Abstract
Trastorno por consumo de alcohol (AUD) es un grave problema de salud. A pesar de un gran componente hereditario AUD, algunos genes se han implicado de forma inequívoca en su etiología. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un poderoso modelo para explorar los mecanismos moleculares que subyacen a los comportamientos genéticos relacionados con el alcohol y por lo tanto representa una gran promesa para la identificación y la comprensión de la función de los genes que influyen en AUD. El uso del modelo de Drosophila para estos tipos de estudios depende de la disponibilidad de ensayos que miden de forma fiable respuestas de comportamiento a etanol. Este informe describe un ensayo adecuado para evaluar la sensibilidad de etanol y rápida tolerancia en las moscas. Sensibilidad etanol medido en este ensayo está influenciada por el volumen y la concentración de etanol utilizado, una variedad de manipulaciones genéticas se informó anteriormente, y también la longitud de tiempo que las moscas se alojan sin alimentos inmediatamente antes de la prueba. En contraste, el etanol sensitivity medido en este ensayo no se ve afectada por el vigor de la manipulación de la mosca, el sexo de las moscas, y la suplementación de medio de crecimiento con antibióticos o levaduras vivas. Tres métodos diferentes para cuantificar la sensibilidad de etanol se describen, todo lo cual lleva a los resultados de sensibilidad etanol esencialmente indistinguibles. La naturaleza escalable de este ensayo, junto con su simplicidad general de puesta a punto y relativamente de bajo costo, lo hacen adecuado para el análisis genético pequeña y gran escala de sensibilidad etanol y rápida tolerancia en Drosophila.
Introduction
Trastorno por consumo de alcohol (AUD) es un enorme problema de salud en todo el mundo (revisado en 1). Aunque los mecanismos que impulsan el desarrollo de AUD son complejos, estos trastornos tienen un componente genético importante (por ejemplo, 2). La gran heredabilidad de la AUD y las respuestas conductuales conservadas en etanol a través de muchas especies (revisado en 3,4) han generado un gran interés en el uso de organismos modelo genético para investigar la participación de genes específicos en los comportamientos relacionados con etanol hacia una mejor comprensión de las bases moleculares de AUD. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha convertido en un organismo líder en modelo para explorar los mecanismos moleculares genética de los comportamientos relacionados con etanol (revisado en 3,4). Los estudios en moscas han puesto de relieve los roles de varias vías de señalización en las respuestas conductuales a etanol (revisado en 5). Curiosamente, algunos de los genes y las vías que influir respons conductualeses a etanol en las moscas también se han implicado en los comportamientos relacionados con etanol de roedores y / o AUD humano (por ejemplo, 6-14). La conservación de los mecanismos de los comportamientos relacionados con la conducción de etanol a través de especies, junto con la suite de herramientas genéticas disponibles en el sistema modelo de Drosophila, ponen de relieve la utilidad del modelo de mosca de la fruta para la investigación de la genética de las respuestas de comportamiento a etanol.
Sensibilidad 15,16 y la tolerancia (revisado en 17) a etanol en los seres humanos está relacionada con el desarrollo de AUD. Ambas de estas respuestas de comportamiento a etanol puede ser modelado en las moscas a través de una variedad de ensayos de laboratorio (revisado en 3,4). Todos los ensayos de moscas que se sabe que los autores se basan en cualquiera de tiempo-dependiente inducida por etanol sedación / falta de coordinación o de recuperación en función del tiempo de sedación etanol.
En un artículo anterior de nuestro grupo sobre la genética de la sensibilidad de etanol y rtolerancia apid en Drosophila, se usó un ensayo de comportamiento basados en etanol sedación inducida por vapor de moscas-18. Prueba en este ensayo se inició mediante la transferencia de adulto vivo vuela sin anestesia para vaciar viales de alimentos, atrapando las moscas en los viales con un tapón de acetato de celulosa, la adición de etanol a la parte superior (es decir, el lado no-fly) de la bujía de acetato de celulosa, y sellar el vial que contiene moscas, tapón de acetato de celulosa y el etanol con un tapón de silicona (véase el esquema de la Figura S3, referencia 18). Viales de múltiples que representan los diferentes grupos de moscas fueron evaluados en paralelo, aumentando el rendimiento de este ensayo. Los viales se les dio un código anónimo y experimentadores estaban cegados al grupo de tratamiento para evitar el sesgo no intencional en la evaluación de la sedación. En un experimento estándar, moscas en viales se golpeó suavemente a intervalos de 6 min y, después de una recuperación de 30 segundos, se contó y converte el número de moscas sedados en cada viald para ciento moscas activos. Las moscas absorben vapor de etanol a partir de la clavija de acetato de celulosa de una manera dependiente del tiempo, causando aumentos progresivos en etanol interno 18 y sedación (referencia cf 18 y la Figura 1A y 1B en este informe). Sedación en este ensayo se define operacionalmente como moscas (i) de pie en la ausencia de caminar o (ii) que se encuentra en la espalda con o sin batir sus alas. Aquí, este ensayo sedación etanol se describe en detalle, se proporciona una mayor optimización operativa relevante para su uso, y el ensayo se utiliza para tratar la contribución de opciones de administración de suplementos de alimentos sobre la sensibilidad a la sedación mosca.
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Protocol
1. Día Antes de Ensayo
- Recoger moscas en viales de alimentos frescos en grupos de 11 (solo sexo) bajo breve (1-5 min) CO 2.
- Permitir que las moscas se recuperen O / N en viales de alimentos en un espacio con ambiente controlado (normalmente 25 ° C, humedad relativa del 60%, 12 horas de luz / oscuridad ciclo).
- Preparar la solución de etanol (s) diluyendo puro (100%) de etanol en (≥18 MΩ) agua purificada hasta una concentración final (s) apropiado para el experimento planeado. Deje que la solución (s) para volver a RT O / N.
Nota: La dilución de etanol es exotérmica.
2. Día de Ensayo
- Para cada vial de moscas a ensayar, preparar (i) un vial limpio y vacío de alimentos; es decir, las pruebas de vial, (ii) un nuevo tapón de acetato de celulosa, (iii) un tapón de silicona y (iv) 1 ml de solución de etanol (véase la Tabla 3).
- Preparar sala de pruebas mediante el ajuste de la temperatura a 20-25 ° C y humedad relativa de 55-65%.
- Haga que otro trabajadorasignar un código único a cada grupo de viales y registrar el código para más tarde. Colocar los viales codificados con moscas en sala de pruebas para aclimatarse durante unos minutos.
- Etiquetar viales de ensayo vacías para que coincida con los códigos de los viales de la mosca de 2,3.
- Construir un registro de las pruebas en papel mediante la introducción de los códigos en columnas (una columna / vial) en una hoja de cálculo similar a la Tabla 1.
- Utilizando el registro de las pruebas como guía, organizar viales alimentos codificados con las moscas y los viales de prueba vacíos en juego matrices en la sala de pruebas.
Nota: un número máximo razonable de viales para poner a prueba es de 24 (es decir, 6 juegos de 4 viales de cada uno). - Transferencia vuela desde viales de alimentos en pareados viales de ensayo vacío / etiquetados e inserte inmediatamente tapones de acetato de celulosa en viales de prueba hasta tapones de acetato de celulosa son 2 cm por debajo de la parte superior del vial.
- De aquí en adelante, manejar cada fila de cuatro viales como un conjunto a intervalos escalonados min 1.
- Para la evaluación de tiempo 0, sujete cada vial individual wITH pulgar y el dedo índice, toque suavemente sobre la mesa tres veces para golpear las moscas a la parte inferior del vial, espere 30 segundos y luego contar el número de moscas que son inmóviles / muerto. Anote el número de moscas inmóviles / muertas para cada vial en el tiempo 0 min en el registro de la prueba en papel.
- Iniciar temporizador con cuenta de forma continua en el tiempo 0 y comenzar inmediatamente la adición de 1 ml de etanol a tapones de acetato de celulosa en los viales para la primera fila / juego de 4 viales. Añadir 1 ml de etanol para los tapones de acetato de celulosa en los viales a intervalos de 5 seg en el orden en que se pondrá a prueba. Añadir etanol para los tapones de acetato de celulosa en un movimiento circular de modo que el etanol se absorbe de manera uniforme a través de los tapones de acetato de celulosa. Cuando el etanol se ha añadido a todos los viales de prueba 4 en el conjunto, insertar un tapón de silicona en cada vial para sellarlo.
- A veces 1, 2, 3, 4 y 5 minutos, añadir 1 ml de etanol para el segundo tercio cuarto, conjuntos, quinto y sexto de 4 viales, respectivamente. Continúe insertando tapones de silicona despuésadición de etanol a cada conjunto de 4 viales.
- A la hora 6 minutos, probar la primera serie de 4 viales agarrando cada vial con el pulgar y el índice, golpeando suavemente sobre la mesa tres veces para golpear las moscas a la parte inferior del vial, espera 30 segundos y luego contar y registrar el número total de moscas que están sedados. Puntuación vuela como sedado si (i) se destacan en el suelo del vial, pero no caminan o (ii) se encuentran en la espalda con o sin batir sus alas.
- Maneje cada vial dentro del conjunto a intervalos de 5 segundos con el horario en la Tabla 2.
- A veces 7, 8, 9, 10 y 11 min, probar el segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto juegos de viales, respectivamente, como se hizo para el primer set.
- A la hora 12 min, probar la primera serie de 4 viales de nuevo como se describe en 2.12 y continuar probando la segunda tercera cuarta, conjuntos, quinto y sexto de viales a los 13, 14, 15, 16 y 17 minutos, respectivamente.
- Continuar pruebas moscas como se describe en 2.12 hasta que todas las moscas son sedated.
- Escriba el número total de moscas en cada vial en el registro de la prueba en papel. Censor moscas inmóviles / muertos en el tiempo 0 a partir del número total de moscas.
- Calcular el porcentaje de moscas activas en cada punto de tiempo de evaluación y datos de la parcela como% moscas activos (eje y) en función del tiempo (eje x). Cuantificar la sedación etanol mediante la interpolación de Sedación Tiempo 50 valores (ST50, el tiempo a 50% sedación) de tercer orden curva polinómica o sigmoidal encaja o el cálculo del área bajo la curva.
- Recopilar datos de viales decodificados y realizar análisis estadísticos (por ejemplo, un modelo lineal con Bonferroni test de comparación múltiple) según corresponda para el diseño experimental.
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Representative Results
Los datos brutos de este ensayo sedación etanol son los números de moscas que son sedados como una función de vapor de etanol tiempo de exposición. Los datos en bruto se convierten a las moscas por ciento activos como una función del tiempo (datos primarios, las figuras 1A, B, D - F). Sensibilidad a la sedación etanol a partir de los datos primarios se puede cuantificar como la sedación Tiempo 50 (ST50), el tiempo requerido para el 50% de las moscas para convertirse en sedado o AEA bajo la curva (AUC), a través de la interpolación de la curva se ajusta. Anteriormente reportaron 18 de tercer orden curvas polinómicas encajan los datos primarios, así como se espera (promedio R 2 = 0,934, n = 24, la Figura 1A), aunque las curvas sigmoideas se ajustan a los datos primarios algo mejores (media R 2 = 0,997, n = 24; Figura 1B). Como alternativa a la determinación de los valores de ajuste de la curva ST50, la sensibilidad sedación etanol a partir de los datos primarios también se puede cuantificar como área debajo la curva (AUC,% moscas Active X tiempo) (Figura 1C). Los resultados de estos tres métodos de cuantificación se correlacionan muy bien con los demás (Pearson r ≥0.998 2, n = 24) y son esencialmente indistinguibles (Figura 1C), aunque las unidades son necesariamente diferente para ST50 (min) y el AUC (% activo vuela x tiempo). Los detalles relativos a todos los cálculos, hojas de cálculo utilizados, etc. están disponibles del autor correspondiente. Tenga en cuenta que los valores más altos y más bajos de ST50 (o AUC) indican romos y aumento de la sensibilidad al etanol sedación, respectivamente. Para mantener la coherencia con el informe anterior 18, se utilizaron los valores ST50 derivados de tercer orden se ajusta la curva polinómica todo el resto de este study.Importantly, el ensayo detecta los efectos de RNAi contra Cnx14D (Figura 1D) y las mutaciones en scb (Figura 1E) , aru y hppy (Figura 1F),
Durante el uso rutinario de este ensayo, la grabación de los viales con tapones de acetato de celulosa contacto con el medio con 2 ml de etanol provocó el acetato de celulosa se conecta a viajar hacia las partes inferiores de algunos viales en unos pocos experimentos individuales (no mostrados), lo que potencialmente cambiando libre de las moscas el espacio y la concentración de vapor de etanol. Además, aproximadamente 0,25 ml de etanol llegado a la parte inferior (es decir, el lado volar) de los tapones de acetato de celulosa cuando se humedecen con 2 ml de etanol (Figura 2A), aumentando la posibilidad de que vuela en estos ensayos fueron expuestos a etanol líquido además a etanol vapor. Disminuyendo el volumen de etanol en el tapón de acetato de celulosa de 2 ml a 1 ml eliminado la migración descendente de los cellulostapones de acetato de E durante el ensayo, incluso después de tapping vigorosa (no mostrado) y también eliminó cantidades medibles de solución de etanol en los fondos de tapones de acetato de celulosa (Figura 2A). Sedación de moscas era sensible al volumen de etanol utilizado incluso con volúmenes de menos de 1 ml (Figura 1A - C). Uso de 1 ml de etanol, por tanto, ayuda a mantener un espacio abierto constante para moscas durante el ensayo y asegura que el etanol líquido no se ingiere. Las moscas son, por tanto, presumiblemente expuestos a etanol únicamente como un vapor en este ensayo. Un ml de etanol al 85% (es decir, vapor de 1 ml de 85% (vol / vol) etanol) y 1-5 días de edad w [A] moscas se utilizaron en todos los estudios posteriores reportados aquí a menos que se indique lo contrario.
En experimentos con 24 viales, las moscas están intervenidos suavemente a intervalos de 6 minutos para permitir que el experimentador para evaluar (es decir, el ciclo a través de) todos los viales en una, schedul prescrito razonablee. ST50s de los estudios con moscas de control usando un menor número de viales y los intervalos de 5 min fueron comparables a ST50s a partir de estudios con intervalos de 6 min (datos no mostrados). Las moscas son evaluados para la sedación 30 seg después de tocar para dar tiempo experimentador para aprovechar un conjunto de cuatro viales en secuencia antes de determinar el estado de sedación de las moscas en cada vial. Para determinar si se midieron las diferencias en aprovechar el vigor o el tiempo de recuperación después de tocar la sensibilidad sedación etanol impacto, valores ST50 en el control de moscas macho y hembra al ser girada normalmente (Regular) o muy bruscamente (duro) y después de 30 seg estándar o más 60 seg la recuperación. Vigor Tapping (Figura 2B) y el tiempo de recuperación (Figura 2C) no tuvieron ningún efecto mensurable sobre valores ST50 en los machos o hembras de control.
Los antibióticos pueden ser utilizados para suprimir el crecimiento bacteriano en medio alimenticio mosca. Para determinar si la suplementación del medio de alimentos con antibióticos afecta etanol sensibilidad sedación,Se midieron los valores de ST50 en las moscas criados para una generación en la presencia o ausencia de tres antibióticos (ampicilina, 100 mg / ml; tetraciclina, 20 mg / ml; cloranfenicol, 125 mg / ml). La cría de moscas en estos tres antibióticos no tuvieron ningún efecto sobre la sensibilidad a la sedación etanol (Figura 2D).
Las moscas se transfieren a viales de comida vacías y, por tanto, se ven privados de comida y agua para ~ 5 min-inmediatamente antes de la exposición al vapor de etanol en el ensayo de la sedación. Para determinar si la cantidad de moscas de tiempo se mantienen en viales vacíos de los alimentos antes de iniciar la sensibilidad sedación impactos de ensayo de etanol, las moscas se mantuvieron en ayunas durante 6 horas (al menos 70 veces mayor de lo normal) y luego se midieron los valores de ST50. El hambre durante 6 horas disminuyó significativamente en ambos ST50s control de moscas macho y hembra (Figura 2E). Aunque el efecto de la inanición en ST50 fue relativamente pequeño (9-14% en estos experimentos), la cantidad de tiempo vuela spend en viales vacíos antes de ser expuesto al vapor de etanol en el ensayo deben rendir uniforme en todos los grupos dentro de un experimento y también entre los experimentos.
Laboratorio de alimentos mosca se puede complementar con levaduras vivas (por ejemplo, 18,20,23,24) para promover la producción de progenie. Por ejemplo, los viales de alimentos suplementados con levadura viva (Saccharomyces cerevisiae) adultos producida antes que aquellos con la levadura muertas por calor o nada de levadura viva (comparar d10-d11, barras blancas, la Figura 3A), aunque el número total de progenie produjo más de 20 días era indistinguible en viales suplementadas con levaduras vivas y muertas por calor (Figura 3A). Para hacer frente a la posibilidad de que viven levaduras producen cantidades significativas de etanol en alimentos mosca, se midieron los efectos de la levadura en vivo en (i) de etanol en el medio de alimentos, (ii) etanol en las moscas, y (iii) la sensibilidad sedación etanol en las moscas. Medio Alimentos complementa con sub levadura viva contenidacantidades considerables de etanol en comparación con la comida suplementada con muertos por calor o no de levadura (Figura 3B). Sin embargo, las moscas de control crecido en medio suplementado con vivo, muerto o no de levadura tenido indistintamente bajas concentraciones de etanol interna (Figura 3C). Por otra parte, la sensibilidad sedación etanol era indistinguible en las moscas de control cultivados en el medio suplementado con muertos por calor o levaduras vivas (Figura 3D).
Figura 1. (AC) de ensayo Sedación opciones de análisis de datos. Control de w [A] hembras (w 1118 isogénico, Bloomington Indiana Drosophila Stock Center de valores # 5905) se expone a vapor de los volúmenes indicados de 85% (vol / vol) de etanol. Datos (A) Sedación tiempo-por supuesto encajan con terceros polinomios de orden. (B)Datos Sedación tiempo-por supuesto encajan con curvas sigmoideas (C) Etanol sedación sensibilidad cuantificó como (eje izquierdo) ST50 valores interpolados a partir de polinomios de tercer orden y curvas sigmoideas o área (eje derecho) bajo la curva (AUC,%. moscas activas x tiempo). Volumen de etanol, pero no método de análisis, la sensibilidad de etanol impactado (ANOVA de dos vías; efecto de volumen, p <0,0001; efecto de método de análisis, ns; n = 8 / grupo, los datos de AUC transformadas 1/100 para dar cuenta de la diferencia en magnitud de los valores). (DF) datos representativos de tiempo de cursos de las. (D) Expresión de Cnx14D RNAi en el sistema nervioso (elav-Gal4 / v5597) embotado etanol sensibilidad relativa a los controles (v5597 / + y elav-Gal4 / + ). (E y F) La mutación de s cb (Vol2 SCB) y aru (aru 8.128) mayor sensibilidad sedación etanol y la mutación de hppy (hppyKG5537) embota la sensibilidad sedación etanol en comparación con los controles. Los datos de EF fueron reportados previamente como valores ST50 18.
Figura 2. Evaluación de los parámetros de funcionamiento en el ensayo de la sedación. (A) Cantidad de etanol en la parte inferior de 2 mm de tapones de acetato de celulosa. El volumen de etanol añadido a la parte superior de tapones de acetato de celulosa tenía un efecto significativo en el volumen de etanol que se movía en el fondo 2 mm de tapones de acetato de celulosa durante una maqueta experimento 60 min (ANOVA de una vía, p <0,0001; * Bonferroni prueba de comparación múltiple, 2 ml vs 0 y 1 ml, p <0,05 n = 4). El etanol se cuantificó como un cambio en la masa de los tapones de acetato de celulosa. (B) Ni el vigor de aprovechar los viales durante la prueba (Regular, duro), ni el sexo de las moscas probado ST50s afectados (dos way ANOVA; efecto de la grabación, ns; efecto del sexo, ns; n = 12) (C) Ni el tiempo de recuperación después de tocar ni el sexo tenido efectos significativos en ST50s (ANOVA de dos vías;. efecto del tiempo de recuperación, ns; efecto del sexo, ns;. n = 6) (D) La inclusión de los antibióticos (ATC; ampicilina, tetraciclina y cloranfenicol) en el medio de crecimiento no tuvo ningún efecto global sobre ST50s, pero no hubo un efecto del sexo en ST50 (ANOVA de dos vías; efecto de ATC, ns; efecto del sexo, p = 0,001; interacción , ns;. n = 6) (E) Efecto de la inanición en la sensibilidad a la sedación etanol. ST50s fueron significativamente menores en las moscas privados de comida y agua durante 6 horas (Starved) en comparación con los alimentados normalmente (Fed) vuela; ST50s en machos y hembras eran indistinguibles general (ANOVA de dos vías; efecto de la inanición, p <0,0001; efecto del sexo, ns; n = 12; * Bonferroni para comparaciones múltiples pruebas, el efecto de la inanición en hombres y mujeres, p <0,05) .
Figura 3. Efecto de levadura viva en el crecimiento, contenido de etanol y la sensibilidad de la sedación. (A) progenie de Adultos de los viales que contenían medio de alimentos suplementados sin levadura (n Y), levadura muertos por calor (Killed Y) o levadura en vivo (Live Y). Las barras blancas, progenie adultos emergentes durante los días 10 a 11; barras grises, días 12-20. En general, el tratamiento de levadura tuvo un efecto significativo sobre la producción de progenie (un solo sentido ANOVAs; todos (10-20) días, p <0,0001; 10-11 días, p <0,0001; 12-20 días, p = 0,0002; n = 5 ). Número total de progenie producida durante todos los días (10-20) fue mayor de viales con Killed Y y vivo Y que n Y (prueba de comparación múltiple de Bonferroni, p <0,05). Durante los días 10 a 11, viales con Vivo Y producen más descendencia que Killed Y y viales con Killed Y producen más descendencia que n Y (barras blancas, de Bonferroni para comparaciones múltiples pruebas, p <0,05). Durante los días 12 a 20, viales wiº Killed Y produce más descendencia que los viales con No Y o Vivo Y (barras grises, prueba de comparación múltiple de Bonferroni, p <0,05). (B) de etanol en el medio de alimentos fue significativamente mayor en los viales complementados con Live Y en comparación con los viales con n Y y Killed Y (ANOVA de una vía, p <0,0001, n = 5; prueba de comparación múltiple de Bonferroni, p <0,05) (C) etanol Interna en w [A] moscas hembras no se vio afectada significativamente por la suplementación con levadura (una. -way ANOVA, ns, n = 5-10). Contenido de etanol en B y C determinó como se describe 18 (D) los valores ST50 no se vieron afectados significativamente por la suplementación del medio de crecimiento con la levadura en hombre o mujer w [A] (ANOVA de dos vías;. Efecto de levadura, ns; efecto de sexo, ns; n = 12).
| vial → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| código → | ||||||||
| # total → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 min | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tabla 1: Entrada de los análisis típicos. Vea el paso protocolo 2.5.
| Frasco | Grifo | Evaluar |
| 1 | 6 min 0 sec | 6 min 30 sec |
| 2 | 6 min 5 sec | 6 min 35 sec |
| 3 | 6 min 10 sec | 6 min 40 sec |
| 4 | 6 min 15 sec | 6 min 45 sec |
Tabla 2:. Tapping típica y calendario de pruebas Vea el paso protocolo 2.13.
| Nombre del material / Equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios / Descripción |
| frascos de alimentos | VWR | 89092-772 | estrecho |
| Flugs | Genesee / flystuff.com | 49-102 | estrecho |
| tapón de silicona | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| etanol | Fármaco-Aaper | 111000200 | 200 prueba |
Tabla 3: Materiales.
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Discussion
Ensayos sencillos que cuantifican reproducible fenotipos significativos son de gran valor para el análisis del comportamiento. El trabajo que se describe aquí aborda varios aspectos prácticos de un ensayo para medir la sensibilidad sedación etanol y rápida tolerancia en Drosophila. Aunque no es un tema central de este trabajo, análisis de comportamiento son facilitadas por el mantenimiento del medio ambiente y los antecedentes genéticos constante para los sujetos de prueba en un estudio. Además, por lo general se deben hacer comparaciones entre grupos de moscas criadas y de lado a lado probadas. Con este fin, todas las moscas dentro de experimentos individuales en este trabajo tenían el mismo origen genético y se criaron al lado del otro en condiciones ambientales uniformes (25 ° C, humedad relativa del 60%, 12 horas de luz / oscuridad ciclo) con medio alimento estándar (10 % de sacarosa, 3,3% de harina de maíz, 2% de levadura y 1% de agar), excepto para aquellos experimentos en los que el medio de alimentos se manipula de forma explícita.
El ethensayo de sedación anol descrito aquí requiere muy pocos materiales (viales de plástico, tapones de acetato de celulosa, tapones de silicona y etanol), todos los cuales son baratos y fácilmente disponibles de fuentes comerciales (Tabla 3). Este ensayo sedación etanol es similar y, en gran medida sobre la base de métodos reportados previamente (por ejemplo, 6,20,25-27, revisó exhaustivamente en 3,28). Aunque todos estos ensayos tienen utilidad para medir etanol sensibilidad sedación, ventajas del ensayo descrito aquí incluyen (i) las moscas no están expuestos a etanol líquido durante el ensayo, (ii) la posibilidad reducida que vuela puede enredarse en algodón u otro material en el vial pruebas durante el ensayo, (iii) la capacidad de probar muchos grupos de moscas en paralelo, y (iv) tres opciones para la cuantificación objetiva de la sensibilidad etanol a partir de conjuntos de datos primarios. En conjunto, estas ventajas eliminar en gran medida la posibilidad de que vuela bebida etanol, THAt etanol podría humedecer las superficies externas de las moscas inhibiendo con ello sus capacidades globales del aparato locomotor, y que el rendimiento de moscas en el ensayo podría ser confundida por dificultades asociadas con el material de enredo en el entorno de pruebas. Además, estas ventajas aumentan el rendimiento global y la reproducibilidad del ensayo. Además, la sensibilidad de etanol medido en este ensayo no se ve influenciada por la expresión endógena de blanco o el marcador transgénico-mini blanco 18, lo que es adecuado para los estudios con transgenes y fondos genéticos comúnmente utilizados en los análisis genéticos de Drosophila.
Varios parámetros clave deben ser controlados para obtener resultados fiables de los ensayos de sedación etanol. Además de controlar el entorno de crecimiento y el fondo genético de las cepas se está probando (ver arriba), el volumen y la concentración de etanol son, por supuesto, muy importante para la cuantificación de etanol sensitividad. Tenga en cuenta que la dilución de etanol en agua es exotérmica. En consecuencia, soluciones de etanol diluido se debe permitir que se equilibre a RT antes de la iniciación de los ensayos de sedación. Un parámetro adicional que debe hacerse uniforme a través de los grupos que se prueba es la longitud de tiempo que las moscas están alojados en viales vacíos de los alimentos antes de iniciar el ensayo de sedación. Dos parámetros adicionales también deben ser controlados. El número de moscas por vial debería ser idealmente (a) el mismo en todos los viales y de los grupos, (b)
un número que puede ser fácilmente contó rápidamente, y (c) un número lo suficientemente grande como para permitir cursos temporales de sedación relativamente suaves. Once vuela / vial funciona bien en nuestro laboratorio y es un punto de partida sugerido. Un parámetro final a considerar es la edad de las moscas utilizadas en los ensayos de la sedación. Aunque se han encontrado efectos reproducibles de la edad sobre la sensibilidad a la sedación etanol en 1-10 días de edad moscas (datos no mostrados), el uso de animales de la misma edad jóvenes parecejustificado dada la gran cantidad de literatura sobre los cambios de comportamiento relacionados con la edad en las moscas de 29,30.
Otros parámetros no parecen ser tan crítico en los ensayos de sedación, por lo menos cuando se prueban las moscas de control usando los rangos de parámetros descritos aquí. El sexo, la fuerza de la grabación, el tiempo de recuperación de la grabación, y la suplementación de alimentos mosca con antibióticos (ampicilina, tetraciclina y cloranfenicol) o levaduras vivas no alteran la sensibilidad de etanol medida como se describe aquí. Del mismo modo, la cuantificación de la sensibilidad de etanol por interpolación de curvas polinómicas de tercer orden, interpolación de curvas sigmoideas, o la determinación de AUC de los datos de tiempo-curso sedación primaria conduce a interpretaciones esencialmente indistinguibles. Aunque no hay efecto del sexo se observó consistentemente en los estudios descritos aquí, efectos del sexo en la sensibilidad de etanol en varios fondos genéticos de Drosophila se han reportado 31. Por lo tanto, es posible que los efectos del sexo eransimplemente enmascarado por la variación genética en la w [A] de fondo utilizado aquí. Alternativamente, es posible que la medición de los efectos sobre las respuestas de comportamiento de sexo en Drosophila requieren de ensayo o las condiciones de crecimiento aún no identificados. En cualquier caso, la recomendación es hacer que todos los parámetros de lo más uniforme posible en los ensayos de sedación, incluyendo el sexo de los grupos que se comparan de forma explícita.
Dado que la levadura viva producen importantes cantidades de etanol en los alimentos mosca, era un tanto sorprendente que la complementación de los alimentos con levadura viva no aumentó etanol interna en las moscas. Una posible explicación es que el etanol no se produce de manera uniforme por la superficie de la comida y vuela podrían ingerir por lo tanto selectivamente alimentos sin o con concentraciones relativamente bajas de etanol. Se requieren estudios adicionales para atender esta y otras posibles explicaciones para este hallazgo.
Un gran número de modificaciones a la describ ensayoed aquí son posibles en función de los objetivos de que se realiza el experimento. Por ejemplo, el número de viales de prueba en un experimento, el número de moscas ensayados en cada vial, la concentración y el volumen de etanol utilizado, la duración de la exposición de etanol, el intervalo de tiempo entre las evaluaciones de sedación, la edad y el sexo de las moscas prueba , y los criterios para la sedación pueden todos ser modificados para adaptarse a las necesidades de un laboratorio individual. La recomendación es empezar con uno o dos grupos de cuatro viales al aprender inicialmente el ensayo y luego escalar hasta utilizando el número de viales que proporciona el rendimiento necesario para el proyecto. Deben observarse ST50s inesperadamente corto o largo, que sería una buena práctica para garantizar que las moscas de ensayo se sometieron a corto (1-5 minutos) veces la anestesia, se les permitió recuperarse de la anestesia O / N, fueron menos de 10 días de edad, fueron no físicamente dañado durante la manipulación, no se humedecieron por solución de etanol, y no tienen impedimentos del aparato locomotor.
El ensayo mide etanol sensibilidad sedación solamente y por lo tanto no está diseñado o adaptado para evaluar otras respuestas conductuales a etanol. Al igual que todos los paradigmas de comportamiento conocido etanol en las moscas, este ensayo requiere moscas tener habilidades en gran parte normales del aparato locomotor y, por tanto, los genotipos con una alteración de la locomoción no debe ser probado. Otra limitación de este ensayo es que la concentración de vapor de etanol en el vial está presumiblemente aumentando continuamente a medida que se volatiliza el fármaco desde el tapón de acetato de celulosa. Aunque el etanol interna de las moscas se eleva progresivamente con el tiempo en toda la mosca de ensayos de comportamiento de etanol, parece posible que la entrega de una concentración fija de vapor de etanol a las moscas podría mejorar la consistencia de los resultados de este ensayo. Un método para la entrega de una concentración fija de vapor de etanol aún no se ha identificado que permitiría el ensayo que se utilizará en la escala descrita aquí.
La sedación etanolensayo descrito aquí es muy adecuado para el análisis genético de la sensibilidad etanol y rápida tolerancia 18. Entorno de crecimiento, los antecedentes genéticos, la concentración y el volumen de etanol, la cantidad de tiempo que pasan moscas en viales vacíos de los alimentos, y el número y la edad de moscas utilizadas deben ser controlados. Suponiendo que estos parámetros se controlan adecuadamente, el ensayo de la sedación debe ser adecuado tanto para revertir y reenviar enfoques genéticos que investigan las bases moleculares de las respuestas de comportamiento a etanol en Drosophila.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
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