Abstract
缺血 - 再灌注（IR）的损伤是已知显著与缺血性中风的发病率和死亡率。缺血性脑血管意外占80％的中风。 IR损伤的常见原因是流体的以下血液，营养物，氧的急性/慢性闭塞于组织引发的自由基的形成的快速流入。
缺血性中风之后是血 - 脑屏障（BBB）的功能障碍和血管源性脑水肿。在结构上，所述的内皮细胞之间的紧密连接（紧密连接）在保持血 - 脑屏障（BBB）的完整性方面发挥重要作用。 IR损伤是早期继发性损伤导致的非特异性，炎症反应。氧化和代谢应激下炎症引发的继发性脑损害，包括血脑屏障通透性及紧密连接（TJ）的完整性的破坏。
我们的协议提出了一种在体外</ em>的例子对大鼠脑内皮细胞TJ的完整性和应力纤维形成缺氧缺糖复氧（OGD-R）。目前，几个实验的体内模型用于研究IR损伤的影响;然而，它们具有一些局限性，如在执行手术，基因依赖分子影响和困难在研究机械关系的技术挑战。然而， 在体外模型可能有助于克服许多这些限制。所提出的协议可用于研究各种分子机制和机理的关系，以提供潜在的治疗策略。但是， 在体外研究的结果可以不同于标准体内研究和应谨慎解释。
Introduction
缺血-再灌注（IR）的损伤被发现是与中风，心肌梗塞，外伤，周围血管疾病和外伤性脑损伤1,2-相关的各种衰弱的并发症和死亡的常见原因。 IR损伤的脑血管是早期的继发性损伤，导致炎症和水肿3。之一的严重并发症发生的氧化和代谢应激以下炎症的结果是自我平衡，导致自由基的形成，在血脑屏障改变（BBB）的紧密连接（紧密连接）和微血管通透性4,5的损失。
目前，用于研究在BBB缺血再灌注损伤的影响体内模型包括大脑中动脉闭塞（缺血），微栓塞，以及转基因或基因敲除动物。然而，每一个都有它的缺点和局限性通过Hossmann 6所讨论的。 MCAO模型被用于研究短跑运动员氧化还原应力的TS，在血脑屏障的交界通信和改变脑和免疫细胞之间的相互作用。然而，它们存在各种技术的挑战，如需要精确显微手术操作和困难在其中。瞬间微栓塞打破了BBB，而利用转基因或基因敲除动物的研究脑缺血可能具有类似基因分子依赖的影响，形成梗塞，改变血管解剖和不同体重6的挑战。因此，缺血的体外模型发现增加近倍，主要由于息其适用性在执行机理研究的药物。但是， 在体外研究的结果可能不完全代表在体内研究，必须谨慎6进行解释。
对血管内皮细胞单层和微血管通透性低氧气浓度的反作用已研究了小川7。大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）用于开发体外 BBB。氧糖剥夺复氧（OGD-R）技术，该协议提出了改编自苏卢埃塔等人 ，朱等人的研究8,9。我们暴露脑内皮细胞对OGD-R的通过将它们放置在含有0％ 的 O 2，5％CO 2和95％N 2和缺氧/缺氧室中。细胞后评估分别采用免疫荧光定位和罗丹明鬼笔标记在TJ的完整性和应力纤维形成的改变。被执行以确定TJ完整性免疫荧光染色为紧密连接-1（ZO-1），如ZO-1是一种重要的脚手架膜结合的TJ蛋白。罗丹明鬼笔环肽标记决定了肌动蛋白丝状（F肌动蛋白）的细胞骨架，是肌动蛋白应力纤维形成的血管内皮细胞的明确指示。
<P类=“jove_content”>该方法的目标是提供洞察显影OGD-R作为体外的IR模型用于研究血脑屏障内皮细胞的TJ完整性和F-肌动蛋白应力纤维形成。研究结果将提供TJ蛋白的命运的消息，ZO-1和应力纤维形成以下OGD-R。了解这些关系将提供一个机会，以确定被触发以下OGD-R潜在的分子机制，并开发潜在的治疗策略，以提高血脑屏障破坏OGD如下-R处理。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.播种内皮细胞
- 从成年SD大鼠获得RBMEC的原代培养（或获得这些商业）。
- 培育在百厘米纤连蛋白（50微克/毫升）使用大鼠脑内皮细胞生长介质涂覆培养皿RBMECs。改变介质每两天，直到汇合为止。
- 在达到80-90％汇合，轻轻涡旋洗细胞在5ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。然后将细胞通过暴露至1毫升温的0.25％胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，平衡至37℃的脱离。
- 孵育细胞在37℃下2-5分钟，直至细胞被分离并分散。
注：点击培养皿分离细胞。在显微镜下检视细胞以确认细胞完全脱离从盘的表面上。 - 加入5 ml完全培养基的培养皿中，以中和胰蛋白酶。吸取出包含分离的细胞的培养基中，并收集成一个15毫升的离心管中。 。
- 离心含有内皮细胞，在220×g离心5分钟介质。
- 吸出上清液并保留沉淀含有cells.Suspend沉淀成3-5毫升新鲜大鼠脑内皮细胞生长培养基轻轻混合，上下用吸管将细胞将被随后使用自动细胞计数器或血细胞计数器计数。
- 用的接种密度，每孔10,000-15,000细胞之间的范围内细胞悬液转移入纤维连接蛋白（50微克/毫升）预涂8孔无菌室载玻片系统，0.7 平方厘米/孔。生长的细胞在37℃，直至汇合达到
注意：用于执行蛋白质印迹或其他实验中，细胞可于10cm细胞培养皿或特别的菜肴所要求的实验生长。
2.氧气和葡萄糖剥夺复氧体外模型
注：以下协议已被改编自苏卢埃塔等 。 1997;朱H 等 2012 8,9。
- 使用低氧细胞培养系统来研究RBMECs OGD-R的中的效果（ 见图1）。设置和校准的缺氧细胞培养系统在开始实验之前，根据制造商的说明。
- 从37℃培养箱中取出汇合玻片（步骤1.8）。替换在用脱氧腔滑动的完全培养基，无葡萄糖，Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM）中，并置于低氧室95％以下，N 2和5％CO 2下2小时，在37℃，以代表OGD条件。
- 移动单元返回到培养箱中95％ 的 O 2，5％的CO 2在37℃，并提供新鲜的大鼠脑的内皮细胞完全培养基并孵育另外1小时，在37℃。
注：此步骤表示复氧的局面。 - 使用玻片进行免疫荧光定位和鬼笔罗丹明标记（见第3节）。
同时ZO-1 和 F肌动蛋白标签使用罗丹明鬼笔环肽免疫3.本地化
- 揭露含有RBMEC单层至100μlOPTI-MEM /降低血清培养基/孔的1小时的玻片。在100μl磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH值为7.0-7.2）的洗室载玻片3次。
- 固定用100μl的4％多聚甲醛的PBS（pH值7.0-7.2）的细胞15分钟，并在PBS中洗室玻片3次以上（pH值为7.0-7.2）。
- 透用100微升0.5％的Triton X-100的PBS，（pH值7.0-7.2）另外15分钟的细胞。用100μl的2％牛血清白蛋白（BSA）的PBS一小时阻塞。在此步骤之后或者染色/标记的细胞或者为ZO-1或F-肌动蛋白。
- 对于免疫STA进不去孵育将细胞与抗ZO-1中1的抗兔一抗：150，用于O-制备2％BSA-PBS / N在4℃。在PBS中洗涤细胞3次，（pH值7.0-7.2）。孵化用100μl异硫氰酸荧光素（FITC）的-tagged抗兔二级抗体进行1小时，在室温。
- 为若丹明鬼笔环肽标记，以下阻挡，暴露细胞至100μl罗丹明鬼笔环肽的1:50稀释，在2％BSA-PBS制备，20分钟。
- 从免疫荧光染色和若丹明鬼笔环肽标记在PBS，（pH值7.0-7.2）洗细胞。安装使用含抗褪色试剂用DAPI安装媒体室。
- 使用60×水浸没透镜可视化的细胞和细胞共聚焦显微镜下扫描在一个单一的光学平面。
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Representative Results
细胞纤连蛋白预涂Nunc公司II腔室玻片中培养通过放置在一个Biospherix ProOx模型110室中进行OGD-R上。使细胞对OGD-R的后，将它们控制的细 胞是处理用于使用免疫荧光技术ZO-1交界染色， 如图2和细胞骨架组装表示使用若丹明鬼笔环肽染色标签F-肌动蛋白应力纤维形成， 如图3。未进行OGD-R的显示持续交界的完整性，同时进行OGD-R的内皮细胞表现出不连续的路口，指示TJ完整性图2的损失。即不进行OGD-R的处理的对照细胞显示没有或最小˚F肌动蛋白应力纤维形成，同时进行OGD-R的内皮细胞表现出增加的˚F肌动蛋白应力纤维形成指示的变化，肌动蛋白细胞骨架组装图3;众议员 RINT与许可参考＃13
图中的缺氧系统ProOx 110型1.典型配置 。 请点击此处查看该图的放大版本。
紧密连接蛋白图2.免疫本地化（TJP）ZO-1以下的示范OGD-R在RBMECs紧密连接的破坏，如白色箭头。比例尺= 10微米。 请点击此处查看本一个更大的版本图。
图3.若丹明鬼笔环肽标签适用于 F肌动蛋白纤维应力形成示范变化大会细胞骨架OGD之后-R在RBMECs，如白色箭头。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
OGD-R作为体外模型缺血再灌注损伤已经确立为研究神经元10,11。也有研究显示，OGD对脑血管内皮细胞和变更在渗透性和TJ完整性9的效果。然而，我们的研究显示，OGD的效果以及复氧，它是缺血再灌注损伤的发生的缺血性中风的体内条件下仔细表示。
缺氧缺血性条件是已知的诱发炎症在中枢神经系统中，导致通过增加细胞旁渗透性和血管性水肿4至BBB破坏。再灌注损伤是一个非常复杂的，动态的过程，其中有过量的活性氧的产生，ATP耗竭，上升外钾，兴奋性神经递质，内皮细胞和神经细胞肿胀，免疫细胞活化的释放。这反过来Çauses激活各种炎症途径，导致细胞因子的产生，诱导核酸酶和蛋白酶，导致水肿，所有这些都显示出激活各种半胱氨酸蛋白酶，导致血脑屏障完整性5,12中断。内皮细胞是特别容易出现缺血性损伤，由于大量线粒体的存在。相邻的内皮细胞是由通过紧密连接蛋白保持紧密连接而彼此连接。
ZO-1被示为在与其他紧密连接蛋白保持TJ完整性通过其相互作用中发挥重要作用，并 肌动蛋白细胞骨架组装。此外，肌动蛋白细胞骨架的精确调节是许多发育和生理过程，包括细胞 - 细胞粘连是必不可少的。在内皮细胞，肌动蛋白应力纤维形成被认为是与屏障功能障碍和高通透性13,14相关联。罗丹明phalloi嚣在本研究中用于观察F-肌动蛋白应力纤维形成标记技术是终点研究。然而，也可以进行的应力纤维形成动态和实时成像如图格特和布雷斯林15。
目前的研究majorly强调ZO-1的对BBB紧密连接的完整性的贡献。然而，其他的紧密连接分子如紧密连接蛋白5，紧密连接，连接粘附分子（JAM）等也可以被用作标记，以研究以下OGD-R的所述BBB紧密连接的完整性。在这项研究中，我们采用免疫荧光定位和F-肌动蛋白标记作为定性的技术来确定紧密连接的完整性。然而，我们也可以研究血脑屏障的使用荧光标记物和跨内皮电阻（TEER）的另一重要特征像渗透性的定量测量。
使用该OGD-R技术呈现在这项研究中Biospherix系统只能被用于在氧的固定浓度缺氧/缺氧研究;然而，我们不能使用该系统用于研究不同氧浓度对内皮细胞的作用。为了研究不同浓度的氧对内皮细胞的影响，我们需要采用适合于目的的其他可用的模型。
这种技术可以用于研究调节血脑屏障渗透性过高和TJ完整性各种细胞和分子事件之间的机械关系。了解他们将为制定各种分子策略，以减轻BBB破坏和微血管通透性的洞察力。
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Acknowledgments
我们承认斯科特和怀特医院研究资助计划提供财政支持和得克萨斯州A＆M大学健康科学中心大学的医学影像学综合实验室，利用激光共聚焦显微镜。我们承认格伦克莱尔先生的帮助，稿件编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
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