Мы описываем здесь, как подготовить кости кондиционером среду (BCM) и проверить его деятельность в пробирке.
Аутологичные костные трансплантаты широко используется в челюстно-лицевой хирургии, ортопедии, травматологии и. Аутологичные костные трансплантаты не только заменить отсутствующий кости, они также поддерживают сложный процесс регенерации костной ткани. Это благоприятное поведение аутотрансплантатов объясняется тремя характеристиками: Остеокондуктивность, osteogenicity и остеоиндуктивность. Тем не менее, есть еще один аспект: костные трансплантаты выпустить множество молекул, в том числе факторов роста, которые могут предназначенных мезенхимных клеток, участвующих в регенерации кости. Паракринной свойства костных трансплантатов могут быть изучены в пробирке с использованием костно-кондиционированной среды (БМВ). Здесь мы приводим протокол о том, как подготовить среду кости кондиционером из родного свинья кортикальной кости, и кости, что подвергся термической обработке или деминерализации. Клетки могут быть непосредственно подвергаются BCM или высевали биоматериалов, таких как коллаген мембраны, ранее пропитанных BCM. Приведем примеры для в пробирке bioassaYS с мезенхимных клеток на экспрессию TGF-β регулируемых генов. Представленные протоколы должны поощрять дальнейшее выявить паракринные эффекты костные трансплантаты во время регенерации костной и открыть путь для трансляционных исследований в широкой области реконструктивной хирургии.
Аутокостью широко используется для преодоления недостатков, которые произошли в результате пороков развития, resective хирургии, реконструктивной хирургии травмы и до имплантации 1,2. Понимание биологических принципов, как кости трансплантаты поддерживает процесс консолидации трансплантата является не только ключом к пониманию, почему аутографты считаются золотым стандартом в реконструктивной хирургии, это также бионической улучшенной конструкции костных заменителей 3. Тем не менее, консолидация трансплантата быстрее аутокостью сравнению с костной заменяет 4,5. Таким образом, крайне важно выявить молекулярные и клеточные механизмы, которые делают аутокостью так эффективной поддержки регенерации костной ткани.
Есть три учебника характеристики аутотрансплантатов, считающихся поддерживает процесс консолидации 6,7. Во-первых, аутологичных кости остеокондуктивным, обеспечивая руководство для вновь образованной кости растив дефект. Во-вторых, аутологичной кости остеогенная, что означает, что она содержит мезенхимальные клетки, которые могут дифференцироваться в остеобласты 8. В-третьих, аутологичных кости остеоиндуктивный, как факторы роста, такие как морфогенетические белки кости погребенных в матрице может инициировать процесс эндохондральных или даже Intramembranous формирования костной 9. Существует еще один аспект: свежеприготовленные чипсы кости провести паракринную функцию, основанную на наблюдениях в пробирке с "средней кости кондиционером" 10-15. Кроме воздействие миелопоэза Следует отметить, 16. Аналогичный термин "матрица с кондиционером среднего деминерализованной кости" уже придуман в 1996 году и поддерживает общую концепцию паракринным функции костей, даже при обработке деминерализации 17. Для наших целей, BCM могут быть получены из свежего свиньи Мандибулы 10,11. Протеомные анализы показали, BCM сложный состав, в том числе то, ростаПРС и компоненты внеклеточного матрикса 10, также расширяет существующие знания на протеасоме всей кости 18,19. Таким образом, BCM должен отражать выпущенный активность различных модификаций костные трансплантаты в пробирке.
Что происходит, когда мезенхимальные клетки, например, выделенные из костной стружки или из мягкой ткани полости рта, подвергаются BCM? В пробирке, BCM уменьшает остеогенной дифференцировки и Adipogenic, и провоцирует сильное увеличение экспрессии IL11 11. Геном шириной микрочипов показали несколько генов, которые будут по-разному выражается в мезенхимальных клеток в ответ на ВСМ. Среди этих генов адреномедуллин (АДМ), IL11, IL33, НАДФН-оксидазы (4 NOX4), протеогликан 4 (PRG4 или лубрицином) и pentraxin 3 (PTX3) 15. BCM получены из автоклавного фишек кости не удалось изменить выражение соответствующих генов 14. BCM от кости чипов, которые прошли пастеризацию и замораживание удалосьизменить экспрессию генов 14. Также кондиционером среднего деминерализованной костной матрицы (ДКМ-CM) изменяет экспрессию TGF-β-регулируемых генов 20. Интересно, что коллаген барьерные Мембраны, используемые для защиты кусочков кости от окружающих мягких тканей 21,22, адсорбированный те части ВСМ, которые отвечают за изменений в экспрессии генов 23. BCM исследования могут быть распространены на другие типы клеток, участвующих в регенерации кости, такие как кости резорбции остеокластов и эндотелиальных клеток, чтобы назвать несколько. В целом, данные накапливаются в пробирке обеспечить научную основу для дизайна доклинических исследований.
Настоящий Протокол два: во-первых, он показывает, как подготовить BCM. Во-вторых, она показывает, как проверить его биологическую активность на основе мезенхимальных клеток в пробирке.
Кость кондиционером среднего отражает выпущен деятельность костных имплантатов во время ранних стадиях регенерации костной ткани. Протокол, описанный здесь, может быть адаптирован для изучения реакции различных типов клеток, участвующих в регенерации кости. Кроме того, протокол мож?…
The authors have nothing to disclose.
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Pig Mandibles | Local bucher | ||
Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
Primers | Microsynth | ||
SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
PBS | Roche | 11666789001 |