Abstract
Ischemia-riperfusione (IR) infortunio è noto per contribuire in modo significativo la morbilità e la mortalità associata con ictus ischemico. Accidenti cerebrovascolari ischemiche rappresentano l'80% di tutti i colpi. Una causa comune di lesioni IR è il rapido afflusso di liquidi dopo occlusione acuta / cronica di sangue, nutrienti, ossigeno al tessuto innescando la formazione di radicali liberi.
Ictus ischemico è seguito da barriera emato-encefalica (BBB) erettile e edema cerebrale vasogenico. Strutturalmente, giunzioni strette (TJS) tra le cellule endoteliali svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità della barriera ematoencefalica (BBB). Lesioni IR è uno dei primi lesione secondaria che conduce a un non specifico, la risposta infiammatoria. Ossidativo e stress metabolico seguente infiammazione innesca un danno cerebrale secondario compresi BBB permeabilità e la rottura di giunzione a tenuta (TJ) integrità.
Il nostro protocollo presenta in vitro </ Em> esempio di deprivazione di ossigeno e glucosio e riossigenazione (OGD-R) su cellule endoteliali cervello di ratto TJ integrità e la formazione di fibre di stress. Attualmente, molti sperimentale in modelli in vivo vengono utilizzati per studiare gli effetti di lesioni IR; ma hanno alcune limitazioni, come le difficoltà tecniche per l'esecuzione di interventi chirurgici, le influenze genetiche e molecolari dipendenti difficoltà di studiare le relazioni meccanicistiche. Tuttavia, i modelli in vitro possono aiutare a superare molti di questi limiti. Il protocollo presentato può essere usato per studiare i vari meccanismi molecolari e relazioni meccanicistici di fornire potenziali strategie terapeutiche. Tuttavia, i risultati degli studi in vitro possono essere diverse dallo standard studi in vivo e devono essere interpretati con cautela.
Introduction
Ischemia-riperfusione (IR) ferita si trova ad essere la causa frequente di varie complicazioni debilitanti e decessi associati a ictus, infarto miocardico, trauma, malattia vascolare periferica e traumi cerebrali 1,2. Lesioni IR in vasi cerebrali è uno dei primi lesione secondaria che porta a infiammazione ed edema 3. Una delle complicazioni gravi che si verifica a causa di stress ossidativo e metabolico seguito infiammazione è la perdita di equilibrio omeostatico che porta alla formazione di radicali liberi, alterazioni della barriera emato-encefalica (BBB) giunzioni strette (TJs) e la permeabilità microvascolare 4,5.
Attualmente, in modelli in vivo utilizzati per studiare gli effetti di lesioni IR sul BBB includere mezzo occlusione dell'arteria cerebrale (MCAO), microembolia, e transgenici o knockout animali. Tuttavia, ognuno ha i suoi svantaggi e limitazioni come discusso da Hossmann 6. Modello MCAO viene utilizzato per studiare il effects di stress redox, i cambiamenti nella comunicazione giunzionale della BBB e le interazioni tra il cervello e le cellule del sistema immunitario. Tuttavia, essi presentano vari problemi tecnici quali la necessità di precise procedure microchirurgia e le difficoltà in esso. Microembolia rompe istantaneamente lungo la BBB, mentre l'uso di transgenici o knockout animali per studiare ischemia cerebrale può avere sfide come influenze gene-dipendente molecolari sulla formazione infarto, cambiamenti di anatomia vascolare e vari peso corporeo 6. Quindi, modelli in vitro di ischemia hanno trovato un crescente interesse negli ultimi tempi soprattutto a causa della loro applicabilità in esecuzione di studi meccanicistici per i farmaci. Tuttavia, i risultati degli studi in vitro non possono rappresentare appieno uno studio in vivo e devono essere interpretati con cautela 6.
Effetto counteractive di basse concentrazioni di ossigeno su monostrati di cellule endoteliali e la permeabilità microvascolare sono statistudiato da Ogawa 7. Cellule endoteliali Rat microvascolari cerebrali (RBMECs) sono stati utilizzati per sviluppare in vitro BBB. La deprivazione di ossigeno e glucosio e riossigenazione (OGD-R) tecnica presentata in questo protocollo è stato adattato da studi di Zulueta et al e Zhu et al 8,9. Abbiamo esposto le cellule endoteliali cerebrali a OGD-R mettendoli in una camera di ipossia / anossia contenente 0% O 2, 5% di CO 2 e il 95% N 2. Le cellule sono state poi valutate per alterazioni TJ integrità e lo stress formazione fibra con localizzazione immunofluorescenza e l'etichettatura falloidina rodamina rispettivamente. Immunofluorescenza colorazione per zonula occludere-1 (ZO-1) viene eseguita per determinare l'integrità TJ, come ZO-1 è un importante membrana ponteggio legato proteina TJ. Etichettatura Rhodamine falloidina determina l'actina filamentosa (f actina) nel citoscheletro cellulare ed è una chiara indicazione di formazione fibra sforzo actina in cellule endoteliali.
<p class = "jove_content"> L'obiettivo di questo metodo è quello di fornire una conoscenza di sviluppo OGD-R come un modello in vitro IR per lo studio BBB cellule endoteliali integrità TJ e la formazione di fibre di stress f-actina. I risultati forniranno informazioni sulla sorte di proteine TJ, ZO-1 e la formazione di fibre di stress dopo OGD-R. La comprensione di queste relazioni sarà l'occasione per determinare i meccanismi molecolari alla base che vengono attivati seguendo OGD-R e sviluppare potenziali strategie terapeutiche per migliorare la perturbazione BBB in seguito al trattamento OGD-R.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Semina delle cellule endoteliali
- Ottenere colture primarie di RBMEC di da adulti Sprague Dawley (o ottenerle in commercio).
- Coltivare RBMECs a 100 centimetri fibronectina (50 mg / ml) capsule di Petri rivestita utilizzando il mezzo di crescita delle cellule endoteliali del cervello di ratto. Cambia il mezzo ogni due giorni, fino al raggiungimento di confluenza.
- Giunti 80-90% di confluenza, lavare delicatamente le cellule in 5 ml di tampone fosfato salino (PBS) agitando. Le cellule sono poi staccate esponendoli a 1 ml di soluzione calda 0,25% trypsin- acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), equilibrati a 37 ° C.
- Incubare le cellule a 37 ° C per 2-5 minuti fino a quando le cellule vengono staccate e dispersi.
NOTA: Toccare il piatto cultura per staccare le cellule. Vista cellule al microscopio per confermare completo distacco di cellule dalla superficie del piatto. - Aggiungere 5 ml completo supporto alla scatola Petri per neutralizzare tripsina.Pipettare il terreno contenente le cellule staccate e raccogliere in una provetta da centrifuga da 15 ml. .
- Centrifugare il supporto contenente cellule endoteliali a 220 g per 5 min.
- Aspirare il surnatante e conservare il pellet contenente cells.Suspend il pellet in 3-5 ml fresco cervello di ratto mezzo di crescita delle cellule endoteliali delicatamente mescolando su e giù con celle pipetta sarà quindi essere conteggiati con contatore di cellule automatico o un emocitometro.
- Trasferire la sospensione cellulare in fibronectina (50 ug / ml) prerivestita 8 sistema di scorrimento camera ben sterile, 0.7 cm 2 / pozzetto con una densità di semina compreso tra 10.000-15.000 cellule per pozzetto. Far crescere le cellule a 37 ° C fino a confluenza
NOTA: per l'esecuzione di macchie occidentali o altri esperimenti, le cellule possono essere coltivate in 10 centimetri piatti di coltura di cellule o piatti speciali, come richiesto dal esperimento.
2. ossigeno e glucosio privazione-riossigenazione in vitroModello
NOTA: Il seguente protocollo è stato adattato da Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9.
- Utilizza il sistema di coltura cellulare all'ipossia per studiare gli effetti di di OGD-R RBMECs in (vedi Figura 1). Setup e calibrare il sistema di coltura cellulare ipossia prima di iniziare l'esperimento, secondo le istruzioni del produttore.
- Rimuovere i vetrini camera confluent (passo 1,8) dalla C incubatore 37 °. Sostituire il terreno completo nella diapositiva da camera con deossigenato, senza glucosio, Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) e posto in camera di ipossia con il 95%, N 2 e 5% di CO 2 per 2 ore a 37 ° C, per rappresentare condizioni OGD.
- Spostare le cellule indietro per l'incubatore con 95% O 2, 5% CO 2 a 37 ° C e provvisto di fresco cervello di ratto cellule endoteliali terreno completo e incubare per un altro 1 ora a 37 ° C.
NOTA: Questo passo rappresenta una situazione riossigenazione. - Utilizzare le diapositive da camera per la localizzazione e l'etichettatura immunofluorescenza rodamina phalloidin (vedi sezione 3).
3. immunofluorescenza Localizzazione di ZO-1 e f Etichettatura actina Utilizzando Rhodamine falloidina
- Esporre le diapositive da camera contenenti monostrati RBMEC a 100 ml di Opti-MEM / siero ridotta media / bene per 1 ora. Lavare le diapositive camera 3 volte con 100 pl di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.0-7.2).
- Fissare le cellule con 100 ml di 4% paraformaldeide in PBS (pH 7.0-7.2) per 15 minuti e lavare i vetrini camera per 3 volte in PBS (pH 7.0-7.2).
- Permeabilize le cellule utilizzando 100 ml di 0,5% Triton X-100 in PBS, pH (7.0-7.2) per altri 15 min. Blocco con 100 ml di 2% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per un'ora. Dopo questo passaggio sia cellule macchia / etichetta sia per ZO-1 o f- actina.
- Per immunofluorescenza staining Incubare le cellule con un anticorpo anti-coniglio primaria contro ZO-1 a 1: 150, preparata in 2% BSA-PBS per O / N a 4 ° C. Lavare le cellule per 3 volte in PBS, (pH 7.0-7.2). Incubare con 100 ml di fluoresceina isotiocianato (FITC) -tagged anticorpo secondario anti-coniglio per 1 ora a temperatura ambiente.
- Per l'etichettatura Rodamina falloidina, dopo il blocco, esporre le cellule a 100 ml di rhodamine falloidina in diluizione 1:50, preparato nel 2% BSA-PBS, per 20 min.
- Lavare le cellule da immunofluorescenza e l'etichettatura rodamina falloidina in PBS, (pH 7.0-7.2). Montare le camere di utilizzo dei supporti di montaggio contenenti reagenti anti-dissolvenza con DAPI.
- Visualizzare le cellule utilizzando una lente immersione in acqua 60 X e le cellule sono scansionati in un unico piano ottico al microscopio confocale.
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Representative Results
Le cellule coltivate su fibronectina pretrattata camera di diapositive Nunc II sono stati sottoposti ad OGD-R mettendo in un modello Biospherix ProOx 110 camera. Dopo aver sottoposto celle a OGD-R, sono stati trattati per ZO-1 giunzionale colorazione utilizzando la tecnica di immunofluorescenza come mostrato in figura 2 e l'assemblaggio del citoscheletro indicando fibra formazione di stress F-actina usando label macchia rodamina falloidina come mostrato in figura 3. Le cellule di controllo che sono stati non sottoposto a OGD-R ha mostrato integrità delle giunzioni continuo mentre le cellule endoteliali sottoposte a OGD-R hanno mostrato giunzioni discontinui, che indica la perdita di TJ integrità figura 2. Le cellule di controllo che non sono stati sottoposti a trattamento OGD-R hanno mostrato nessuna o una minima f fibra di stress actina formazione mentre le cellule endoteliali sottoposte a OGD-R hanno dimostrato un aumento della formazione f fibra sforzo actina indicando i cambiamenti nel citoscheletro actina assemblaggio figura 3; Rappresentante Rint con il permesso di riferimento # 13
Figura 1. Tipica configurazione del modello di ipossia sistema ProOx 110. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. immunofluorescenza Localizzazione di stretta Junction Protein (TJP) ZO-1 Dimostrare Turbativa delle giunzioni strette seguenti OGD-R in RBMECs, come mostrato da bianchi Arrows. Scala bar = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.
Figura 3. Rhodamine falloidina etichettatura per f actina stress fibra Formazione Dimostrare Variazioni citoscheletro Assemblea Dopo OGD-R in RBMECs, come mostrato da bianchi Arrows. Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
OGD-R come un modello in vitro per danno da ischemia-riperfusione è stato ben definito per studiare i neuroni 10,11. Ci sono anche studi che dimostrano l'effetto di OGD sulle cellule endoteliali cerebrali e alterazioni nella permeabilità e TJ integrità 9. Tuttavia, il nostro studio mostra l'effetto di OGD nonché reoxygenation, che è una rappresentazione più stretta di riperfusione ischemica in condizioni in vivo che si verificano ictus ischemico seguente.
Condizioni di ipossia ischemica sono noti per indurre l'infiammazione nel sistema nervoso centrale, che porta a BBB perturbazione aumentando permeabilità paracellular e vasogenico 4. La riperfusione è molto complesso e dinamico processo, in cui vi è un'eccessiva produzione di specie reattive dell'ossigeno, l'esaurimento di ATP, aumento di potassio extracellulare, il rilascio di neurotrasmettitori eccitatori, endoteliale e gonfiore neuronale, l'attivazione delle cellule immunitarie. Questo, a sua volta, causes attivazione di varie vie infiammatorie, portando alla produzione di citochine, l'induzione di nucleasi e proteasi, portando a edema, che sono tutti dimostrato di attivare diverse caspasi, che porta alla rottura dell'integrità BBB 5,12. Le cellule endoteliali sono particolarmente soggetti a danno ischemico, per la presenza di un gran numero di mitocondri. Le cellule endoteliali adiacenti sono collegate tra loro da giunzioni strette mantenuti da proteine di giunzione stretti.
ZO-1 è indicata a svolgere un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità TJ dalla sua interazione con le altre proteine di giunzione stretto e il gruppo actina citoscheletro. Inoltre, la regolazione precisa della actina citoscheletro è essenziale per molti processi di sviluppo e fisiologici tra cui adesioni cellula-cellula. Nelle cellule endoteliali, fibra formazione di stress actina è risultato essere associati a disfunzione barriera e iperpermeabilità 13,14. Rhodamine phalloidin tecnica di marcatura utilizzato in questo studio per osservare la formazione di fibre di stress f-actina è uno studio punto finale. Tuttavia, imaging dinamico e vivo della fibra formazione stress può anche essere eseguita come dimostrato da Doggett e Breslin 15.
L'attuale studio sottolinea majorly il contributo di ZO-1 verso l'integrità bivio stretto BBB. Tuttavia, altre molecole di derivazione strette come claudina-5, occludina, molecole di adesione giunzionali (JAM), ecc possono anche essere utilizzati come marcatori per studiare l'integrità di giunzione a tenuta BBB seguente OGD-R. In questo studio, abbiamo impiegato localizzazione immunofluorescenza ed etichettatura f-actina come tecnica qualitativa per determinare l'integrità tight junction. Tuttavia, possiamo anche studiare le altre caratteristiche importanti del BBB, come misurazione quantitativa della permeabilità utilizzando marcatori fluorescenti e resistenza elettrica transendoteliale (TEER).
La tecnica OGD-R presentato in questo studio utilizzando laSistema Biospherix può essere utilizzato solo per gli studi ipossia / anossia ad una concentrazione fissa di ossigeno; tuttavia, non possiamo utilizzare questo sistema per studiare l'effetto della variazione concentrazioni di ossigeno sulle cellule endoteliali. Per studiare gli effetti di diverse concentrazioni di ossigeno sulle cellule endoteliali dobbiamo utilizzare altri modelli disponibili adatti allo scopo.
Questa tecnica può essere utilizzata per studiare le relazioni meccanicistici tra vari eventi cellulari e molecolari che regolano BBB iperpermeabilità e integrità TJ. La comprensione si forniscono informazioni per lo sviluppo di varie strategie molecolari per attenuare disagi BBB e microvascolare permeabilità.
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Acknowledgments
Riconosciamo Scott and White Hospital Assegni di Ricerca Programma per il sostegno finanziario e Texas A & M Health Science Center College of Medicine Laboratorio Integrato Imaging per l'utilizzo del microscopio laser confocale. Riconosciamo Mr. Glen Cryer per un aiuto con la modifica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, no glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-tagged anti-rabbit secondary antibody | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Any other PBS available can be used |
References
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