Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화 Published: May 7, 2015 doi: 10.3791/52699
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 1,2
1Department of Surgery, Texas A&M University Health Science Center College of Medicine, 2Department of Surgery, Baylor Scott & White Health

Abstract

허혈 재관류 (IR)는 부상 허혈성 뇌졸중과 관련된 이환율과 사망율에 크게 기여하는 것으로 알려져있다. 허혈성 뇌 혈관 사고는 모든 뇌졸중의 80 %를 차지한다. IR 부상의 일반적인 원인은 활성 산소의 형성을 유발 조직에 혈액, 영양소, 산소의 급성 / 만성 폐색 다음과 같은 유체의 급속한 유입이다.

허혈성 뇌졸중은 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​ 부전 vasogenic 뇌부종 따른다. 구조적으로, 혈관 내피 세포 간의 긴밀한 접합 (TJS)은 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 무결성을 유지하는데 중요한 역할을한다. IR 부상이 아닌 특정 염증 반응으로 이어지는 초기 보조 부상입니다. 염증 다음 산화 및 신진 대사에 영향을 미치는 스트레스는 BBB 투과성 꽉 접합 (TJ) 무결성의 중단을 포함하여 보조 뇌 손상을 트리거합니다.

우리의 프로토콜은 체외 제공 </ EM> 쥐 뇌 내피 세포 TJ 무결성 및 스트레스 섬유 형성에 산소 - 글루코스 손실과 재산 소화 (OGD-R)의 예. 현재 생체 내 모델에서 여러 실험은 IR 손상의 효과를 연구하기 위해 사용된다; 그러나 그들은 이러한 기계적인 관계를 공부 수술, 유전자 따라 분자의 영향과 어려움을 수행함에있어 기술적 문제 등 여러 가지 한계를 가지고. 그러나, 체외 모델은 그 많은 한계를 극복하는 데 도움이 있습니다. 제시된 프로토콜은 잠재적 인 치료 전략을 제공하는 다양한 분자 메커니즘 및 기계적인 관계를 연구하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 체외 연구 결과는 생체 내 연구에서 표준과 다를 수 있습니다주의를 해석되어야한다.

Introduction

허혈 재관류 (IR)은 부상 뇌졸중, 심근 경색, 외상, 말초 혈관 질환, 외상성 뇌 손상과 관련된 다양한 1,2- 쇠약 합병증 및 사망의 원인으로 자주 발견된다. 뇌 혈관 IR 부상 염증과 부종 3에 이르는 초기 보조 부상입니다. 산화 및 염증 다음 대사성 스트레스의 결과로서 발생하는 합병증의 하나는 항상성 자유 라디칼 형성에 주요한 균형, 혈액 - 뇌 장벽의 변화 (BBB) ​​단단한 접합부 (TJS) 및 미세 혈관 투과성 4,5의 손실이다.

현재, BBB에 IR 손상의 효과를 연구하기 위해 사용되는 생체 내 모델에서 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) microembolism 및 트랜스 제닉 또는 녹아웃 동물을 포함한다. Hossmann 6 논의 그러나, 각각의 단점과 한계가있다. MCAO 모델은 effec을 연구하는 데 사용됩니다산화 환원 스트레스의 TS, BBB의 접합부 통신의 변화와 뇌와 면역 세포 사이의 상호 작용. 그러나, 이들은 그러한 내부에 정밀한 미세 수술 절차 및 어려움에 대한 요구와 같은 다양한 기술적 과제를 제시한다. 뇌허혈을 연구하는 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 사용이 경색 형성에 유전자에 의존하는 분자의 영향, 혈관 해부학의 변화와 다양한 체중 (6)과 같은 문제가있을 수 있습니다 동안 Microembolism는 순간적으로 BBB를 분해. 따라서, 허혈의 체외 모델은 의약품에 대한 역학적 연구를 수행하는 그들의 적용에 주로 최근에 관심을 증가 발견했다. 그러나, 시험관 연구의 결과는 완전히 생체 연구를 나타내지 있으므로 취급시주의를 6으로 해석해야합니다.

내피 세포의 단층 및 미세 혈관 투과성이 낮은 산소 농도의 반작용 효과가 있었다오가와 (7)에 의해 연구. 쥐의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (RBMECs)는 체외 BBB을 개발하는데 사용되었다. 이 프로토콜에 제시된 산소 포도당 박탈과 재산 소화 (OGD-R) 기술은 Zulueta 등의 알과 주홍 등 8,9에 의해 연구에서 적용되고있다. 우리는 0 % O 2, 5 % CO 2 및 95 % N 2를 포함하는 저산소증 / 무산소 증 챔버에 넣어서 OGD-R에 뇌 내피 세포를 노출시켰다. 세포는 나중에 각각 면역 현지화 및 로다 민 팔로이 딘 라벨을 사용하여 TJ 무결성 및 스트레스 섬유 형성의 변화에​​ 대해 평가 하였다. zonula occludens-1의 (ZO-1)의 면역 형광 염색 ZO-1과 같이, TJ의 무결성을 판단하기 위해 수행된다 TJ 단백질 결합에 중요한 발판 막이다. 로다 민 Phalloidin의 라벨링은 세포 골격의 사상 액틴 수 (F- 액틴)를 결정하고, 내피 세포에서 액틴 스트레스 섬유 형성의 명확한 표시이다.

<P 클래스 = "jove_content는">이 방법의 목적은 BBB 내피 세포 TJ 무결성 및 F 액틴 스트레스 섬유 형성을 연구하기위한 생체 외 IR 모델로서 OGD-R의 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것이다. 결과는 TJ 단백질의 운명에 대한 정보를 제공, ZO-1, R-OGD 다음 스트레스 섬유 형성한다. 이러한 관계를 이해하는 것은 OGD-R을 다음 트리거되는 기본 분자 메커니즘을 결정하고 OGD-R 처리 다음 BBB 중단을 향상시키기 위해 잠재적 인 치료 전략을 개발 할 수있는 기회를 제공 할 것입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

내피 세포의 1. 시드

  1. 성인 스프 라그 돌리 쥐에서 RBMEC의의 차 문화를 얻습니다 (또는 상업적를 얻을).
  2. 100cm의 피브로넥틴 (50 μg의 / ㎖) 래트 뇌 내피 세포 성장 배지를 사용하여 코팅 된 배양 접시에서 배양을 RBMECs. 포화 상태에 도달 할 때까지, 매 2 일 매체를 변경합니다.
  3. 80-90%의 포화 상태에 도달에서 부드럽게 소용돌이 5 ml의 인산염 완충 식염수 (PBS)에있는 세포를 씻으십시오. 세포를 37 ° C로 평형화 따뜻한 0.25 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 1 ㎖, 그들을 노출시킴으로써 분리된다.
  4. 세포를 분리 및 분산 될 때까지 2-5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다.
    참고 : 세포를 분리 배양 접시를 누릅니다. 현미경보기 세포 접시의 표면으로부터 세포의 완전한 분리를 확인하기 위해.
  5. 트립신을 중화하기 위해 페트리 접시에 5 ml의 완전한 미디어를 추가합니다.분리 된 세포를 함유하는 배지를 피펫 및 15 mL의 원심 분리 튜브로 수집. .
  6. 5 분 동안 220 XG에서 내피 세포를 포함하는 미디어를 원심 분리기.
  7. 뜨는을 대기음 후 자동 세포 계수기 또는 혈구를 사용하여 계산됩니다 피펫 세포와 부드럽게를 혼합하고 아래로 3-5 ml의 신선한 쥐의 뇌 내피 세포 성장 매체에 cells.Suspend에게 펠렛을 함유 펠렛을 유지합니다.
  8. 물론 당 10,000-15,000 세포 사이의 범위 파종 밀도 / 웰, 8 아니라 멸균 챔버 슬라이드 시스템 프리 코트 피브로넥틴 (50 μg의 / ㎖)에 0.7 cm (2) 세포 현탁액을 전송합니다. 합류가 될 때까지 37 ℃에서 세포를 성장
    주 : 실험에 의해 필요에 따라 웨스턴 블롯 또는 다른 실험을 수행하기 위해, 셀은 10cm의 세포 배양 접시 나 특별한 요리에서 성장 될 수있다.

2. 산소와 체외에서 포도당 박탈 - 재산 소화모델

참고 : 다음 프로토콜 Zulueta 등의 알에서 적응하고있다. 1997; 주홍 H 등. 2012 8,9.

  1. 에 RBMECs에 OGD-R의 효과를 (그림 1 참조) 공부 저산소 세포 배양 시스템을 사용합니다. 설치 및 제조자의 지시에 따라서, 실험을 시작하기 전에 저산소증 세포 배양 시스템을 교정.
  2. 37 ° C 배양기에서 합류 챔버 슬라이드 (단계 1.8)를 제거합니다. 탈산 소화와 챔버 슬라이드에서 완전 배지를 교체에는 글루코스, 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM), 37 ° C에서 2 시간 동안 95 %, N (2) 및 5 % CO 2로 저산소증 챔버 내에 배치는 OGD 상태를 나타내는 없음.
  3. 37 ° C에서 95 % O 2, 5 % CO 2 인큐베이터로 세포를 이동하고 신선한 쥐의 뇌 내피 세포 완전한 매체와 함께 제공하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
    참고 :이 단계는 재산 소화 상황을 나타냅니다.
  4. 면역 현지화 및 로다 민 팔로이 딘 라벨링 챔버 슬라이드를 사용하여 (제 3 장 참조).

로다 민 Phalloidin의 사용 ZO-1과 F 액틴 라벨링 3. 면역 형광 현지화

  1. 잘 1 시간 동안 OPTI-MEM / 감소 된 혈청 미디어 / 100 ㎕에 RBMEC의 단일 층을 포함하는 챔버 슬라이드를 노출. 인산염 완충 식염수 (PBS, pH를 7.0-7.2) 100 ㎕에 챔버 슬라이드 3 회 반복한다.
  2. (PH 7.0-7.2)를 15 분 동안 PBS에 (PH 7.0-7.2)을 4 % 파라 포름 알데히드 100 μl를 사용하여 세포를 수정하고 PBS로 3 번 이상 챔버 슬라이드를 씻는다.
  3. 또 다른 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100 100 ㎕ (pH가 7.0-7.2)를 사용하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 시간 동안 PBS에 2 % 소 혈청 알부민 (BSA) 100 ㎕로 차단. ZO-1 또는 F-액틴에 대해이 단계 중 하나를 얼룩 / 라벨 세포 중 하나 후.
    1. 면역 역을 위해150, 4 ℃에서 N / O 2 % BSA-PBS에서 제조 : ining 1에 ZO-1에 대하여 항 - 토끼 항체와 함께 일차 세포를 배양한다. , PBS로 세포에게 (PH 7.0-7.2)을 3 회 반복한다. 플루 오레 신 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 100 ㎕와 함께 인큐베이션은 실온에서 1 시간 동안 항 - 토끼 이차 항체를 -tagged.
    2. 로다 민 Phalloidin의 라벨링, 블로킹 다음, 20 분 동안 2 % BSA-PBS에서 제조 1:50 희석 로다 민 팔로이 딘 100 ㎕에 세포를 노출.
    3. 면역 형광 염색과 PBS에서 로다 민 팔로이 딘 라벨, (PH 7.0-7.2)에서 세포를 씻으십시오. DAPI와 안티 - 페이드 시약을 포함하는 설치 미디어를 사용하여 챔버를 탑재합니다.
  4. 60 X 물 침지 렌즈를 사용하여 세포를 시각화하고 세포를 공 초점 현미경으로 단일 광학 평면에 스캔됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

피브로넥틴 프리 코트 눈크 II 챔버 슬라이드에 배양 한 세포를 Biospherix ProOx 모델 (110)에 실 어서 OGD-R을 행 하였다. 로다 민 팔로이 딘 얼룩 라벨을 사용하여 F-액틴 스트레스 섬유 형성을 나타내는도 2와 골격 조립체에 도시 된 바와 같이도 3에 도시 된 바와 같이 OGD-R에 셀을 실시 후, 그들은 면역 형광 기술을 사용하여 ZO-1 접합부 염색을 위해 처리 하였다. 있었다 대조군 세포를 OGD-R 실시 내피 세포 TJ 무결성도 2의 손실을 나타내는, 불연속 접합을 보였다 OGD-R을받지 않는 지속적인 접합부 무결성 없었다. OGD-R 처리를 실시하지 않은 대조군 세포는 전혀 또는 최소한 F 액틴 스트레스 섬유 나타났다 형성 OGD-R을 실시 내피 세포는 액틴 세포 골격 조립도 3의 변화를 나타내는 증가 된 F 액틴 스트레스 섬유 형성을 증명하면서; 대표 참조 번호 (13)의 허가 RINT

그림 1
저산소증 시스템 ProOx 모델 (110)의 1. 일반적인 구성을 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
흰색 화살표로 표시 꽉 접합 단백질의 그림 2. 면역 형광 지역화 (TJP) ZO-1, RBMECs에 OGD-R 다음 긴밀한 접합의 중단을 입증. 스케일 바 = 10 μm의. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.

"> 그림 3
흰색 화살표로 나타낸 바와 같이 RBMECs에 OGD-R에 이어 세포 골격 조립의 변화를 입증 F 액틴 스트레스 섬유 형성, 그림 3. 로다 민 Phalloidin의 레이블. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

허혈 - 재관류 손상에 대한 생체 외 모델로 OGD-R은 잘 신경 세포 (10, 11)을 공부 설립되었습니다. 투과도 및 TJ 무결성 9 뇌 내피 세포 및 변경에 OGD의 효과를 나타내는 연구가있다. 그러나, 우리의 연구는 다음과 같은 허혈성 뇌졸중 발생 생체 조건에서 허혈성 재관류 손상에 가까운 표현이다 OGD의 효과뿐만 아니라 재산 소화를 보여줍니다.

저산소 허혈 조건 세포층 투과성 vasogenic 부종 4를 증가시킴으로써 중단 BBB 선도, 중추 신경계의 염증을 유도하는 것으로 알려져있다. 재관류 손상은 세포 외 칼륨, 흥분성 신경 전달 물질, 및 내피 신경 부종, 면역 세포 활성화의 방출 상승, 과도한 활성 산소 종 생산, ATP가 고갈되는 매우 복잡하고 역동적 인 과정이다. 이,에서 턴 C, 생산, 클레아 제와 단백질 분해 효소의 유도 사이토 카인로 이어지는 다양한 카스파를 활성화하기 위해 도시 모두 부종, 선도, BBB 무결성 5,12-의 붕괴로 이어지는 다양한 염증 경로의 활성화를 auses. 내피 세포의 미토콘드리아에 의한 다수의 존재로, 허혈 손상에 특히 쉽다. 이웃 내피 세포 꽉 접합 단백질에 의해 유지 꽉 접합에 의해 서로 연결되어 있습니다.

ZO-1 밀착 연접 다른 단백질과의 상호 작용에 의해 TJ 무결성을 유지하는데 중요한 역할을하는 것으로 도시되고   액틴 세포 골격 조립. 또한, 액틴 세포 골격의 정확한 조절은 세포 - 세포 유착을 포함한 많은 발생 및 생리 과정에 필수적이다. 내피 세포에서 액틴 스트레스 섬유 형성을 차단 및 투과성 항진 13,14 부전과 연관된 것으로 발견된다. 로다 민 phalloiF 액틴 스트레스 섬유 형성을 관찰하는 본 연구에 사용 된 라벨링 기술 딘 것은 종료점 연구이다. Doggett 및 브레슬린 (15)에 의해 도시 된 바와 같이, 그러나, 스트레스 섬유 형성의 동적 및 라이브 영상도 행할 수있다.

현재의 연구는 majorly BBB 꽉 접합 무결성을 향해 ZO-1의 기여를 강조한다. 그러나, 클라우딘 -5,6- occludin, 접합부 부착 분자 (JAM)과 같은 다른 단단한 접합부 분자 등과 같은 OGD-R은 다음 BBB 밀착 연접 무결성 공부 마커로서 사용될 수있다. 이 연구에서 우리는 꽉 접합 무결성을 결정하는 질적 기법으로 면역 현지화 및 F - 굴지 라벨을 사용. 그러나, 우리는 또한 형광 마커와 transendothelial 전기 저항 (봉사자)를 사용하여 투과성의 정량적 측정과 같은 BBB의 다른 중요한 특성을 연구 할 수 있습니다.

OGD-R 기법을 이용하여 본 연구에서 제시Biospherix 시스템은 산소의 고정 된 농도에서 저산소증 / 무산소 증 연구에 사용될 수있다; 그러나 내피 세포에 산소 농도를 변화시키는 효과를 연구에 대해이 시스템을 이용할 수 없다. 내피 세포에 산소의 다양한 농도의 효과를 공부를 위해 우리는 목적에 적합한 사용 가능한 다른 모델을 채택 할 필요가있다.

이 기술은 BBB의 투과성 항진 및 TJ 무결성을 규제 다양한 세포 및 분자 이벤트 간의 역학적 관계를 연구에 사용될 수있다. 그들을 이해 BBB 중단 및 미세 혈관 투과성을 감쇠하기 위해 다양한 분자 전략 개발을위한 통찰력을 제공 할 것입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

우리는 재정 지원을 위해 스콧과 백인 병원 연구 보조금 프로그램을 인정하고 텍사스 A & 공 초점 레이저 현미경의 사용에 대한 의학 통합 이미징 연구소의 M 건강 과학 센터 대학. 우리는 원고 편집에 대한 도움말 씨 글렌 Cryer을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Proox model 110 Biospherix Model 110
DMEM, no glucose Gibco, Life technologies 11966-025
Rhodamine Phalloidin Life technologies R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody Life technologies 617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides  Thermo scientific 177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody  Santa cruz sc-2090
DPBS 1X Thermo scientific SH 30028.03 Any other PBS available can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  2. Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
  3. Yang, X., et al. Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats. Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).
  4. Kaur, C., Ling, E. A. Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions. Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).
  5. Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke. Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).
  6. Hossmann, K. A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).
  7. Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties. J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).
  8. Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation. Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).
  9. Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
  10. Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation. J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).
  11. Gundimeda, U., et al. Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon. J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).
  12. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).
  13. Alluri, H., et al. Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation. Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).
  14. Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability. Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).
  15. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin. J Vis Exp. (57), (2011).

Tags

의학 99 호 산소 - 글루코스 손실과 재산 소화 허혈 재관류 손상 혈액 - 뇌 장벽 뇌 내피 세포 단단한 접합부 면역,
같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alluri, H., Anasooya Shaji, C.,… More

Alluri, H., Anasooya Shaji, C., Davis, M. L., Tharakan, B. Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction. J. Vis. Exp. (99), e52699, doi:10.3791/52699 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter