Abstract
اضطراب تعاطي الكحول (AUD) هو التحدي صحية خطيرة. وعلى الرغم من عنصر وراثي كبير لAUD، وعدد قليل من الجينات قد تورطت بشكل لا لبس فيه في المسببات الخاصة بهم. ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، هو نموذج قوي لاستكشاف الآليات الجزيئية الوراثية الكامنة وراء السلوكيات المتعلقة بالكحول، وبالتالي يحمل وعدا كبيرا لتحديد وفهم وظيفة الجينات التي تؤثر AUD. استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لهذه الأنواع من الدراسات يعتمد على توافر فحوصات لقياس موثوق الاستجابات السلوكية لالايثانول. ويصف هذا التقرير مقايسة مناسبة لتقييم حساسية الايثانول والتسامح السريع في الذباب. ويتأثر حساسية الايثانول قياس في هذا الاختبار من خلال حجم وتركيز الإيثانول المستخدم، ومجموعة متنوعة من التلاعب الجيني ذكر سابقا، وأيضا طول الوقت ويعيش الذباب دون طعام مباشرة قبل الاختبار. في المقابل، الإيثانول الصورةلا يتأثر ensitivity قياس في هذا الاختبار من قبل قوة من معالجة الطاير، جنس الذباب، ومكملات متوسطة النمو مع المضادات الحيوية أو الخميرة الحية. وصفت ثلاث طرق مختلفة لquantitating حساسية الإيثانول، كل يؤدي إلى نتائج حساسية الإيثانول يمكن تمييزها بشكل أساسي. طبيعة قابلة للمن هذا الاختبار، جنبا إلى جنب مع بساطته الشاملة لانشاء ومنخفضة نسبيا حساب، وجعلها مناسبة لتحليل الصغيرة والكبيرة الحجم الوراثي للحساسية الايثانول والتسامح السريع في ذبابة الفاكهة.
Introduction
اضطراب تعاطي الكحول (AUD) هو مشكلة صحية هائلة في جميع أنحاء العالم (مراجعة في 1). على الرغم من أن آليات القيادة وتطوير AUD معقدة، هذه الاضطرابات لها عنصر وراثي كبير (على سبيل المثال، 2). والتوريث كبير من AUD والاستجابات السلوكية الحفظ إلى الايثانول عبر العديد من الأنواع (التي استعرضت في 3،4) قد ولدت اهتماما كبيرا في استخدام الكائنات نموذج الجينية للتحقيق في تورط جينات معينة في السلوكيات المرتبطة الايثانول نحو فهم أفضل لالأساس الجزيئي لل AUD. ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، برزت كشركة رائدة كائن نموذج لاستكشاف الآليات الجزيئية الوراثية من السلوكيات المرتبطة الإيثانول (استعراضها في 3،4). وقد أبرزت الدراسات في الذباب الأدوار لعدة مسارات إشارات في الاستجابات السلوكية لالإيثانول (استعراضها في 5). يثير الاهتمام والفضول، وبعض من الجينات والممرات التي تؤثر على رد و السلوكيةكما تم توريط وفاق لالايثانول في الذباب في السلوكيات المرتبطة الايثانول القوارض و / أو AUD البشري (على سبيل المثال، 6-14). الحفاظ على آليات القيادة السلوكيات المرتبطة الإيثانول عبر الأنواع، إلى جانب مجموعة من الأدوات الجينية المتاحة في نظام نموذجي ذبابة الفاكهة، تؤكد فائدة نموذج ذبابة الفاكهة للتحقيق في علم الوراثة من الاستجابات السلوكية لالايثانول.
ويرتبط حساسية 15،16 والتسامح (استعراضها في 17) إلى الإيثانول في البشر في تطوير AUD. كل من هذه الاستجابات السلوكية لالإيثانول يمكن أن تكون على غرار في الذباب عن طريق مجموعة متنوعة من فحوصات المختبر (استعراضها في 3،4). تعتمد كل من المقايسات ذبابة معروفة للمؤلفين على أي تعتمد على الوقت الإيثانول الناجم عن التخدير / اتناسق أو الانتعاش تعتمد على الوقت من الإيثانول التخدير.
في مقال سابق من مجموعتنا على الوراثة من حساسية الايثانول و rالتسامح APID في ذبابة الفاكهة، تم استخدام الفحص السلوكي على أساس الايثانول التخدير الناجم عن بخار من الذباب (18). وقد بدأ اختبار في هذا الاختبار عن طريق نقل الكبار يعيش الذباب بدون تخدير لتفريغ قارورة الغذاء، ومحاصرة الذباب في قارورة مع المكونات خلات السليلوز، مضيفا الإيثانول إلى الأعلى (أي الجانب غير الطيران) من السليلوز خلات المكونات، و ختم القارورة التي تحتوي على الذباب، والسليلوز خلات التوصيل والايثانول مع سدادة سيليكون (انظر التخطيطي في الشكل S3، مرجع 18). تم تقييم قوارير متعددة تمثل مجموعات مختلفة من الذباب في موازاة ذلك، زيادة الإنتاجية من هذا الاختبار. أعطيت قارورة رمز المجهولين وتم أعمى المجربون لمجموعة العلاج لمنع التحيز غير المقصود في تقييم التخدير. في تجربة القياسية، الذباب في قارورة تم استغلالها بلطف في 6 دقائق فترات، وبعد الشفاء 30 ثانية، وقد أحصى عدد الذباب مخدرا في كل قارورة والمحولد أن الذباب النشطة في المئة. استوعبت الذباب الإيثانول بخار من المكونات خلات السليلوز بطريقة تعتمد على الوقت، مما تسبب في زيادات تدريجية في الإيثانول الداخلي 18 والتخدير (المرجع CF 18 و الشكل 1A و 1B في هذا التقرير). وقد تم تعريف التخدير في هذا الاختبار عمليا كما الذباب (ط) مكانة في غياب المشي أو (ب) الكذب على ظهورهم مع أو بدون ترفرف أجنحتها. هنا، يتم وصف هذا الإيثانول التخدير فحص بالتفصيل، يتم توفير مزيد من التحسين التشغيلي ذات الصلة لاستخدامه، ويستخدم في فحص لمعالجة مساهمة خيارات مكملات الغذائية على حساسية ذبابة التخدير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. يوم قبل الفحص
- جمع الذباب في قوارير المواد الغذائية الطازجة في مجموعات من 11 (جنس واحد) تحت جيزة (1-5 دقيقة) CO 2.
- السماح الذباب لاستعادة O / N في قارورة الغذاء في المساحات الخاضعة للسيطرة للبيئة (عادة 25 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60٪، و 12 ساعة ضوء / دورة الظلام).
- يعد حل الإيثانول (ق) عن طريق تمييع النقي (100٪) الايثانول في تنقية (≥18 MΩ) الماء إلى التركيز النهائي (ق) المناسب للتجربة المخطط لها. تسمح الحل (ق) للعودة إلى RT O / N.
ملاحظة: التخفيف من الايثانول هو طارد للحرارة.
2. يوم من الفحص
- لكل قارورة من الذباب لفحصها، وإعداد (ط) نظيفة، فارغة قنينة الغذائي؛ أي اختبار قنينة، (ب) الجديد المكونات خلات السليلوز، (ج) سدادة سيليكون و (د) 1 مل من محلول الإيثانول (انظر الجدول 3).
- إعداد غرفة الاختبار عن طريق ضبط درجة الحرارة إلى 20-25 درجة مئوية والرطوبة النسبية إلى 55-65٪.
- هل لديك عامل آخرتعيين رمز فريد لكل مجموعة من قارورة وتسجيل رمز في وقت لاحق. ضع قارورة مشفرة مع الذباب في غرفة الاختبار حتى يتأقلم لدقائق قليلة.
- تسمية قارورة اختبار فارغة لمطابقة الرموز على قارورة ذبابة من 2.3.
- بناء الصعب سجل اختبار نسخة عن طريق إدخال رموز في أعمدة (عمود واحد / قارورة) في جدول بيانات مشابهة لجدول 1.
- باستخدام السجل اختبار كدليل، وترتيب قارورة الغذاء مشفرة مع الذباب وقارورة اختبار فارغة إلى مطابقة صفائف في قاعة الاختبار.
ملاحظة: الحد الأقصى معقول من قارورة لاختبار هو 24 (أي 6 مجموعات من 4 قوارير لكل منهما). - نقل الذباب من قوارير الطعام إلى مطابقة / وصفت قارورة اختبار فارغة وإدراج فورا السليلوز المقابس خلات في قارورة الاختبار حتى السليلوز المقابس خلات هي 2 سم تحت قمم القارورة.
- الآخرة، والتعامل مع كل صف من أربعة قوارير كمجموعة في متداخلة 1 دقيقة فترات.
- لتقييم الوقت 0، فهم كل قارورة بشكل فردي ثالإبهام والسبابة إيث، اضغط بلطف على الطاولة ثلاث مرات لضرب الذباب إلى أسفل القارورة، وانتظر 30 ثانية ثم حساب عدد من الذباب التي هي غير متحرك / الأموات. تسجيل عدد غير متحرك / الذباب الميت لكل قنينة في الساعة 0 دقيقة في سجل الاختبار الورقية.
- بدء الموقت تعول بشكل مستمر في الوقت 0 وتبدأ على الفور بإضافة 1 مل من الإيثانول إلى السليلوز المقابس خلات في قارورة لأول صف / مجموعة من 4 قوارير. إضافة 1 مل من الايثانول إلى المقابس خلات السليلوز في قارورة في 5 فترات ثانية بالترتيب الذي سيتم اختبار. إضافة الإيثانول إلى المقابس خلات السليلوز في حركة دائرية بحيث يتم استيعاب الإيثانول بالتساوي في جميع أنحاء المقابس خلات السليلوز. عندما تمت إضافة الإيثانول إلى كل قارورة اختبار 4 في المجموعة، وإدراج المكونات سيليكون في كل قارورة لختم عليه.
- وفي بعض الأحيان 1، 2، 3، 4 و 5 دقائق، إضافة 1 مل من الايثانول إلى الثالثة والرابعة والمجموعتين الثانية والخامسة والسادسة من 4 قوارير، على التوالي. مواصلة إدخال سدادات سيليكون بعدمضيفا الإيثانول إلى كل مجموعة من 4 قوارير.
- في وقت 6 دقائق، واختبار أول مجموعة من 4 قوارير من استيعاب كل قارورة مع الإبهام والسبابة، والتنصت بلطف على الطاولة ثلاث مرات لضرب الذباب إلى أسفل القارورة، والانتظار 30 ثانية ثم عد وتسجيل العدد الإجمالي لل الذباب التي يتم مخدرا. النتيجة الذباب كما مخدرا إذا كانوا (ط) الوقوف على أرضية القارورة ولكن لا يمشي أو (ب) الاستلقاء على ظهورهم مع أو بدون ترفرف أجنحتها.
- التعامل مع كل قارورة ضمن مجموعة في 5 فترات ثانية باستخدام الجدول الزمني في الجدول 2.
- في أوقات 7 و 8 و 9 و 10 و 11 دقيقة، واختبار المجموعتين الثانية والثالثة والرابعة والخامسة والسادسة من قوارير، على التوالي، كما فعلت لمجموعة العشرين.
- في وقت 12 دقيقة، واختبار أول مجموعة من 4 قوارير مرة أخرى كما هو موضح في 2.12 ومواصلة اختبار الثالثة والرابعة والمجموعتين الثانية والخامسة والسادسة من قارورة في 13 و 14 و 15 و 16 و 17 دقيقة على التوالي.
- مواصلة الذباب الاختبار كما هو موضح في 2.12 حتى كل الذباب هي الصورةedated.
- أدخل عدد من الذباب في كل قارورة في سجل الصعب اختبار نسخة. فرض رقابة متحركة / الذباب الميت في وقت و0 من إجمالي عدد الذباب.
- حساب الذباب النشطة في المئة في كل مرة التقييم نقطة والبيانات مؤامرة كما الذباب النشطة٪ (المحور الصادي) مقابل الوقت (محور س). Quantitate الإيثانول التخدير عن طريق التحريف التخدير الوقت 50 القيم (ST50، والوقت ل50٪ التخدير) من ثالث ترتيب منحنى متعدد الحدود أو السيني يناسب أو حساب المساحة تحت منحنى.
- تجميع البيانات من قارورة فك الشفرة وإجراء التحليلات الإحصائية (على سبيل المثال، في اتجاه واحد ANOVA مع Bonferroni التجارب المقارنة متعددة) بما يتناسب مع التصميم التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البيانات الخام من هذا الإيثانول التخدير الاختبار هي أعداد الذباب التي يتم مخدرا بوصفها وظيفة من بخار الإيثانول وقت التعرض. يتم تحويل البيانات الخام إلى الذباب النشطة في المئة بوصفها وظيفة من الزمن (البيانات الأولية، أرقام 1A، B، D - F). الحساسية للتخدير الإيثانول من البيانات الأولية يمكن quantitated كما التخدير الوقت 50 (ST50)، والوقت اللازم ل50٪ من الذباب لتصبح مخدرا أو AEA تحت المنحنى (AUC)، عن طريق الاستيفاء من منحنى يناسب. ذكرت سابقا 18 ثالث ترتيب منحنيات متعددة الحدود تناسب البيانات الأولية بشكل جيد كما هو متوقع (متوسط R 2 = 0.934، ن = 24، الشكل 1A)، على الرغم من منحنيات السيني تناسب البيانات الأولية أفضل إلى حد ما (متوسط R 2 = 0.997، ن = 24، الشكل 1B). كبديل لتحديد القيم ST50 من نوبات منحنى، حساسية الايثانول التخدير من البيانات الأولية يمكن أيضا أن تكون quantitated كمنطقةتحت المنحنى (AUC، الذباب النشطة٪ X مرة) (الشكل 1C). النتائج من هذه الطرق الثلاث من الكميات ترتبط بشكل جيد للغاية مع بعضها البعض (بيرسون ص 2 ≥0.998، ن = 24) وأساسا لا يمكن تمييزها (الشكل 1C)، على الرغم من أن وحدات مختلفة بالضرورة عن ST50 (دقيقة) وAUC (٪ النشطة الذباب العاشر الوقت). تتوفر من المؤلف المقابلة من التفاصيل فيما يتعلق بجميع الحسابات وجداول البيانات المستخدمة، الخ. لاحظ أن القيم العليا والسفلى من ST50 (أو AUC) تشير قلل وتعزيز الحساسية للتخدير الإيثانول، على التوالي. من أجل التناسق مع التقرير السابق 18، استخدمت القيم ST50 المستمدة من ثالث ترتيب منحنى متعدد الحدود نوبات طوال الفترة المتبقية من هذا study.Importantly، الفحص بالكشف عن آثار رني ضد Cnx14D (1D الشكل) والطفرات في بنك التسليف والادخار (الشكل 1E) ، آرو وhppy (الشكل 1F)،
خلال الاستخدام الروتيني لهذا الفحص، والتنصت من قوارير مع المقابس خلات السليلوز المبللة مع 2 مل من الايثانول تسبب في خلات السليلوز سدادات للسفر نحو قيعان بعض قوارير في عدد قليل من التجارب الفردية (لا يظهر)، وبالتالي يحتمل تغيير مجانا الذباب " الفضاء وتركيز بخار الايثانول. بالإضافة إلى ذلك، ما يقرب من 0.25 مل من الايثانول وصلت إلى أسفل (أي، ويطير الجانب) من المقابس خلات السليلوز عندما كانوا المبللة مع 2 مل من الايثانول (الشكل 2A)، مما يزيد من احتمال التي تطير في هذه المقايسات تعرضوا لالإيثانول السائل بالإضافة إلى الإيثانول بخار. تناقص حجم الإيثانول في سد خلات السليلوز من 2 مل إلى 1 مل القضاء على الهجرة الهبوط من cellulosالمقابس خلات البريد أثناء الفحص حتى بعد التنصت قوية (لا يظهر)، وكذلك القضاء على كميات قابلة للقياس من حل الإيثانول على قيعان من المقابس خلات السليلوز (الشكل 2A). كان التخدير من الذباب حساسة لحجم الإيثانول استخدامها حتى مع وحدات التخزين أقل من 1 مل (الشكل 1A - C). باستخدام 1 مل من الايثانول وبالتالي يساعد على الحفاظ على الفضاء المفتوح المستمر عن الذباب خلال الفحص ويضمن أن الإيثانول السائل لا يتم بلعها. وبالتالي يتعرضون الذباب ويفترض أن الإيثانول فقط في شكل بخار في هذا الاختبار. واحد مل من الايثانول 85٪ (أي بخار من 1 مل من 85٪ (المجلد / المجلد) الايثانول) واستخدمت و1-5 يوم القديم ث [A] الذباب في جميع الدراسات اللاحقة ذكرت هنا ما لم يذكر خلاف ذلك.
في تجارب مع 24 قارورة، يتم استغلالها الذباب بلطف في 6 دقائق فترات السماح للالمجرب لتقييم (أي دورة من خلال) كل قارورة على معقول، برنامجكم المقررةه. كانت ST50s من الدراسات مع الذباب سيطرة على استخدام عدد أقل من قارورة و 5 دقيقة فترات مماثلة لST50s من الدراسات مع فترات 6 دقيقة (لا تظهر البيانات). ويتم تقييم الذباب لتخدير 30 ثانية بعد التنصت على السماح الوقت المجرب للاستفادة من مجموعة من أربع عبوات في تسلسل قبل تحديد حالة التخدير من الذباب في كل قارورة. لتحديد ما إذا تم قياس الاختلافات في التنصت قوة أو انتعاش مرة بعد التنصت تأثير الايثانول حساسية التخدير، والقيم ST50 في الذباب سيطرة الذكور والإناث في حين يجري استغلالها بشكل طبيعي (عادي) أو بشكل حاد جدا (الصلب) وبعد 30 ثانية القياسية أو أطول من 60 ثانية الانتعاش. كان التنصت حيوية (الشكل 2B) ووقت الاسترداد (الشكل 2C) أي تأثير ملموس على القيم ST50 في الذكور السيطرة أو الإناث.
المضادات الحيوية يمكن استخدامها لقمع نمو البكتيريا في المتوسط ذبابة الغذاء. لتحديد ما إذا مكملات من المتوسط الطعام مع المضادات الحيوية يؤثر الإيثانول حساسية التخدير،تم قياس القيم ST50 في الذباب تربى لجيل واحد في وجود أو غياب ثلاثة مضادات حيوية (الأمبيسلين، 100 ميكروغرام / مل، التتراسيكلين، 20 ميكروغرام / مل؛ الكلورامفينيكول، 125 ميكروغرام / مل). وكانت تربية الذباب على هذه المضادات الحيوية الثلاثة أي تأثير على حساسية الايثانول تخدير (الشكل 2D).
يتم نقل الذباب في الغذاء فارغة قارورة، وبالتالي يحرمون من الطعام والماء لمدة 5 دقائق ~ على الفور قبل التعرض للبخار الإيثانول في مقايسة التخدير. لتحديد ما إذا كان يتم الاحتفاظ كمية من الذباب الوقت في قارورة فارغة الغذائية قبل بدء حساسية التخدير الآثار فحص الإيثانول، وتجويع الذباب لمدة 6 ساعة (على الأقل 70 أضعاف من العادي) ثم تم قياس القيم ST50. التجويع لمدة 6 ساعة انخفضت بشكل ملحوظ ST50s في كل من الذباب سيطرة الذكور والإناث (الشكل 2E). على الرغم من أن تأثير الجوع على ST50 كان صغيرا نسبيا (9-14٪ في هذه التجارب)، ومقدار الوقت الذباب جمعية مهندسي البترولالثانية في قوارير فارغة قبل التعرض للبخار الإيثانول في مقايسة ينبغي أن تعقد موحدة عبر مجموعات داخل التجربة وأيضا بين التجارب.
مختبر ذبابة الغذاء يمكن أن تستكمل مع الخميرة الحية (على سبيل المثال، 18،20،23،24) لتعزيز إنتاج ذرية. على سبيل المثال، قارورة الغذاء تستكمل مع الخميرة الحية (خميرة الخباز) المنتجة البالغين في وقت سابق من تلك التي مع مقتل الحرارة الخميرة أو أي الخميرة الحية (قارن D10-D11، أشرطة بيضاء، الشكل 3A)، على الرغم من أن العدد الإجمالي للذرية تنتج أكثر من 20 يوما كان يمكن تمييزها في قارورة تستكمل مع الخميرة الحية وقتلوا الحرارة (الشكل 3A). لمعالجة احتمال أن يعيش إنتاج الخميرة كميات ذات مغزى من الايثانول على ذبابة الغذاء، تم قياس آثار الخميرة الحية على (ط) الإيثانول في المتوسط الغذائية، (ب) الايثانول في الذباب، و (iii) حساسية الايثانول التخدير في الذباب. متوسطة الغذائية تستكمل مع الخميرة الحية الواردة الفرعيةكميات stantial من الإيثانول مقارنة مع المواد الغذائية تستكمل مع الحرارة أو قتل أي خميرة (الشكل 3B). ومع ذلك، الذباب السيطرة نمت على المتوسطة تستكمل مع العيش، وقتلت أو لم يكن الخميرة تركيزات منخفضة indistinguishably من الايثانول الداخلي (الشكل 3C). وعلاوة على ذلك، كانت حساسية التخدير الإيثانول يمكن تمييزها في الذباب السيطرة نمت على المتوسط تستكمل مع الحرارة أو قتل الخميرة الحية (الشكل 3D).
الشكل 1. (AC) التخدير فحص خيارات تحليل البيانات. السيطرة ث [A] الإناث (ث 1118 إسوي، بلومنغتون إنديانا ذبابة الفاكهة مركز الأسهم # 5905) تعرض إلى بخار من وحدات التخزين وأشار 85٪ (المجلد / المجلد) الايثانول. تناسب البيانات (A) التخدير الوقت بالطبع مع ثالث متعددو النظام. (B)تناسب البيانات التخدير الوقت بالطبع مع منحنيات السيني. (C) الإيثانول التخدير حساسية quantitated كما (من اليسار Y-محور) القيم ST50 محرف من متعددو الحدود ثالث ترتيب ومنحنيات السيني أو (Y الصحيح المحور) المنطقة تحت المنحنى (AUC،٪ الذباب النشطة X مرة). حجم الإيثانول، ولكن ليس طريقة التحليل، وحساسية الايثانول أثر (في اتجاهين ANOVA، تأثير حجم، ص <0.0001، تأثير طريقة التحليل، نانوثانية، ن = 8 / الجماعة؛ البيانات AUC تحولت 1/100 لحساب الفرق في حجم القيم). (DF) بيانات تمثيلية الوقت بالطبع من (D) التعبير عن Cnx14D رني في الجهاز العصبي (elav-GAL4 / v5597) اضعافها الإيثانول حساسية بالنسبة لضوابط (v5597 / + وelav-GAL4 / + ). (E و F) الطفرة من ليالي CB (بنك التسليف والادخار Vol2) وآرو (آرو 8،128) تعزيز الإيثانول حساسية التخدير وتحور hppy (hppyKG5537) قلل حساسية التخدير الإيثانول مقارنة مع الضوابط. تم الإبلاغ عن البيانات في EF سابقا كقيم ST50 18.
الشكل 2. تقييم المعلمات التشغيلية في مقايسة التخدير. (A) كمية الإيثانول في أسفل 2 ملم من المقابس خلات السليلوز. حجم الإيثانول تضاف إلى قمم السليلوز المقابس خلات كان لها تأثير كبير على حجم الإيثانول الذي انتقل إلى أسفل 2 ملم من المقابس خلات السليلوز خلال تجربة وهمية 60 دقيقة (في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.0001؛ * Bonferroni متعددة اختبار المقارنة، 2 مل مقابل 0 و 1 مل، ف <0.05 ن = 4). كان quantitated الإيثانول على أنه تغيير في كتلة المقابس خلات السليلوز. (ب) لا قوة من الاستفادة من قوارير خلال اختبار (العادية، الصلب) ولا جنس من الذباب اختبار ST50s تضررا (ث اثنين المنعم يوسف ANOVA. تأثير التنصت، نانوثانية. تأثير الجنس، نانوثانية. ن = 12) (C) لا الانتعاش مرة بعد التنصت ولا زيارتها الجنس آثار كبيرة على ST50s (في اتجاهين ANOVA؛ تأثير الانتعاش مرة، نانوثانية، تأثير الجنس، نانوثانية؛ ن = 6) (D) إدراج المضادات الحيوية زيارتها، (الأمبيسلين، التتراسيكلين والكلورامفينيكول ATC) في وسط النمو أي تأثير شامل على ST50s، ولكن كان هناك تأثير الجنس على ST50 (في اتجاهين ANOVA، تأثير ATC، نانوثانية، تأثير الجنس، ع = 0.001؛ التفاعل ، نانوثانية؛ ن = 6) (E) تأثير الجوع على حساسية الايثانول التخدير. ST50s كانت أقل بشكل ملحوظ في الذباب الحرمان من الطعام والماء لمدة 6 ساعات (جوعا) مقارنة تتغذى عادة (البنك المركزي الامريكي) الذباب. كانت ST50s في الذكور والإناث لا يمكن تمييزها عموما (في اتجاهين ANOVA، تأثير المجاعة، ص <0.0001، تأثير الجنس، نانوثانية، ن = 12؛ * Bonferroni اختبارات مقارنة متعددة، تأثير المجاعة في الذكور والإناث، ف <0.05) .
ithin صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. تأثير الخميرة الحية على النمو، ومحتوى الإيثانول وحساسية التخدير. (A) ذرية الكبار من قارورة تحتوي على المتوسط الغذائية تستكمل مع أي الخميرة (لا Y)، الحرارة الخميرة قتل (قتل Y) أو الخميرة الحية (لايف Y). أشرطة بيضاء، ذرية الكبار الناشئة خلال أيام 10-11. القضبان الرمادية، أيام 12-20. وعموما، كان العلاج الخميرة لها تأثير كبير على إنتاج ذرية (في اتجاه واحد ANOVAs، كل (10-20) يوما، ف <0.0001، أيام 10-11، ص <0.0001، أيام 12-20، ص = 0.0002، ن = 5 ). وكان إجمالي عدد ذرية تنتج أثناء كل (10-20) يوما أكبر من قارورة مع قتل Y Y والعيش من لا Y (Bonferroni متعددة اختبار المقارنة، ف <0.05). خلال أيام 10-11، قارورة مع لايف Y أنتجت المزيد من ذرية من قتل Y وقوارير مع قتل Y تنتج المزيد من ذرية من لا Y (أشرطة بيضاء، Bonferroni اختبارات مقارنة متعددة، ف <0.05). خلال أيام 12-20، قارورة وايقتل عشرة المنتجة Y المزيد من ذرية من قارورة مع لا Y Y أو لايف (القضبان الرمادية، Bonferroni متعددة اختبار المقارنة، ف <0.05)، وكان (B) الإيثانول في المتوسط الغذاء أعلى بكثير في قارورة تستكمل مع لايف Y مقارنة مع قارورة لا Y Y وقتل (في اتجاه واحد أنوفا، ف <0.0001، ن = 5؛ Bonferroni متعددة اختبار المقارنة، ف <0.05) (C) الإيثانول الداخلي في ث [A] لم يتأثر الذباب الإناث بشكل كبير من مكملات مع الخميرة (واحد. -way ANOVA، نانوثانية، ن = 5-10). المحتوى الإيثانول في B و C تحديد كما هو موضح 18 لم تتأثر (D) القيم ST50 بشكل كبير من قبل مكملات من متوسط النمو مع الخميرة في الذكور أو الإناث ث [A] (في اتجاهين ANOVA؛ تأثير الخميرة، نانوثانية، تأثير الجنس، نانوثانية، ن = 12).
| قارورة → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| كود → | ||||||||
| إجمالي # → | ||||||||
| 0 دقيقة | ||||||||
| 6 دقيقة | ||||||||
| 12 دقيقة | ||||||||
| 18 دقيقة | ||||||||
| 24 دقيقة | ||||||||
| 30 دقيقة | ||||||||
| 36 دقيقة | ||||||||
| 42 دقيقة | ||||||||
| 48 دقيقة | ||||||||
| 54 دقيقة | ||||||||
| 60 دقيقة |
الجدول 1: نموذجي سجل الاختبار. انظر بروتوكول خطوة 2.5.
| قارورة | صنبور | تقييم |
| 1 | 6 دقيقة 0 ثانية | 6 دقائق و 30 ثانية |
| 2 | 6 دقيقة 5 ثانية | 6 دقائق و 35 ثانية |
| 3 | 6 دقيقة 10 ثانية | 6 دقيقة و 40 ثانية |
| 4 | 6 دقيقة 15 ثانية | 6 دقيقة و 45 ثانية |
الجدول 2: التنصت نموذجي والجدول الزمني الاختبار انظر بروتوكول خطوة 2.13.
| اسم المادة / معدات | شركة | عدد كتالوج | تعليقات / الوصف |
| قارورة الغذاء | VWR | 89092-772 | ضيق |
| Flugs | جينيسي / flystuff.com | 49-102 | ضيق |
| سيليكون سدادة | فيشر العلمية | 09-704-1l | # 4 |
| الإيثانول | الصيدلانية-Aaper | 111000200 | 200 دليل |
الجدول 3: المواد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المقايسات واضحة أن quantitate بتكاثر الظواهر ذات معنى هي ذات قيمة كبيرة لتحليل السلوك. العمل الموصوف هنا يتناول عدة جوانب العملية لفحص لقياس حساسية الايثانول التخدير والتسامح السريع في ذبابة الفاكهة. على الرغم من عدم التركيز لهذا العمل، وتسهيل التحليلات السلوكية من خلال الحفاظ على البيئة وثابت الخلفية الوراثية للاختبار المواضيع ضمن الدراسة. وعلاوة على ذلك، ينبغي عادة أن إجراء مقارنات بين مجموعات من الذباب تربى واختبارها جنبا إلى جنب. تحقيقا لهذه الغاية، كان كل الذباب في التجارب الفردية في هذا العمل نفس الخلفية الوراثية وتم تربية جنبا إلى جنب تحت ظروف بيئية موحدة (25 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60٪، و 12 ساعة ضوء / دورة الظلام) مع معيار المتوسطة الطعام (10 ٪ سكروز، 3.3٪ دقيق الذرة، 2٪ الخميرة و 1٪ أجار) باستثناء تلك التجارب التي تم التلاعب بها وسيلة الغذاء صراحة.
وETHأنول فحص التخدير الموصوفة هنا يتطلب عدد قليل جدا من المواد (قارورة بلاستيكية، والمقابس خلات السليلوز، سدادات سيليكون والإيثانول)، والتي هي غير مكلفة ومتاحة بسهولة من مصادر تجارية (الجدول 3). هذا الاختبار الإيثانول التخدير يشبه وإلى حد كبير على أساليب ذكرت سابقا (على سبيل المثال، 6،20،25-27، استعرض شامل في 3،28). على الرغم من كل هذه المقايسات يكون أداة لقياس حساسية الايثانول التخدير، وصفت مزايا للمقايسة هنا تشمل لا يتعرض (ط) الذباب لالإيثانول السائل أثناء الفحص، (ب) انخفاض احتمال أن الذباب يمكن أن يصبح متشابكا في القطن أو مواد أخرى في قنينة اختبار أثناء الفحص، (ج) القدرة على اختبار مجموعات كثيرة من الذباب في موازاة ذلك، و (د) ثلاثة خيارات لتقدير موضوعي للحساسية الإيثانول من مجموعات البيانات الأولية. معا، وهذه المزايا القضاء إلى حد كبير إمكانية أن يطير الشراب الإيثانول، ثار الإيثانول يمكن أن تبلل الأسطح الخارجية من الذباب الأمر الذي يعيق قدرات الحركي الشاملة، ويمكن أن أداء مرتبك من الذباب في مقايسة التي كتبها الصعوبات المرتبطة المشركة المواد في بيئة الاختبار. بالإضافة إلى ذلك، هذه المزايا زيادة الإنتاجية الشاملة واستنساخ للمقايسة. وعلاوة على ذلك، لا تؤثر حساسية الايثانول قياس في هذا الاختبار عن طريق التعبير عن الذاتية الأبيض أو علامة المعدلة وراثيا مصغرة الأبيض 18، مما يجعلها مناسبة للدراسات مع الجينات المحورة والخلفيات الوراثية التي يشيع استخدامها في التحليلات الوراثية ذبابة الفاكهة.
ينبغي أن تسيطر العديد من المعلمات الرئيسية للحصول على نتائج موثوقة من المقايسات الإيثانول التخدير. بالإضافة إلى التحكم في بيئة النمو والخلفية الوراثية للسلالات التي يجري اختبارها (انظر أعلاه)، وحجم وتركيز الايثانول وبالطبع في غاية الأهمية لتحديد الكميات من الإيثانول sensitiviتاي. لاحظ أن التخفيف من الايثانول في الماء هو طارد للحرارة. وبناء على ذلك، ينبغي أن يسمح للحلول الايثانول المخفف لكي تتوازن لRT قبل الشروع في المقايسات التخدير. معلمة إضافية التي ينبغي إدخالها موحدة عبر المجموعات التي يجري اختبارها هي طول الفترة الزمنية التي الذباب ويعيش في قارورة فارغة الغذائية قبل بدء فحص التخدير. وينبغي أيضا أن يسيطر معلمتين إضافية. عدد الذباب في قارورة يجب أن يكون مثاليا (أ) هي نفسها في كل قارورة والجماعات، (ب)
وهو الرقم الذي يمكن عدها بسهولة بسرعة، و (ج) عدد كبير بما يكفي للسماح للتخدير سلس نسبيا وقت الدورات. أحد عشر الذباب / قارورة يعمل بشكل جيد في مختبرنا وهي نقطة انطلاق المقترحة. معلمة النهائية للنظر هو عمر الذباب المستخدمة في المقايسات التخدير. وعلى الرغم من عدم وجود آثار استنساخه من العمر على حساسية الايثانول التخدير في الذباب القديمة 1-10 يوم تم العثور على (لا تظهر البيانات)، واستخدام الشباب الحيوانات العمر المتطابقة يبدوبرر نظرا للأدب كبير على التغيرات السلوكية المرتبطة بالعمر في الذباب 29،30.
لا يبدو غيرها من المعالم كما حاسما في المقايسات التخدير، على الأقل عند اختبار الذباب التحكم باستخدام نطاقات المعلمات الموصوفة هنا. الجنس، قوة والتنصت، ووقت الشفاء من التنصت، والمكملات الغذائية من الذباب مع المضادات الحيوية (الأمبيسلين، التتراسيكلين والكلورامفينيكول) أو الخميرة الحية لا تغير حساسية الايثانول قياس كما هو موضح هنا. وبالمثل، quantitating حساسية الإيثانول عن طريق الاستيفاء من ثالث ترتيب منحنيات متعددة الحدود، الاستيفاء من منحنيات السيني، أو قرار من الجامعة الأمريكية بالقاهرة من التخدير الأساسي الوقت بالطبع البيانات يؤدي إلى تفسيرات يمكن تمييزها بشكل أساسي. على الرغم من عدم تأثير الجنس لوحظ باستمرار في الدراسات الموصوفة هنا، تم الإبلاغ عن آثار الجنس على حساسية الايثانول في عدة خلفيات وراثية ذبابة الفاكهة 31. وبالتالي، فمن الممكن أن الآثار كانت الجنسملثمين ببساطة عن طريق التباين الوراثي في ث [A] الخلفية المستخدمة هنا. بدلا من ذلك، فمن الممكن أن قياس تأثيرات الجنس على الاستجابات السلوكية في ذبابة الفاكهة تتطلب فحص أو النمو الشروط التي مجهولة حتى الان. في أي حال، فإن التوصية لجعل جميع المعلمات متجانسة بقدر الإمكان في المقايسات التخدير، بما في ذلك ممارسة الجنس في أي مجموعة يجري مقارنة صراحة.
وبالنظر إلى أن الخميرة الحية تنتج كميات كبيرة من الايثانول في ذبابة الطعام، كان مفاجئا بعض الشيء أن مكملات الغذاء مع الخميرة الحية لم تزد الإيثانول الداخلي في الذباب. أحد التفسيرات المحتملة هو أن لا يتم إنتاج الإيثانول بشكل موحد عبر السطح من المواد الغذائية والذباب قد تناول طعاما بالتالي انتقائي الغذاء مع عدم وجود أو تركيزات منخفضة نسبيا من الايثانول. سوف تكون هناك حاجة دراسات إضافية لمعالجة هذه المسألة وتفسيرات أخرى ممكنة لهذه النتيجة.
وهناك عدد كبير من التعديلات على describ الفحصإد ممكنة هنا اعتمادا على أهداف التجربة التي يتم تنفيذها. على سبيل المثال، اختبار عدد من قوارير في تجربة، وعدد من الذباب اختبارها في كل قارورة، وتركيز وحجم الإيثانول المستخدمة، ومدة التعرض الإيثانول، الفاصل الزمني بين التقييمات التخدير، سن وجنس الذباب اختبار ، ومعايير التخدير يمكن لجميع تعديلها لتتناسب مع احتياجات مختبر الفردية. التوصية هو أن تبدأ مع واحد أو اثنين من مجموعات من أربعة قوارير عندما تعلم في البداية فحص ومن ثم الارتقاء إلى استخدام عدد من القنينات التي توفر الإنتاجية اللازمة للمشروع. ينبغي مراعاة ST50s قصيرة أو طويلة بشكل غير متوقع، سيكون من الممارسات الجيدة لضمان تعرضوا أن اختبار الذباب إلى قصيرة (1-5 دقائق) مرات التخدير سمح، للتعافي من التخدير O / N، كانت أقل من 10 يوما من العمر، كانت لا تضررت ماديا أثناء التداول، لم المبللة التي كتبها حل الإيثانول، وليس لديها ضعف الحركي.
التدابير فحص الإيثانول حساسية التخدير فقط، وبالتالي ليست مصممة أو مناسبة لتقييم الاستجابات السلوكية الأخرى لالايثانول. مثل كل النماذج السلوكية الإيثانول المعروفة في الذباب، وهذا الاختبار يتطلب الذباب لديك قدرات الحركي العادية إلى حد كبير، وبالتالي المورثات يعانون من ضعف تحرك لا ينبغي اختبارها. الحد آخر من الاختبار هو أن تركيز بخار الإيثانول في قنينة ويفترض أن ترتفع بشكل مستمر حيث تطاير المخدرات من المكونات خلات السليلوز. وعلى الرغم من الإيثانول الداخلي الذباب "يرتفع تدريجيا مع مرور الوقت في جميع يطير الإيثانول المقايسات السلوكية، يبدو من الممكن أن يسلم على تركيز ثابت من بخار الإيثانول إلى الذباب يمكن تحسين اتساق النتائج من هذا الاختبار. لم يتم حتى الآن تحديد طريقة لايصال على تركيز ثابت من بخار الإيثانول من شأنه أن يسمح للمقايسة لاستخدامها على نطاق وصفها هنا.
التخدير الإيثانولمقايسة الموصوفة هنا هي مناسبة تماما لتحليل الجيني للحساسية الايثانول والتسامح السريع 18. بيئة النمو، والخلفية الوراثية، وتركيز وحجم الإيثانول، ومقدار الوقت الذي يقضيه الذباب في قارورة فارغة الغذائية، وينبغي التحكم في عدد وعمر الذباب تستخدم جميع. على افتراض يتم التحكم بشكل كاف هذه المعايير، ينبغي أن يكون الفحص التخدير مناسبة لكلا عكس وإلى الأمام النهج الوراثية التي بالتحقيق في الأساس الجزيئي للاستجابات سلوكية لالايثانول في ذبابة الفاكهة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
