Abstract
알코올 사용 장애 (AUD)는 건강에 심각한 도전이다. AUD로 큰 유전 요소에도 불구하고, 몇 가지 유전자는 분명하게 자신의 원인에 연루되어있다. 초파리, 초파리 melanogaster의는 알코올과 관련된 행동의 기초 분자 유전 메커니즘을 탐구하기위한 강력한 모델이므로 확인하고 AUD에 영향을 미치는 유전자의 기능을 이해하는 데 큰 약속을 보유하고있다. 이러한 유형의 연구를위한 모델 초파리의 사용은 안정적 에탄올 행동 반응을 측정하는 분석법의 가용성에 의존한다. 이 보고서는 파리에서 에탄올 감도와 빠른 내성을 평가하기위한 적절한 분석을 설명합니다. 이 분석에서 측정 에탄올 감도가 초파리 시험 직전 음식없이 수납되어 사용되는 부피의 에탄올 농도, 이전에보고 된 유전자 조작의 다양하고, 또한 시간의 길이에 의해 영향을 받는다. 한편, 에탄올 S이 분석에서 측정 ensitivity 플라이 처리, 파리의 성별, 항생제 또는 살아있는 효모와 성장 매체의 보충의 활력에 영향을받지 않습니다. 정량 에탄올 감도 세 가지 방법은 모두 본질적으로 구별 에탄올 감도 결과에 선도적 인 기술되어있다. 전반적인 단순 결합이 분석의 확장 성 성격, 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 업을 설정 초파리 에탄올 감도와 빠른 관용의 크고 작은 규모의 유전 적 분석에 적합하게합니다.
Introduction
알코올 사용 장애 (AUD)는 전 세계적으로 (1 검토) 거대한 건강 문제입니다. AUD의 개발 구동 메커니즘 복잡하지만, 이러한 장애는 유전 주요 구성 요소를 가지고 (예를 들어, 2). AUD 및 보존 행동 반응의 대형 유전은 더 나은의 분자 기초를 이해하는 방향으로 에탄올과 관련된 행동의 특정 유전자의 참여를 조사하기 위해 유전자 모델 생물을 사용하여 강한 관심을 생성 한 (3,4 검토) 많은 종에서 에탄올 AUD. 초파리, 초파리 melanogaster의는 (3,4 검토) 에탄올과 관련된 행동의 분자 유전 학적 메커니즘을 탐험을위한 선도적 인 모델 생물로 떠오르고있다. 파리의 연구 (5 검토) 에탄올 행동 반응의 여러 신호 전달 경로에 대한 역할을 강조했다. 흥미롭게도, 유전자 및 경로의 일부 행동 응 답에 영향을 미치는 그파리에서 에탄올 ES는 또한 설치류 에탄올과 관련된 행동 및 / 또는 인간 AUD (예 : 6-14)에 연루되어있다. 초파리 모델 시스템에서 사용할 수있는 유전 적 도구의 스위트 룸과 함께 종에서 에탄올과 관련된 행동을, 구동 메커니즘의 보존, 에탄올 행동 반응의 유전학을 조사를 위해 초파리 모델의 유틸리티를 강조한다.
감도 (15, 16)과 인간에 에탄올 (17에서 검토) 허용 오차는 AUD의 발전에 연결되어 있습니다. 에탄올 이러한 행동 반응은 모두 (3,4 검토) 실험실 분석의 다양한 통해 파리에서 모델링 할 수있다. 저자에게 공지 플라이 분석 모두에서 진정 에탄올 중 시간에 따른 에탄올 - 유도 진정 / 운동 실조 또는 경시에 기초하여 복구된다.
에탄올 감도 및 R의 유전학에 우리 그룹에서 이전 기사에서초파리 APID 공차는, 파리의 에탄올 증기 유도 진정 작용에 기초하여 행동 분석은 (18)을 사용 하였다. 이 분석에서 시험이 라이브 성인 전송함으로써 개시 하였다는 셀룰로오스 아세테이트 플러그의 상부 (즉, 비 - 플라이 측)에 에탄올을 첨가, 셀룰로오스 아세테이트 플러그 바이알에서 파리 트래핑 음식 바이알 비우기 마취없이 날아간 및 실리콘 스토퍼 파리, 셀룰로오스 아세테이트 플러그 및 에탄올을 함유하는 바이알을 밀봉 (18 참조,도에서 개략적 S3 참조). 파리의 상이한 그룹을 나타내는 여러 바이알이 분석의 처리량을 증가 병렬 평가 하였다. 유리 병은 익명의 코드를 부여하고 실험자은 진정 작용의 평가에 의도하지 않은 편견을 방지하기 위해 치료 그룹에 눈을 멀게했다. 표준 실험에서, 바이알에 30 초 복구 후 각 바이알에 진정 파리의 수를 계수하고 converte시키고, 6 분 간격으로 부드럽게 탭핑 하였다 파리%의 활성 파리에 D. 파리 내부 에탄올 18 진정제 (이 보고서의 참조 (18) 및 CF도 1a 및도 1b)에서 점진적인 증가를 일으키는 시간 의존적 방식으로 셀룰로스 아세테이트 플러그에서 에탄올 증기를 흡수. 이 분석에서 진정 운영 체제는 산책을하거나 (II) 또는 날개를 펄럭없이 뒤에 거짓말의 부재에서 파리 (I) 서로 정의 하였다. 여기서, 에탄올이 진정 작용 분석법 상세히 설명에는, 사용과 관련된 추가의 최적화 동작이 제공되며, 분석은 비행 진정 감도 음식 보충 옵션 기여를 해결하기 위해 사용된다.
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Protocol
분석 전에 1 일
- 짧은 (1-5 분) CO 2에서 11 (단일 섹스)의 그룹 신선한 식품 유리 병에 파리를 수집합니다.
- 파리는 환경 제어 공간에서 음식을 유리 병에 (일반적으로 25 ° C, 상대 습도 60 %, 12 시간 빛 / 어둠 사이클) O / N을 복구 할 수 있습니다.
- 계획된 실험에 적합한 최종 농도 (들)에 정제 (≥18 MΩ) 물에 순수 (100 %) 에탄올을 희석하여 에탄올 용액 (들)을 준비합니다. 솔루션 (들) RT O / N로 복귀 할 수 있습니다.
참고 : 에탄올의 희석은 발열이다.
분석 2. 일
- 파리의 각 바이알을 테스트하려면, 깨끗하고 빈 식품 유리 병을 (i)를 준비; 즉, 검사 바이알 (ⅱ) 새로운 셀룰로오스 아세테이트 플러그, (ⅲ) 실리콘 마개 및 (IV)의 에탄올 용액 (표 3 참조)를 1 ㎖.
- 55-65%에 20 ~ 25 ° C의 온도와 상대 습도를 조절하여 테스트 룸을 준비합니다.
- 다른 노동자 되세요튜브의 각 그룹에 고유 코드를 할당하고 이후의 코드를 기록합니다. 몇 분 동안 적응 시험 방에 파리 코드화 된 튜브를 놓습니다.
- 2.3에서 비행 병에 코드를 일치하도록 빈 테스트 튜브 레이블.
- 표 1과 유사한 스프레드 시트의 열로 코드 (하나의 열 / 병)을 입력하여 하드 카피 테스트 로그를 구축합니다.
- 가이드로 테스트 로그를 사용하여 테스트 룸에서 배열을 일치로 파리와 빈 테스트 튜브 코드화 된 식품 유리 병을 준비.
참고 : 테스트하는 튜브의 합리적인 최대 수 (24) (즉, 4 병 각 6 세트). - 전송 일치 / 표시 빈 테스트 튜브로 음식 바이알에서 날아 셀룰로오스 아세테이트 플러그 유리 병 상판 아래 2cm가 될 때까지 즉시 테스트 튜브에 셀룰로오스 아세테이트 플러그를 삽입합니다.
- 이하, 엇갈린 1 분 간격으로 집합으로 네 병의 각 행을 처리합니다.
- 시간 0 평가의 경우, 개별적으로 w 각각의 유리 병을 파악i 번째 엄지 손가락과 집게 손가락은 유리 병의 바닥에 파리를 노크 30 초를 기다린 후 죽은 / 움직입니다 파리의 수를 계산하기 위해 테이블에 부드럽게 세 번 누릅니다. 시간에 하드 카피 테스트 로그에 0 분 각각의 병에 대한 부동 / 죽은 파리의 수를 기록한다.
- 타이머는 시간 0에서 연속적으로 카운트 업을 시작하고, 즉시 4 튜브의 첫 번째 행 / 세트 바이알 셀룰로스 아세테이트 플러그에 에탄올 1 ㎖을 첨가 시작한다. 그들은 테스트 할 순서에 5 초 간격으로 바이알에 셀룰로오스 아세테이트 플러그에 에탄올 1 ㎖을 추가한다. 에탄올은 셀룰로오스 아세테이트 플러그 골고루 흡수되도록 원을 그리 셀룰로오스 아세테이트 플러그에 에탄올을 추가합니다. 에탄올은 세트의 모든 4 테스트 튜브에 첨가되었을 때, 그것을 밀봉하는 바이 얼 실리콘 플러그를 삽입한다.
- 회 1, 2, 3, 4, 5 분에서, 각각의 튜브 (4) 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 세트에 에탄올 1 ㎖을 추가한다. 후 실리콘 마개를 삽입 계속4 튜브의 각 세트에 에탄올을 추가.
- 시간 6 분에서, 엄지와 집게 손가락으로 각 유리 병을 잡고 유리 병의 바닥에 파리를 노크 테이블에 부드럽게 세 번을 눌러, 30 초 대기 후 계산과의 총 수를 기록하여 4 병의 첫 번째 세트를 테스트 진정시켰다 파리. 점수는 (i)는 유리 병의 바닥에 서 있지만, 또는 그들의 날개를 펄럭없이 자신의 허리에 도보 또는 (ⅱ) 거짓말하지 않는 경우 진정으로 날아갑니다.
- 표 2의 스케줄을 사용하여 5 초 간격으로 셋 내의 각각의 바이알 핸들.
- 제 세트에 대해 수행 배 7, 8, 9, 10 및 11 분에서 각각 튜브의, 제 3, 4, 5, 6 세트를 테스트한다.
- 시간이 12 분으로 2.12에 기재된 바와 같이, 튜브 (4)를 다시 상기 제 1 세트의 테스트를 각각 13, 14, 15, 16 및 17 분에서의 바이알 제, 3, 4, 5, 6 세트의 연속 시험.
- 모든 파리가들 때까지 2.12에 설명 된대로 테스트 파리 계속edated.
- 하드 카피 테스트 로그의 각 유리 병에 파리의 총 수를 입력합니다. 파리의 총 수에서 시간 0에서 움직이지 / 죽은 파리를 검열.
- 시간 (x 축) 대 % 활성 파리 (y 축)와 같은 각각의 평가 지점에서의 시간 퍼센트 활성 파리와 플롯 데이터를 계산한다. 다항식 또는 S 자형 곡선이 맞는 3 차에서 진정 작용 시간 (50) 값 (ST50, 50 %의 진정 작용에 시간) 보간 또는 곡선 아래의 면적을 계산하여 에탄올 진정 작용을 정량.
- 디코딩 유리 병에서 데이터를 컴파일하고 통계 분석을 수행 (예를 들면, 일원 분산 분석 페로 니 여러 비교 테스트와) 실험 설계에 대한 적절한.
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Representative Results
이 에탄올 진정 작용 분석에서 원시 데이터는 에탄올 증기 노출 시간의 함수로서 진정시켰다 파리의 수이다. 원시 데이터는 시간의 함수로서 파리 퍼센트 활성으로 전환된다 (primary 데이터를도 1A, B, D - F). 곡선 적합로부터 기본 데이터에서 에탄올에 진정 감도 보간을 통해, 진정 작용 시간 50 (ST50)로 곡선 (AUC) 아래 진정제 또는 AEA가 날아간의 50 %에 필요한 시간을 정량화 할 수있다. 이전 (평균 R 2 = 0.934, N = 24, 그림 1A에게) 예상대로 S 자형 곡선이 기본 다소 더 나은 데이터 (평균 R 2 = 0.997, N = 24 맞는 있지만 18 3 차 다항식 곡선, 잘 기본 데이터에 맞게보고; 그림 1B). 곡선 근사화 ST50에서 값을 결정하는 것에 대한 대안으로서, 주 데이터의 에탄올 진정 감도도 영역으로서 정량화 될 수있다곡선 (AUC가, % 활성 파리 시간 X) (그림 1C)에서. 정량 이들 세가지 방법의 결과는 서로 상당히 잘 상관 (피어슨 R이 ≥0.998, N = 24) 및 단위 ST50 (분) 및 AUC (활성 %를 반드시 다르지만, 본질적으로 구별 할 수없는 (도 1C) 아르 ) × 시간을 날아. 등 모든 계산에 관한 세부 사항, 사용 스프레드 시트, 교신 저자에서 사용할 수 있습니다. ST50 (또는 AUC)의 높고 낮은 값을 무디게 각각 진정을 에탄올 감도를 향상 나타냅니다 있습니다. 이전의 리포트 (18)과 일관성을 유지하기 위해, 3 차 다항식 곡선 근사화로부터 유도 ST50 값이 study.Importantly의 나머지 부분에 걸쳐 사용하고, 상기 분석은 SCB에 Cnx14D (도 1d) 및 돌연변이에 대해의 RNAi 효과를 검출한다 (도 1E) , ARU 및 hppy (그림 1 층),
이 분석의 일상적인 사용 동안에, 에탄올 2 ㎖ 습윤 셀룰로오스 아세테이트 플러그와 튜브의 태핑 셀룰로오스 아세테이트함으로써 잠재적 파리 '자유로운 변화, 몇 개별 실험 (미도시)의 일부 튜브의 하부를 향해 이동하는 플러그 야기 공간 및 에탄올 증기의 농도. 또한, 약 0.25 ㎖의 에탄올을 더하여 액체 에탄올에 노출 된 분석 방법에 날아간 가능성을 제기들이 에탄올 2 ㎖ (도 2A)으로 습윤되었을 때 셀룰로오스 아세테이트 플러그 (즉, 측면 플라이) 바닥에 도달 증기를 에탄올합니다. cellulos의 하향 이동은 2ml의 1 ㎖이다 셀룰로오스 아세테이트 플러그 에탄올의 부피 감소 탈락격렬한 태핑 (미도시)와 같은 셀룰로오스 아세테이트 플러그 (도 2A)의 저부에 에탄올 용액의 양을 측정 가능한 제거 후에도, 검정 기간 동안 E 아세테이트 플러그. 파리의 진정 작용도 1 ㎖ (- C 그림 1A)보다 작은 볼륨으로 사용 에탄올의 양에 민감했다. 에탄올 1 ㎖를 사용하면 따라서 분석 기간 동안 파리에 대한 일정한 열린 공간을 유지하는 데 도움이 액체 에탄올을 섭취하지 않을 것을 보장한다. 파리 따라서 아마도이 분석에서 증기로 단독 에탄올에 노출되어있다. (즉, 85 % (부피 / 부피) 에탄올을 1 ㎖에서 증기) 및 [A] 날아간 w 오래 1-5일 달리 지시되지 않는 한 여기에보고 된 모든 후속 연구에 사용 된 85 % 에탄올 ml의 하나.
(24) 유리 병에 실험, 파리는 실험자가 평가 할 수 있도록 6 분 간격으로 부드럽게 도청 (즉, 순환) 합리적인 처방 schedul의 모든 병전자. 적은 바이알 5 분 간격을 제어하여 파리와 연구 ST50s 6 분 간격으로 연구로부터 ST50s 필적 하였다 (데이터는 보이지 않음). 파리는 이전에 각각의 유리 병에 파리의 진정 상태를 결정하는 순서로 네 병 세트를 활용할 수 실험자 시간을 허용하는 도청 후 진정 30 초 동안 평가된다. 충격 에탄올 진정 감도, 남성과 여성의 제어 파리에서 ST50 값을 도청 한 후 활력 또는 복구 시간을 도청의 차이가 매우 크게 (하드) 보통 (일반) 탭되는 동안 측정 또는되었는지 확인하고하는 표준 30 초 이상 60 초 후 복구. 태핑 활기 (그림 2B)와 복구 시간 (그림 2C)를 제어 남성 또는 여성의 ST50 값에 측정 가능한 영향을 미치지 않았다.
항생제는 플라이 음식 매체 박테리아 성장을 억제하는데 사용될 수있다. 항생제 음식 매체의 보충 에탄올 진정 감도에 영향을 미치는지 확인하려면,ST50 값 (, 테트라시 클린 20 ㎍ / ㎖; 암피실린 ㎍ / ㎖의 클로르 암 페니 콜 100, 125 ㎍ / ㎖) 존재 또는 세 항생제의 부재 하에서 사육 한 세대 파리 측정했다. 이러한 세 가지 항생제 사육 파리 에탄올 진정 감도 (도 2D)에 아무런 영향을 미치지 않았다.
파리는 빈 음식에 전송되는 병 - 따라서 이전에 진정 작용 분석에 에탄올 증기에 노출되기 ~ 5 분-바로 음식과 물을 박탈한다. 시간 파리의 양을 분석에 미치는 영향 에탄올 진정 감도를 시작하기 전에 빈 식품 유리 병에 보관되어 있는지 확인하려면, 파리는 6 시간 (보통의 최소 70 배) 다음 ST50 값을 측정 하였다 굶주려 있었다. 6 시간 동안 기아는 크게 두 남성과 여성의 제어 파리 (그림 2E)에 ST50s 감소했다. ST50에 기아의 효과가 (이 실험에서 9~14%) 상대적으로 작은했지만, 시간은 SPE 파리차 빈 유리 병에 분석에 에탄올 증기에 노출되기 전에이 실험에서 또한 실험 사이에 그룹간에 유니폼을 개최한다.
실험실 플라이 음식이 살아있는 효모로 보충 할 수있다 (예를 들어, 18,20,23,24)는 자손의 생산을 촉진합니다. 자손의 총 수 20 일 동안 생산하지만, 예를 들어, 식품 유리 병은, 이전 열 살해 효모 또는 살아있는 효모 (D10-D11, 흰색 바,도 3a를 비교)에 비해 성인을 생산 (사카로 미세스 세 레비 시아) 살아있는 효모와 보충 라이브 및 열 살해 효모 (그림 3A)이 보충 유리 병에 구별 할 수 있었다. 효모 생산을 즉석 식품에 에탄올 의미있는 양의 살 가능성을 해결하기 위해 음식 매체 (I) 에탄올, 초파리 (ⅱ) 에탄올, 및 초파리 (III) 에탄올 진정 감도 라이브 효모의 효과를 측정 하였다. 식품 중 살아있는 효모 함유 하위 보충열 사망 또는 전혀 효모 (그림 3B)로 보충 식품에 비해 에탄올 stantial 양. 그럼에도 불구하고, 제어 파리, 라이브 보충 매체에 성장 사망하거나 더 효모 내부 에탄올 (그림 3C)의 indistinguishably 낮은 농도 없었다. 또한, 에탄올 진정 감도는 열 죽거나 살아있는 효모 (그림 3D)로 보충 매체에 성장 제어 파리에서 구별 할 수 있었다.
1. (AC) 진정 분석 데이터 분석 옵션 도표. w 제어 [A] 여성 (1118 동질 와트, 블루밍턴 인디애나 초파리 증권 센터 stock # 5905)의 85 % (부피 / 부피) 에탄올의 지시 볼륨에서 증기에 노출되었다. (A) 진정 작용 시간 코스 데이터는 서드와 맞 차 다항식. (B)진정 작용 시간 코스 데이터는 S 자형 곡선에 맞게. 곡선 아래 (왼쪽 Y 축) ST50의 3 차 다항식에서 보간 값과 S 자형 곡선 또는 (오른쪽 Y 축) 영역으로 정량 (C) 에탄올 진정 감도 (AUC, % 활성 파리) 시간을 X. 에탄올 볼륨 아니라 분석 방법, 영향 에탄올 감도 (양방향 ANOVA; 용적의 효과, p <0.0001; 분석법, NS의 효과] N = 8 / 군; 1/100 변환 AUC 데이터의 차이를 설명 할 의 값의 크기). (DF) 대표 시간 코스 데이터. (D) 컨트롤 (에 신경 시스템 (elav-GAL4 / v5597) 둔화 에탄올 감도 상대적으로 Cnx14D의 RNAi의 발현 v5597 / + 및 elav-GAL4 / + ). (8.128 ARU)의 CB를 (SCB의 VOL2) 및 ARU의 (E와 F) 돌연변이 강화 에탄올 진정 감도와 hppy의 돌연변이 (hppyKG5537)는 대조군과 비교 에탄올 진정 감도 무딘. ST50 18 값으로 EF의 데이터는 이전에보고되었다.
진정 작용 분석에서의 동작 파라미터의 평가도 2. 셀룰로오스 아세테이트 플러그의 바닥 2mm 에탄올 (A)의 양. * 본 페로 니 에탄올의 부피는 모의 60 분간 실험 (일방향 ANOVA, p <0.0001 중에 셀룰로오스 아세테이트 플러그의 바닥 2mm로 이동 에탄올의 부피에 상당한 영향을 미쳤다 셀룰로오스 아세테이트 플러그의 꼭대기에 추가 다중 비교 검사, 2ml의 대 0과 1 ㎖, p <0.05, N = 4). 에탄올. 셀룰로오스 아세테이트 플러그의 질량의 변화로 정량화하지 (B) 어느 쪽도 파리의 유리 병을 도청의 활력 동안 테스트 (하드, 일반)도 섹스 테스트 한 영향을받는 ST50s (두-w님 ANOVA; , NS 도청의 효과; 섹스, NS의 효과; N = 12) (C) 어느 도청이나 섹스 ST50s (양방향 ANOVA에 심각한 영향했다 후 회복 시간을,. 복구 시간, NS의 효과, 성별, NS의 효과를,. 항생제의 N = 6) (D)에 포함될 성장 배지 (ATC 암피실린, 테트라 사이클린 및 클로람페니콜)이 ST50s에는 전체적인 효과 없었지만 ST50 (양방향 ANOVA에 섹스의 효과가 있었다; ATC, NS의 효과, 성별, P의 효과 = 0.001; 인터랙션 , NS;. 기아의 N = 6) (E) 효과 에탄올 진정 감도에. ST50s는 일반적으로 (연준) 공급이 운항하는 항공사에 비해 6 시간 (굶주린)을 위해 음식과 물을 박탈 파리에서 유의하게 낮았다; 남성과 여성의 ST50s 전반적인 구별 할 수 있었다 (양방향 ANOVA, 기아의 효과, P <0.0001, 성별, NS의 효과; N = 12 * 페로 니 여러 비교 테스트, 남성과 여성의 기아의 효과, P <0.05) .
그림 성장, 에탄올 내용과 진정 작용 감도에 살아있는 효모의 3. 효과. 더 효모 (없음 Y)로 보충 식품 매체를 포함하는 유리 병에서 (A) 성인 자손, 열 살해 효모 (Y 사망) 또는 라이브 효모 (라이브 Y). 화이트 바, 일 10 ~ 11시 신흥 성인 자손; 회색 막대, 일 12-20. 모든 (10 ~ 20) 일, P <0.0001; 일 10 ~ 11, P <0.0001, 일 12-20, P = 0.0002; N = 5 전반적으로, 효모 처리는 상당한 자손 생산 (편도 ANOVAs에 영향을 미쳤다 ). 모든 (10 ~ 20) 일 동안 생산 된 자손의 총 수는 사망 Y와 유리 병에서 더 컸다과 없음 Y (페로 니 여러 비교 테스트, P <0.05)보다 Y를 살고 있습니다. 일 10 ~ 11시, 라이브 Y와 유리 병은 Y 사망 및 사망 Y와 유리 병이 아니 Y보다 더 많은 자손 (흰색 바, 페로 니 여러 비교 테스트, P <0.05) 생산보다 더 많은 자손을 생산했다. 일 12 ~ 20시, 위스콘신 유리 병일이. Y가 없음 Y 또는 라이브 Y와 유리 병보다 더 많은 자손 (회색 바, 페로 니 여러 비교 테스트, P <0.05) 생산 사망 식품 매체 (B) 에탄올 아니오 유리 병에 비해 라이브 Y 보충 유리 병에서 유의하게 높았다 Y 및 사망 Y (편도 ANOVA, p <0.0001, N = 5; 페로 니 여러 비교 테스트, P <0.05) (C) [A] 여성 파리는 크게 효모와 보충에 의해 영향을받지 않았다 와트의 내부 에탄올 (한. - 방향 ANOVA, NS, N = 5-10). B와 C 에탄올 함량은 기재 (18)으로서 결정 (D) ST50 값이 크게 남성 또는 [A] (양방향 ANOVA w 여성 효모 숙주 세포의 보충에 의해 영향을받지 하였다. 효모, NS의 효과] 효과 섹스, NS의; N = 12).
| 유리 병 → | (1) | 이 | 3 | 4 | (5) | (6) | 7 | 8 |
| 코드 → | ||||||||
| 총 # 1 → | ||||||||
| 0 분 | ||||||||
| 6 분 | ||||||||
| 12 분 | ||||||||
| 18 분 | ||||||||
| 24 분 | ||||||||
| 30 분 | ||||||||
| 36 분 | ||||||||
| 42 분 | ||||||||
| 48 분 | ||||||||
| 54 분 | ||||||||
| 60 분 |
표 1 : 일반적인 테스트 로그. 프로토콜 단계 2.5를 참조하십시오.
| 유리 병 | 꼭지 | 평가 |
| (1) | 6 분 0 초 | 6 분 30 초 |
| 이 | 6 분 5 초 | 6 분 35 초 |
| 3 | 6 분 10 초 | 6 분 40 초 |
| 4 | 6 분 15 초 | 6 분 45 초 |
표 2 :. 일반적인 도청 및 테스트 일정 프로토콜 단계 2.13를 참조하십시오.
| 소재 / 장비의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 / 설명 |
| 식품 유리 병 | VWR | 89092-772 | 폭이 좁은 |
| Flugs | 제네시 / flystuff.com | 49-102 | 폭이 좁은 |
| 실리콘 마개 | 피셔 과학 | 09-704-1l | # 4 |
| 에탄올 | 약리학 - Aaper | 111000200 | 200 증거 |
표 3 : 재료.
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Discussion
재현성 의미있는 표현형을 정량 간단 분석은 행동의 분석을위한 큰 가치입니다. 여기에 설명 된 작품은 초파리에서 에탄올 진정 감도와 빠른 내성을 측정하기위한 분석의 몇 가지 실용적인 측면을 해결합니다. 이 작품이 아니 긴하지만, 행동 분석 연구에서 피험자에 대한 환경 및 유전 적 배경을 일정하게 유지에 의해 촉진된다. 또한, 비교는 일반적으로 사육과 나란히 테스트 파리의 그룹 사이에해야한다. 이를 위해,이 작품의 개별 실험 내의 모든 파리가 동일한 유전 적 배경을 가지고 균일 한 환경 조건 표준 음식 매체와 (25 ° C, 상대 습도 60 %, 12 시간 빛 / 어둠 사이클)에서 나란히 양육되었다 (10 % 음식 매체가 명시 적으로 조작 된 이들 실험을 제외 크로즈, 3.3 %의 옥수수 가루, 2 % 및 1 % 효모 한천).
ETH여기에 설명 anol 진정 작용 분석은 저렴하고 상업적 공급원 (표 3)으로부터 쉽게 사용할 모두 거의 재료 (플라스틱 바이알, 셀룰로오스 아세테이트 플러그, 실리콘 마개 및 에탄올)을 필요로한다. 이 에탄올 진정 작용 분석법 및 (예 6,20,25-27가 종합적 검토 3,28) 이전에보고 된 방법에 기초하여 큰 정도 유사하다. 상기 분석 모두 에탄올 진정 감도를 측정하기위한 유틸리티를 갖지만, 분석의 장점들은 여기에서 설명한 (ⅰ) 파리는, (II) 날아간 감소 가능성면 또는 다른 재료에 얽힐 수 분석 중에 액체 에탄올에 노출되지 포함 분석 기간 동안 테스트 유리 병에, (ⅲ) 기능은 병렬로 파리의 많은 그룹을 테스트하기 (IV) 기본 데이터 세트의 에탄올 감도의 목적 정량화를위한 세 가지 옵션을 제공합니다. 함께, 이러한 장점은 크게 그쪽, 음료 에탄올 많은 가능성을 제거t 에탄올함으로써 전체적인 된 운동 능력을 억제 파리의 외부 표면을 습윤 수 있으며, 검정 파리에서의 성능은 테스트 환경에서 재료를 교락과 관련된 어려움에 의해 혼동 될 수있다. 또한, 이러한 장점은 분석의 전체 처리량과 재현성을 증가시킨다. 또한,이 분석에서 측정 에탄올 감도의 발현에 영향을받지 않습니다 흰색 내인성 또는 유전자 마커 미니 흰색, 18 일반적으로 초파리 유전자 분석에 사용 된 유전자와 유전 적 배경을 가진 연구에 적합하다.
몇몇 주요 파라미터 에탄올 진정 세이에서 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 제어되어야한다. 테스트중인 성장 환경과 균주의 유전 적 배경 (상기 참조)를 제어하는 것 이외에, 용적의 에탄올 농도는 물론 에탄올 sensitivi의 정량하는 데 매우 중요타이. 물에 에탄올 희석 발열합니다. 따라서, 묽은 에탄올 용액 전에 진정제 검정법 개시까지 RT로 평형화되어야한다. 테스트중인 그룹간에 균일하게되어야 추가적인 파라미터가 파리 진정 작용 분석을 개시하기 전에 빈 식품 튜브에 수납되어있는 시간이다. 두 개의 추가 매개 변수는 제어되어야한다. 바이알 당 파리의 수는 이상적이어야 (a) 모든 바이알과 같은 군, (b)
빠르고 쉽게 계산 될 수있다, 및 (c) 비교적 매끄럽고 진정 시간 과정을 허용하기에 충분히 큰 수. 일레븐은 유리 병은 우리의 실험실에서 잘 작동하고 제안의 시작 지점입니다 / 파리. 고려해야 할 마지막 매개 변수는 진정 작용 분석에 사용 된 파리의 나이입니다. 1-10일 오래 초파리 에탄올 진정 감도 연령 전혀 재현 효과 (데이터 미기재) 발견되었지만, 젊은 연령대 동물 사용 보인다파리 29, 30의 나이에 따른 행동 변화에 큰 문학을 주어진 정당화.
여기에 설명 된 파라미터들의 범위를 제어하여 파리를 테스트 할 때 다른 파라미터는 적어도, 진정 작용 등의 분석에 중요하지 않는 것. 섹스, 도청의 강도, 도청에서 복구 시간 및 비행 항생제 (암피실린, 테트라 사이클린 및 클로람페니콜)와 음식이나 살아있는 효모의 보충은 여기에 설명 된 바와 같이 측정 에탄올 감도를 변경하지 않습니다. 마찬가지로, 3 차 다항식 곡선, 기본 진정 작용 시간 코스 데이터에서 S 자형 커브 보간, 또는 AUC의 결정에서 보간에 의해 에탄올 감도를 정량하는 것은 본질적으로 구별 해석에 연결됩니다. 성의 효과는 일관 여기서 설명한 연구에서 관찰되지 않았지만, 유전 적 배경이 여러 초파리 에탄올 성 감도에 미치는 영향 31보고되었다. 따라서, 섹스 효과가 있다고 할 수있다단순히 여기에 사용 된 유전 w에 분산 [A] 배경에 의해 마스크. 대안 적으로, 초파리 행동 반응에 측정 성 효과는 아직 알 수없는 분석 또는 성장 조건을 요구하는 것이 가능하다. 어떤 경우에, 포인트는 한 그룹의 성별을 포함하여 분석법 진정제, 가능한 한 균일 명시 적으로 비교되는 모든 파라미터를 만드는 것이다.
살아있는 효모 플라이 음식 에탄올의 상당한 양을 생산하는 것을 감안할 때, 그것은 살아있는 효모와 음식의 섭취가 파리에서 내부 에탄올을 증가하지 않았다 다소 놀라운 일이었다. 한 가지 가능한 설명은 에탄올이 식품의 표면에 걸쳐 균일하게 발생하기 때문에 선택적으로 더 또는 에탄올의 비교적 낮은 농도로 음식을 섭취 할 수없는 날아간되지 않는다는 것이다. 추가 연구는이 발견이 다른 가능한 설명을 해결해야합니다.
분석 describ 수정의 다수ED는 여기에 실험을 수행의 목표에 따라 가능하다. 예를 들어, 튜브의 수는 각각의 바이알에서 테스트 파리의 수가, 농도 및 에탄올의 부피, 에탄올 노출 기간 사용한 실험에서 시험, 진정 평가, 연령 및 파리 성 사이의 시간 간격은 시험 , 진정제 및 기준은 모든 개별 기관의 요구에 맞게 수정 될 수있다. 추천 정보는 초기 분석을 배우는 네 튜브의 하나 또는 두 개의 그룹으로 시작하고 프로젝트에 필요한 처리량을 제공 튜브의 개수를 사용하여 확장하는 것이다. 예기치 않게 짧거나 긴 ST50s가 그 시험 파리가 마취 시간은 마취의 O / N 복구하는 것이 허용되었다 (1-5 분) 짧은을 실시하기 위해 좋은 방법이 될 것입니다, 관찰 될 경우,이 10 일 이전이었다 하였다 물리적, 에탄올 용액에 의해 습윤를 처리하고시 손상되지, 그리고 전위의 손상이 없었다.
분석 측정 에탄올 진정 감도는 따라서 설계 또는 에탄올에 다른 행동 반응을 평가하기에 적합하지 않습니다. 파리에 알려진 모든 에탄올 행동 패러다임과 마찬가지로,이 분석은 크게 정상 전위의 능력을 가지고 파리를 필요로하며, 따라서 시험해서는 안 장애 운동과 유전자형. 분석법의 또 다른 제한은 바이알 에탄올 증기의 농도는 아마도 셀룰로오스 아세테이트 플러그에서 약 휘발 연속적으로 증가된다는 것이다. 파리의 내부 에탄올 모든 시간 점진적으로 상승하지만 에탄올 행동 분석 비행, 그것은 파리에 에탄올 증기의 고정 농도를 제공하는 것은이 분석 결과의 일관성을 향상시킬 수있는 가능성이 보이고 있습니다. 에탄올 고정 된 증기의 농도를 제공하기위한 방법은, 아직 분석 여기에 기재된 규모로 사용될 수 있도록하는 것이 발견되지 않았다.
에탄올 진정여기에 설명 된 분석은 감도 및 에탄올 (18)의 신속한 내성 유전자 분석에 적합하다. 성장 환경, 유전 적 배경 농도와 부피의 에탄올 시각 파리의 양은 빈 식품 바이알에 보내고, 그리고 사용 된 파리의 개수 및 모두 나이 제어되어야한다. 이러한 매개 변수를 적절하게 제어되는 가정, 진정 작용 분석은 모두 역에 적합하고 행동 반응은 초파리에서 에탄올의 분자 기초를 조사 유전 적 접근 방법을 전달한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
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