Abstract
Alcoholgebruik stoornis (AUD) is een ernstig gezondheidsprobleem uitdaging. Ondanks een grote erfelijke component AUD, zijn weinig genen eenduidig betrokken bij hun etiologie. De fruitvlieg Drosophila melanogaster, is een krachtig model voor het verkennen van moleculair genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan alcohol gerelateerde gedrag en daarom bezit is van een grote belofte voor het identificeren en begrijpen van de functie van genen die AUD beïnvloeden. Het gebruik van het Drosophila model voor deze soorten onderzoeken afhankelijk van de beschikbaarheid van testen die gedragsreacties ethanol betrouwbaar te meten. Dit rapport beschrijft een test geschikt is voor de beoordeling van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie in vliegen. Ethanol gevoeligheid gemeten in deze assay wordt beïnvloed door het volume en de concentratie van ethanol gebruikt, verschillende eerder beschreven genetische manipulaties, en ook hoe lang het vliegen worden ondergebracht zonder voedsel ogenblik van de proef. Daarentegen ethanol sensitivity gemeten in deze test wordt niet beïnvloed door de kracht van vlieg behandeling, geslacht van de vliegen en suppletie kweekmedium met antibiotica of levende gist. Drie verschillende methoden voor het kwantificeren ethanol gevoeligheid beschreven uiteindelijk toe leidt kenmerken ononderscheidbaar ethanol gevoeligheid resultaten. De schaalbare karakter van deze test, in combinatie met de algehele eenvoud aan de set-up en de relatief lage kosten, maken het geschikt voor kleine en grote schaal genetische analyse van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie in Drosophila.
Introduction
Alcoholgebruik stoornis (AUD) is een enorm gezondheidsprobleem wereldwijd (beoordeeld in 1). Hoewel de mechanismen die de ontwikkeling van AUD complex, deze aandoeningen hebben een belangrijke genetische component (bijvoorbeeld 2). De grote erfelijkheid van AUD en de geconserveerde gedragsreacties naar ethanol in heel veel soorten (beoordeeld in 3,4) sterke interesse in het gebruik van genetisch model organismen om de betrokkenheid van specifieke genen in-ethanol gerelateerd gedrag in de richting van een beter inzicht in de moleculaire basis van onderzoeken hebben gegenereerd AUD. De fruitvlieg Drosophila melanogaster, heeft ontpopt als een toonaangevende modelorganisme voor het verkennen van moleculair-genetische mechanismen van-ethanol gerelateerd gedrag (beoordeeld in 3,4). Studies in vliegt hebt gemarkeerd rollen voor verschillende signaalwegen in gedragsreacties om ethanol (beoordeeld in 5). Intrigerend sommige genen en pathways die gedragsmatige respons beïnvloedenes ethanol in vliegen zijn ook betrokken knaagdieren ethanol gerelateerd gedrag en / of menselijke AUD (bijvoorbeeld 6-14). Het behoud van mechanismen achter-ethanol gerelateerd gedrag alle species, in combinatie met de reeks genetische gereedschap in het Drosophila modelsysteem onderstrepen het nut van de fruitvlieg model voor onderzoek naar de genetica van gedragsreacties ethanol.
Gevoeligheid 15,16 en tolerantie (besproken in 17) tot ethanol bij de mens is verbonden met de ontwikkeling van AUD. Beide gedragsreacties ethanol kan worden gemodelleerd in vliegen via diverse laboratorium testen (besproken in 3,4). Alle van de vlieg assays die tot op heden zijn gebaseerd op ofwel tijdsafhankelijke-ethanol geïnduceerde sedatie / coördinatiestoornissen of tijdsafhankelijke herstel van ethanol sedatie.
In een vorig artikel uit onze groep op de genetica van ethanol gevoeligheid en rAPID tolerantie in Drosophila, een gedrags-test op basis van ethanol-damp geïnduceerde sedatie van vliegen werd gebruikt 18. Testen in deze test is geïnitieerd door het overdragen van live adult vliegt zonder verdoving om voedsel flesjes leeg, het vangen van de vliegen in de injectieflacons met een celluloseacetaat stekker, het toevoegen van ethanol naar de top (dat wil zeggen, niet-fly kant) van de cellulose-acetaat stekker, en het afdichten van de flacon met vliegen, celluloseacetaat plug en ethanol met een siliconen stopper (zie schema in figuur S3, referentie 18). Meerdere flacons die verschillende groepen vliegen werden beoordeeld in parallel, waardoor doorvoer van deze assay. Flesjes kregen een anonieme code en onderzoekers waren blind voor de behandeling groep om onbedoelde bias in de beoordeling van de sedatie te voorkomen. In een standaard experiment, vliegen in flesjes werden voorzichtig aangetikt 6 min intervallen en, na 30 seconden herstel, het aantal verdoofd vliegen in elk flesje werd geteld en Converted om procent actief vliegen. Vliegen geabsorbeerd ethanol damp uit het celluloseacetaat sluit een tijdsafhankelijke wijze, waardoor toenemende verhoging van interne ethanol 18 en sedatie (zie verwijzing 18 en figuur 1A en 1B in dit verslag). Sedatie in deze test werd operationeel gedefinieerd als vliegen (i) staan in de afwezigheid van wandelen of (ii) liggend op hun rug, met of zonder klapperen met hun vleugels. Hier wordt deze ethanol sedatie assay beschreven, verder operationele optimalisering te gebruiken relevant verstrekt, en de test wordt gebruikt om de bijdrage van voedingssupplement opties aan fly sedatie gevoeligheid pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Day Before Assay
- Verzamel ongedierte in vers voedsel flesjes in groepen van 11 (van hetzelfde geslacht) onder kort (1-5 min) CO 2.
- Laat vliegen om te herstellen O / N in voeding flesjes op een milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte (meestal 25 ° C, 60% relatieve vochtigheid, 12 uur licht / donker-cyclus).
- Bereid ethanoloplossing (en) door verdunnen zuivere (100%) in ethanol gezuiverd (≥18 MQ) water tot eindconcentratie (s) voor de geplande experiment. Laat de oplossing (en) terugkeren naar kamertemperatuur O / N.
Opmerking: Verdunning ethanol is exotherm.
2. Dag van Assay
- Voor elke injectieflacon vliegen te testen, bereid (i) een schone, lege voedsel vial; wil zeggen een controle flesje, (ii) een nieuwe celluloseacetaat plug, (iii) een siliconen stop en (iv) 1 ml ethanol oplossing (zie tabel 3).
- Bereid testkamer door aanpassing temperatuur tot 20-25 ° C en relatieve vochtigheid van 55-65%.
- Hebben een andere werknemertoewijzen van een unieke code voor elke groep flesjes en noteer de code voor later. Plaats gecodeerd flesjes met vliegen in de testkamer te acclimatiseren voor een paar minuten.
- Label lege testen flesjes om codes op vlieg flesjes passen van 2,3.
- De bouw van een hard copy testen logboek door in een spreadsheet vergelijkbaar met tabel 1 het invoeren van de codes in kolommen (één kolom / flacon).
- Met behulp van de testen log als een gids, regelen gecodeerd voedsel flesjes met vliegen en lege testen flesjes in bijpassende arrays in de testkamer.
Opmerking: Een redelijk maximum aantal flesjes om te testen is 24 (dwz, 6 sets van 4 flesjes per stuk). - Transfer vliegt van voedsel flacons in geëvenaard / label leeg testen flesjes en steek onmiddellijk celluloseacetaat stekkers in het testen van flesjes tot celluloseacetaat stekkers zijn 2 cm onder de flacon toppen.
- Hierna behandelen elke rij van vier flesjes als een set bij gespreide 1 min intervallen.
- Voor de tijd 0 beoordeling, pakt elk flesje individueel wet duim en wijsvinger, tik zachtjes op de tafel drie keer om vliegen te kloppen op de bodem van de flacon, wacht 30 seconden en dan tellen het aantal vliegen die immobiel / dood zijn. Noteer het aantal immobiele / dode vliegen voor elk flesje op tijdstip 0 min in de hardcopy testen log.
- Start timer tellen voortdurend op tijdstip 0 en onmiddellijk beginnen met het toevoegen van 1 ml ethanol aan celluloseacetaat pluggen in de flesjes voor de eerste rij / set van 4 flesjes. Voeg 1 ml ethanol aan het celluloseacetaat pluggen in de flesjes bij 5 sec intervallen in de volgorde waarin ze worden getest. Ethanol Aan het celluloseacetaat pluggen in een cirkelvormige beweging, zodat de ethanol gelijkmatig geabsorbeerd gehele celluloseacetaat pluggen. Wanneer ethanol is toegevoegd aan alle 4 testen flesjes in de set, plaatst u een siliconen plug in elk flesje om het te verzegelen.
- Soms 1, 2, 3, 4 en 5 min, voeg 1 ml ethanol aan de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets van 4 flesjes resp. Doorgaan invoegen van siliconen stoppers nahet toevoegen van ethanol aan elke set van 4 flesjes.
- Op het moment 6 min, test de eerste set van 4 flesjes door grijpen iedere flacon met duim en wijsvinger, tikken zachtjes op de tafel drie keer om vliegen te kloppen op de bodem van de flacon, wacht 30 seconden en dan tellen en registreren van het totale aantal vliegen die worden verdoofd. Score vliegt als verdoofd als ze (i) op de bodem van de flacon staan, maar niet lopen of (ii) liggen op hun rug, met of zonder klapperen met hun vleugels.
- Behandel elk flesje in de set op 5 sec intervallen met behulp van het schema in tabel 2.
- Soms 7, 8, 9, 10 en 11 min, test de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets flacons, respectievelijk, zoals voor de eerste set.
- Op tijdstip 12 min, test de eerste set van 4 flesjes opnieuw zoals beschreven in 2.12 en verder testen van de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets flacons 13, 14, 15, 16 en 17 min, respectievelijk.
- Verder testen vliegen zoals beschreven in 2.12 tot alle vliegen zijn sedated.
- Voer het totale aantal vliegen in elk flesje in de hard copy testen log. Censureren immobiel / dode vliegen op tijdstip 0 van het totale aantal vliegen.
- Bereken het percentage actieve vliegt bij elke meting tijdpunt en plot gegevens% actief vliegen (y-as) versus tijd (x-as). Kwantificeren ethanol sedatie door interpolatie Sedatie Time 50 waarden (ST50, tijd tot 50% sedatie) vanaf derdegraads polynoom of sigmoïdale curve fits of geraamd gebied onder de curve.
- Gegevens verzamelen van gedecodeerd flacons en statistische analyses uit te voeren (bijvoorbeeld, one-way ANOVA met Bonferroni meervoudige vergelijkingstest) in voorkomend geval voor de experimentele opzet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ruwe gegevens van het ethanol sedatie assay het aantal vliegen die gesedeerd als functie van ethanoldamp belichtingstijd. Ruwe gegevens worden omgezet naar het percentage actieve vliegen als functie van de tijd (primaire gegevens Figuren 1A, B, D - F). Gevoeligheid voor ethanol sedatie van de primaire gegevens kunnen worden gekwantificeerd zoals sedatie Time 50 (ST50), de tijd die nodig is voor 50% van vliegen tot verdoofd of aea onder de curve (AUC) worden via interpolatie van curve past. Eerder meldde 18 van de derde orde polynoom curves passen bij de primaire data goed als verwacht (gemiddeld R2 = 0,934, n = 24, figuur 1A), hoewel sigmoidale bochten passen bij de primaire data iets beter (gemiddeld R2 = 0,997, n = 24; Figuur 1B). Als alternatief voor het bepalen ST50 waarden curve fits, kan ethanol sedatie gevoeligheid van de primaire gegevens worden gekwantificeerd als areaonder de curve (AUC% actieve vliegt x tijd) (Figuur 1C). De resultaten van deze drie methoden van kwantificering correleren zeer goed met elkaar (Pearson r 2 ≥0.998, n = 24) en kenmerken ononderscheidbaar (figuur 1C), hoewel de eenheden noodzakelijkerwijs verschillend voor ST50 (min) en AUC (% actief vliegt x tijd). Details met betrekking tot alle berekeningen, spreadsheets gebruikt, enz. Zijn verkrijgbaar bij de desbetreffende auteur. Merk op dat hogere en lagere waarden van de ST50 (of AUC) geven afgestompt en verbeterde gevoeligheid voor sedatie ethanol, respectievelijk. Voor de samenhang met het vorige verslag 18, werden ST50 waarden afgeleid van de derde orde polynoom curve past gedurende de rest van dit study.Importantly gebruikt, de test van de effecten van RNAi tegen Cnx14D (figuur 1D) en mutaties in SCB detecteert (figuur 1E) , Aru en hppy (Figuur 1F),
Tijdens het routinematig gebruik van deze test tikken flacons met celluloseacetaat pluggen bevochtigd met 2 ml ethanol veroorzaakte het celluloseacetaat pluggen naar de bodems van sommige flesjes reizen in enkele afzonderlijke experimenten (niet getoond) en mogelijk veranderen vrij vliegen " ruimte en de concentratie van ethanol damp. Bovendien, ongeveer 0,25 ml van ethanol tot de bodem (dwz vlieg zijde) van het celluloseacetaat stekkers wanneer ze bevochtigd werden met 2 ml ethanol (figuur 2A), waardoor de mogelijkheid dat vliegt deze assays werden blootgesteld aan vloeistof ethanol daarnaast aan damp ethanol. Verkleinen van de hoeveelheid ethanol in het celluloseacetaat stekker uit 2 ml tot 1 ml geëlimineerd de neerwaartse migratie van de cellulose acetaat pluggen gedurende de assay zelfs na krachtig tappen (niet getoond) en eveneens geëlimineerd meetbare hoeveelheden ethanol oplossing op de bodem van celluloseacetaat stekkers (Figuur 2A). Sedatie vliegen was gevoelig voor de hoeveelheid ethanol die ook bij volumes van minder dan 1 ml (Figuur 1A - C). Met 1 ml ethanol draagt zodoende voortdurend open ruimte voor vliegen tijdens de assay houden en zorgt ervoor dat vloeistof ethanol niet wordt ingenomen. Vliegen zijn dus vermoedelijk blootgesteld uitsluitend ethanol als een damp in deze test. Eén ml van 85% ethanol (dwz damp van 1 ml 85% (vol / vol) ethanol) en 1-5 dagen oude w [A] vliegen werden gebruikt in alle latere studies hier gerapporteerd, tenzij anders aangegeven.
In experimenten met 24 flacons, zijn vliegen zachtjes tikken op 6 min intervallen om de experimentator te beoordelen (dat wil zeggen, doorlopen) alle flesjes op een redelijke, voorgeschreven schedule. ST50s uit studies met controle vliegen met minder injectieflacons en 5 min intervallen waren vergelijkbaar ST50s uit studies met 6 min intervallen (gegevens niet getoond). Vliegen worden beoordeeld voor sedatie 30 seconden na tikken de experimentator tijd te geven een viertal flacons opeenvolgende tikken voor het bepalen van de sedatie status van de vliegen per flacon. Om te bepalen of de verschillen in te tikken kracht of hersteltijd na botsing ethanol sedatie gevoeligheid, ST50 waarden in mannelijke en vrouwelijke controle vliegen tikken werden gemeten terwijl afgeluisterd normaal (Regular) of zeer sterk (Hard) en na een standaard 30 sec of langer 60 sec herstel. Tapping kracht (figuur 2B) en hersteltijd (figuur 2C) geen meetbaar effect op ST50 waarden in controle mannen of vrouwen.
Antibiotica worden gebruikt om bacteriegroei in vlieg voedsel medium onderdrukken. Om te bepalen of de aanvulling van het voedsel medium met antibiotica beïnvloedt ethanol sedatie gevoeligheid,ST50 waarden werden gemeten in vliegen kweekperiode van één generatie in aanwezigheid of afwezigheid van drie antibiotica (ampicilline 100 pg / ml; tetracycline 20 ug / ml, chlooramfenicol, 125 ug / ml). Grootbrengen vliegen op deze drie antibiotica geen effect op ethanol sedatie gevoeligheid (Figuur 2D).
Vliegen worden overgebracht naar lege voedsel-flesjes en daarom geen voedsel en water gedurende ~ 5 minuten onmiddellijk voor blootstelling aan ethanol damp in de sedatie assay. Om te bepalen of de tijd vliegen in lege voeding flesjes worden bewaard alvorens de analyse effecten ethanol sedatie gevoeligheid, werden vliegen uitgehongerd 6 uur (ten minste 70-voudig normale) en vervolgens ST50 werden gemeten. Honger 6 uur significant verlaagd ST50s bij zowel mannelijke als vrouwelijke controle vliegen (figuur 2E). Hoewel het effect van honger op ST50 relatief klein (9-14% in deze experimenten), de tijd vliegt SPEnd in lege flacons vóór blootstelling aan ethanol damp in de bepaling worden gehouden uniform over groepen binnen een experiment en tussen experimenten.
Laboratorium vlieg voedsel kan worden aangevuld met levende gist (bijvoorbeeld 18,20,23,24) de productie van nageslacht promoten. Bijvoorbeeld, voedsel flesjes aangevuld met levende gist (Saccharomyces cerevisiae) die volwassenen ouder dan die met hitte gedode gist of geen levende gist (vergelijk d10-d11, witte balken, Figuur 3A), maar het totale aantal nakomelingen geproduceerd gedurende 20 dagen niet te onderscheiden in flesjes aangevuld met levende en hitte gedode gist (Figuur 3A). Om te voorkomen dat gist produceren leven betekenisvolle hoeveelheden ethanol op vlieg levensmiddelensector, werden de effecten van levende gist op (i) ethanol in het voedsel medium, (ii) ethanol in vliegen en (iii) ethanol sedatie gevoeligheid vliegen gemeten. Eten medium aangevuld met levende gisten substructurenzienlijke hoeveelheden ethanol vergeleken met levensmiddelen aangevuld met hitte gedode of geen gist (Figuur 3B). Toch controle vliegen gekweekt op medium aangevuld met live, gedood of geen gist hadden zonder onderscheid lage concentraties van interne ethanol (Figuur 3C). Bovendien ethanol sedatie gevoeligheid was niet te onderscheiden in de controle vliegen gekweekt op medium aangevuld met warmte gedood of levend gist (Figuur 3D).
Figuur 1. (AC) Sedatie test data-analyse mogelijkheden. Controle w [A] vrouwtjes (w 1118 isogeen, Bloomington Indiana Drosophila Stock Center voorraad # 5905) werden blootgesteld aan damp uit de aangegeven volumes van 85% (vol / vol) ethanol. (A) Sedatie time-cursus data passen met derde Om veeltermen. (B)Sedatie tijdsverloop data passen sigmoïdale curves. (C) Ethanol sedatie gevoeligheid gekwantificeerd als (linker Y-as) ST50 geïnterpoleerde waarden van de derde orde polynomen en sigmoïdale bochten of (rechter Y-as) oppervlak onder de curve (AUC% actieve vliegen x tijd). Ethanol volume, maar niet analysemethode invloed ethanol gevoeligheid (twee-weg ANOVA, effect van volume, p <0,0001 gevolg analysemethode, ns; n = 8 / groep; AUC getransformeerd 1/100 met het verschil in grootte van de waarden). (DF) Representatieve tijdsverloop gegevens. (D) Expressie van Cnx14D RNAi in het zenuwstelsel (elav-Gal4 / v5597) stomp ethanol gevoeligheid ten opzichte van controles (v5597 / + en elav-Gal4 / + ). (E en F) Mutatie van s cb (SCB Vol2) en Aru (Aru 8,128) verbeterde ethanol sedatie gevoeligheid en mutatie van hppy (hppyKG5537) afgestompte ethanol sedatie gevoeligheid in vergelijking met controles. Gegevens in EF werden voorheen onder ST50 waarden 18.
Figuur 2. Beoordeling van bedrijfsparameters in de sedatie assay. (A) hoeveelheid ethanol in de bodem 2 mm van celluloseacetaat pluggen. Het volume ethanol toegevoegd aan de toppen van celluloseacetaat pluggen had een significant effect op de hoeveelheid ethanol die in een mock 60 min experiment (one-way ANOVA, p <0,0001 verplaatst naar de bodem 2 mm celluloseacetaat pluggen; * Bonferroni meervoudige vergelijkingstest, 2 ml vs 0 en 1 ml, p <0.05 n = 4). Ethanol werd gekwantificeerd als een verandering in massa van het celluloseacetaat pluggen. (B) Geen kracht van de flesjes tikken tijdens de test (Regular, Hard) of geslacht van de vliegen geteste aangetaste ST50s (twee-way ANOVA; effect van tikken, ns; effect van geslacht, ns; n = 12) (C) Noch hersteltijd na aantikken noch geslacht significante effecten op ST50s (twee-weg ANOVA gehad;. effect van de hersteltijd, ns; effect van geslacht, ns;. n = 6) (D) Opname van antibiotica (ATC; ampicilline, tetracycline en chlooramfenicol) in het groeimedium had geen totale effect op ST50s, maar er was een effect van geslacht op de ST50 (twee-weg ANOVA; effect van ATC, ns; effect van geslacht, p = 0,001; interactie , ns;. n = 6) (E) Effect van de honger op ethanol sedatie gevoeligheid. ST50s waren significant lager in vliegen geen voedsel en water gedurende 6 uur (uitgehongerde) vergeleken met normaal gevoed (Fed) voert; ST50s bij mannen en vrouwen waren niet te onderscheiden algehele (two-way ANOVA; effect van de honger, p <0,0001; effect van geslacht, ns; n = 12; * Bonferroni meerdere vergelijkingstests effect van de honger bij mannen en vrouwen, p <0,05) .
Figuur 3. Effect van levende gisten op de groei, ethanol en sedatie gevoeligheid. (A) volwassen nakomelingen van flesjes met voedsel medium aangevuld met geen gist (Nee J), hitte gedode gist (Killed Y) of levende gisten (Live Y). Witte balken, volwassen nakomelingen opkomende tijdens dagen 10-11; grijze balken, dagen 12-20. Over het algemeen, gist behandeling had een significant effect op het nageslacht productie (one-way ANOVA's; alle (10-20) dagen, p <0,0001; dagen 10-11, p <0,0001; dagen 12-20, p = 0,0002; n = 5 ). Totaal aantal nakomelingen geproduceerd gedurende alle (20/10) dagen was groter van flacons met gedood Y en Live Y dan Nee Y (Bonferroni meervoudige vergelijkingstest, p <0.05). Tijdens de dagen 10-11, flesjes met Live Y produceerde meer nakomelingen dan Killed Y en flacons met Killed Y produceerde meer nakomelingen dan geen Y (witte balken, Bonferroni meerdere vergelijkende tests, p <0,05). Tijdens de dagen 12-20, flesjes with gedood Y produceerde meer nakomelingen dan flesjes met geen Y of live Y (grijze balken, Bonferroni meervoudige vergelijkingstest, p <0,05). (B) Ethanol in het eten medium was significant hoger in flesjes aangevuld met Live Y vergeleken flesjes met No Y en Y Gedood (one-way ANOVA, p <0,0001, n = 5; Bonferroni meervoudige vergelijkingstest, p <0,05) (C) Interne ethanol w [A] vrouwtjes werd niet significant beïnvloed door aanvulling met gist (een. -weg ANOVA, ns, n = 5-10). Ethanol gehalte in B en C bepaald als beschreven 18 (D) ST50 waarden werden niet significant beïnvloed door de aanvulling van het groeimedium met gist in mannelijke of vrouwelijke w [A] (twee-weg ANOVA;. Effect van gist, ns; effect geslacht, ns; n = 12).
| flacon → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| code → | ||||||||
| totaal # → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 min | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tabel 1: Typische testen log. Zie protocol stap 2.5.
| Fiool | Tap | Schatten |
| 1 | 6 min 0 sec | 6 min 30 sec |
| 2 | 6 min 5 sec | 6 min 35 sec |
| 3 | 6 min 10 sec | 6 min 40 sec |
| 4 | 6 min 15 sec | 6 min 45 sec |
Tabel 2:. Typische tikken en testschema Zie protocol stap 2.13.
| Naam van het product / Apparatuur | Vennootschap | Catalogusnummer | Opmerkingen / Omschrijving |
| voedsel flacons | VWR | 89092-772 | smal |
| Flugs | Genesee / VL STuff.com | 49-102 | smal |
| siliconen stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| ethanol | Farmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
Tabel 3: Materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ongecompliceerde testen die reproduceerbaar kwantificeren zinvolle fenotypes zijn van grote waarde voor de analyse van het gedrag. De hier beschreven werkzaamheden hebben betrekking op een aantal praktische aspecten van een test voor het meten van ethanol sedatie gevoeligheid en snelle tolerantie in Drosophila. Hoewel het niet een focus van dit werk, zijn gedragsanalyses bevorderd door het handhaven van het milieu en de genetische achtergrond constante voor proefpersonen in een studie. Bovendien moet vergelijkingen typisch gemaakt tussen groepen vliegen gehouden en getest side-by-side. Hiertoe alle vliegen binnen afzonderlijke experimenten in dit werk had dezelfde genetische achtergrond en zijn gehouden naast elkaar onder gelijke omgevingsomstandigheden (25 ° C, 60% relatieve vochtigheid, 12 uur licht / donker cyclus) met standaard voedsel medium (10 % sucrose, 3,3% maïsmeel, 2% gist en 1% agar) met uitzondering van die experimenten waarin het levensmiddel medium werd expliciet gemanipuleerd.
De ethanol sedatie assay beschreven vereist zeer weinig materialen (plastic flesjes, celluloseacetaat pluggen, siliconen stop en ethanol), die alle zijn goedkoop en gemakkelijk verkrijgbaar uit commerciële bronnen (Tabel 3). Dit ethanol sedatie test is vergelijkbaar en grotendeels gebaseerd op eerder beschreven werkwijzen (bijv 6,20,25-27, uitgebreid beoordeeld in 3,28). Hoewel al deze assays zijn bruikbaar voor het meten ethanol sedatie gevoeligheid voordelen van de test hier beschreven omvatten (i) vliegen worden geen vloeistoffen ethanol tijdens de assay blootgesteld, (ii) de verminderde mogelijkheid dat vliegen kunnen verstrikt in katoen of ander materiaal worden bij het testen flacon tijdens de assay, (iii) het vermogen om vele groepen vliegen testen in parallel, en (iv) drie opties voor het doel kwantificatie ethanol gevoeligheid van primaire gegevens. Samen vormen deze voordelen grotendeels elimineren de mogelijkheid dat ethanol drinken vliegt, that ethanol zou nat de externe oppervlakken van vliegen waardoor hun algemene motorische vaardigheden te remmen, en dat de prestaties van vliegen in de test kan worden verstoord door problemen in verband met verstrikken materiaal in de testomgeving. Bovendien, deze voordelen verhogen de totale doorvoer en reproduceerbaarheid van de test. Verder wordt ethanol gevoeligheid gemeten in deze test niet beïnvloed door de expressie van endogene wit of de transgene marker mini-wit 18, waardoor het geschikt is voor studies met transgenen en genetische achtergronden vaak gebruikt in Drosophila genetische analyses.
Enkele belangrijke parameters worden gecontroleerd om betrouwbare resultaten ethanol sedatie assays verkrijgen. Naast het regelen van de groei milieu en genetische achtergrond van stammen getest (zie hierboven), het volume en de concentratie van ethanol uiteraard zeer belangrijk voor de kwantificering van ethanol Sensitivity. Merk op dat de verdunning van ethanol in water is exotherm. Bijgevolg moeten verdunde ethanol oplossingen worden toegestaan om in evenwicht te RT voorafgaand aan de inleiding van sedatie assays. Een extra parameter die moet worden uniform over de groepen te testen is de tijdsduur die vliegen worden ondergebracht in de lege voeding flesjes voorafgaand aan het starten van de sedatie assay. Twee extra parameters moeten worden beheerst. Het aantal vliegen per flacon idealiter (a) hetzelfde in alle flesjes en groepen, (b)
Een getal dat gemakkelijk snel kunnen worden geteld, en (c) een aantal groot genoeg zijn om een relatief glad sedatie tijd gangen. Elf vliegt / flacon werkt goed in ons laboratorium en is een voorgestelde uitgangspunt. Een laatste parameter om te overwegen is de leeftijd van de gebruikte materialen in sedatie assays vliegen. Hoewel er geen reproduceerbare effecten van leeftijd op ethanol sedatie gevoeligheid 1-10 dagen oude vliegen werd gevonden (gegevens niet getoond), het gebruik van jonge vergelijkbare leeftijd dieren lijktgerechtvaardigd gezien de grote literatuur over leeftijdsgebonden gedragsveranderingen bij vliegen 29,30.
Andere parameters lijken niet zo kritisch sedatie assays, althans bij het testen controle vliegen met de reeksen parameters beschreven. Geslacht, kracht van tikken, hersteltijd uit te tikken, en suppletie van vlieg voedsel met antibiotica (ampicilline, tetracycline en chlooramfenicol) of levende gisten, kunnen niet afdoen ethanol gevoeligheid gemeten zoals hier beschreven. Ook kwantificeren ethanol gevoeligheid door interpolatie van de derde orde polynoom curves, interpolatie van sigmoïdaal bochten, of de bepaling van de AUC van de primaire sedatie time-cursus data leidt tot een in wezen niet te onderscheiden interpretaties. Hoewel geen effect van geslacht consistent waargenomen in de hier beschreven studies zijn effecten van sex ethanol gevoeligheid in verschillende Drosophila genetische achtergronden gerapporteerd 31. Aldus is het mogelijk dat seks effecten warengewoon gemaskeerd door genetische variatie in de w [A] achtergrond hier gebruikt. Alternatief is het mogelijk dat het meten sex gevolgen gedragsreacties in Drosophila vereisen nog niet geïdentificeerde assay of kweekomstandigheden. In ieder geval, de aanbeveling om alle parameters zo uniform mogelijk sedatie assays, waaronder het geslacht van een groep expliciet vergeleken.
Gezien het feit dat levende gisten produceren grote hoeveelheden ethanol in fly eten, het was enigszins verrassend dat suppletie van voedsel met levende gisten niet toegenomen interne ethanol in vliegen. Een mogelijke verklaring is dat de ethanol niet uniform wordt geproduceerd over het oppervlak van het voedsel en vliegt kan derhalve selectief innemen voedsel met geen of betrekkelijk lage concentraties ethanol. Bijkomende studies zullen nodig zijn om deze en andere mogelijke verklaringen voor deze bevinding te pakken.
Een groot aantal wijzigingen in de test described hier zijn mogelijk afhankelijk van de doelstellingen van het experiment uitgevoerd. Bijvoorbeeld, het aantal flacons getest in een experiment, het aantal vliegen getest in elk flesje, de concentratie en het volume van ethanol gebruikt, de blootstellingsduur ethanol, het tijdsinterval tussen sedatie evaluaties, de leeftijd en het geslacht van de vliegen geteste en de criteria voor sedatie kunnen allemaal worden aangepast aan de behoeften van een individuele laboratorium passen. De aanbeveling is om te beginnen met één of twee groepen van vier flesjes bij de eerste leren van de assay en opschalen met het cijfer flacons de doorvoersnelheid die voor het project verschaft. Mocht onverhoopt korte of lange ST50s opgemerkt, zou goede praktijk om het test- vliegen werden blootgesteld aan korte (1-5 min) verdoving tijden, mochten herstellen van anesthesie O / N werden minder dan 10 dagen oud waren niet fysiek beschadigd tijdens de behandeling, werden niet bevochtigd door ethanol-oplossing, en geen motorische beperkingen hebben.
Alleen en dus de test meet ethanol sedatie gevoeligheid is niet ontworpen of geschikt is voor het beoordelen van andere gedragsreacties op ethanol. Net als alle bekende ethanol gedragsproblemen paradigma in vliegen, deze test vereist vliegen grotendeels normale motorische vaardigheden hebben en genotypes daarom met een gestoorde motoriek dient niet te worden getest. Een andere beperking van de bepaling is dat de concentratie van ethanol damp in de flacon is vermoedelijk continu stijgt als geneesmiddel vervluchtigt uit het celluloseacetaat plug. Hoewel interne ethanol de vliegen 'stijgt geleidelijk met de tijd in alle vliegen ethanol gedrags-assays, lijkt het mogelijk dat het leveren van een vaste concentratie van ethanol damp om vliegen de consistentie van de resultaten van deze test zou kunnen verbeteren. Een werkwijze voor afgifte van een vaste concentratie van ethanol damp is nog niet vastgesteld zou de test wordt gebruikt de hier beschreven schaal.
De ethanol sedatieassay beschreven is zeer geschikt voor genetische analyse van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie 18. Groei milieu, genetische achtergrond, de concentratie en het volume van ethanol, de tijd vliegt brengen in lege voeding flesjes, en het aantal en de leeftijd van vliegen die moeten allemaal worden gecontroleerd. Ervan uitgaande dat deze parameters worden afdoende beheerst, moet de sedatie assay geschikt zijn voor zowel achteruit en vooruit genetische benaderingen die de moleculaire basis voor gedragsreacties naar ethanol in Drosophila onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
