournit le débit requis pour le projet. Doivent être observées ST50s inattendue courtes ou longues, il serait bon de se assurer que les vol d'essai ont été soumis à courte (1-5 min) temps de l'anesthésie, ont été autorisés à récupérer de l'anesthésie O / N, ont été de moins de 10 jours, étaient pas physiquement endommagé lors de la manipulation, ne ont pas été mouillée par la solution de l'éthanol, et ne avait pas déficiences locomotrices.
Le test mesure l'éthanol sédation sensibilité seulement et ne est donc pas conçu ou adapté pour évaluer d'autres réponses comportementales à l'éthanol. Comme tous les paradigmes comportementaux d'éthanol connu chez les mouches, ce test requiert mouches avoir des capacités locomotrices largement normales et les génotypes donc avec facultés locomotion doivent pas être testés. Une autre limitation du dosage est que la concentration de vapeur d'éthanol dans le flacon est probablement augmente continuellement que les médicaments se volatilise à partir de la bougie d'acétate de cellulose. Bien que l'éthanol interne de vol augmente progressivement avec le temps dans tous les voler éthanol tests comportementaux, il semble possible que la prestation une concentration fixe de vapeur d'éthanol aux mouches pourrait améliorer la cohérence des résultats de cet essai. Procédé pour délivrer une concentration fixe de vapeur d'éthanol n'a pas encore été identifié qui permettrait à l'essai à utiliser à l'échelle décrite ici.
La sédation éthanoldosage décrit ici est bien adapté pour des analyses génétiques de la sensibilité de l'éthanol et de la tolérance rapide 18. environnement de croissance, fond génétique, la concentration et le volume d'éthanol, la quantité de mouches passent de temps dans des flacons vides de nourriture, et le nombre et l'âge des mouches utilisés doivent tous être contrôlés. En supposant que ces paramètres sont contrôlés de manière adéquate, le dosage de la sédation doit être adapté à la fois arrière et en avant des approches génétiques qui enquêtent sur la base moléculaire de réponses comportementales à l'éthanol chez la drosophile.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
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