Summary
我々は、骨馴化培地（BCM）を調製し、インビトロでその活性をテストする方法をここで説明します。
Abstract
自家骨移植が広く口腔外科、整形外科、および外傷学で使用されています。自家骨移植が唯一欠けている骨を交換しないで、彼らはまた、骨再生の複雑なプロセスをサポートしています。骨伝導、骨形成、および骨誘導性：自家移植のこの有利な動作は、次の3つの特性に起因します。しかし、他の態様が存在する：骨は、骨再生に関与する間葉細胞を標的とすることができる成長因子、を含む分子、無数の移植片を解放します。骨移植片のパラクリン特性は、骨馴化培地（BCM）を使用してインビトロで研究することができます。ここでは、熱処理または脱塩を受けたネイティブ豚の皮質骨から骨馴化培地を調製する方法に関するプロトコル、および骨を提示します。細胞は、直接BCMにさらされたり、コラーゲン膜、以前BCMに浸したような生体材料上に播種することができます。我々は、in vitroで bioassaの例を与えますTGF-β調節遺伝子の発現に、間葉系細胞とYS。提示されたプロトコルは、さらに、骨再生の際に骨移植片のパラクリン効果を明らかにし、再建手術の幅広い分野でトランスレーショナルリサーチのためのパスを開くことが奨励すべきです。
Introduction
自家骨は広く奇形、resective手術、再建外傷外科手術、および配置1,2を注入する前の結果として発生した欠陥を埋めるために使用されます。骨移植片は、移植片の統合のプロセスをサポートする方法の生物学的な原理を理解することは自家移植が再建手術におけるゴールドスタンダードであると考えられている理由を理解するための唯一のキーではない、それはまた、代用骨3の改良されたデザインにバイオニックです。それでも、移植片の統合は、より高速な自家骨と骨置換4,5に比べてです。これにより、骨再生をサポートするので、効果的な自家骨を作る分子および細胞のメカニズムを明らかにすることが不可欠です。
統合プロセス6,7を支持すると考えられる自家移植片の三教科書特性があります。まず、自家骨が成長するために、新たに形成された骨のためのガイダンスを提供し、骨伝導性であり、欠陥へ。第二に、自家骨は、骨芽細胞に分化することができる8間葉細胞を含むことを意味し、骨形成性です。第三に、自家骨は、マトリクス状に埋葬骨形成タンパク質のような成長因子は、軟骨内、あるいは膜内骨形成9のプロセスを開始することができるように骨誘導性です。別の側面があります：新たに調製した骨片は「骨馴化培地」10〜15 を用いたin vitroの観察に基づいて、パラクリン機能を保持します。また、骨髄造血の影響は、16を言及すべきです。類似の用語「脱灰骨基質馴化培地は、「すでに脱塩17によって処理される場合であっても、1996年に造語と骨のパラクリン機能の全体的な概念をサポートしていました。我々の目的のために、BCMは10,11を下顎骨新鮮なブタから調製することができます。 BCMのプロテオーム解析は、成長事実を含め、複雑な組成を明らかにしましたORSと細胞外マトリックス10の構成要素は、また、全体の骨18,19のプロテアソームの既存の知識を拡張します。このように、BCMは、in vitroで骨移植片の様々な改変の解放の活動を反映する必要があります。
間葉系細胞は、例えば骨チップから、または口腔の軟組織から単離されたもののため、BCMする？ インビトロで露出しているときに何が起こるか、BCMは、骨形成および脂肪生成分化を減少させ、IL11発現11の強力な増加を引き起こします。全ゲノムマイクロアレイは示差BCMに応答して、間葉系細胞で発現する複数の遺伝子を明らかにしました。これらの遺伝子の中アドレノメデュリン（ADM）、IL11、IL33、NADPHオキシダーゼ4（のNox4）、プロテオグリカン4（PRG4、またはルブリシン）とペントラキシン3（PTX3）15があります。オートクレーブ処理骨チップから得られたBCMは、それぞれの遺伝子14の発現を変更することができませんでした。低温殺菌および凍結を受けた骨チップからBCMをすることができました遺伝子発現14を変更します。脱灰骨基質（DBM-CM）のも馴化培地は、TGF-β調節遺伝子20の発現を変化させます。興味深いことに、周囲の軟組織21,22の骨チップを保護するために使用されるコラーゲンバリア膜は、遺伝子発現の23の変化の原因であるBCMの部分を吸着させました。 BCMの研究がいくつか例を挙げると、例えば、骨吸収破骨細胞および内皮細胞のような骨再生に関与する他の細胞型に拡張することができます。全体的に、蓄積インビトロのデータは、前臨床試験の設計のための科学的根拠を提供します。
本プロトコルは、2つあります：まず、BCMを準備する方法を示しています。第二に、in vitroでの間葉系細胞に基づいて、その生物学的活性をテストする方法を示しています。
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Protocol
1. BCMの準備
- できるだけ新鮮な地元の肉屋から豚の下顎を取得します。しっかりと表面に下顎を置き、骨に接続されているすべての軟組織や骨膜を残さない特別な注意を払って全厚フラップをリリース。流フードの下で働くために必要とすることなく、クリーンな環境で動作します。
- 全層フラップが解放されると、頬側から骨片を採取するために、骨のスクレーパーを使用しています。骨スクレーパーがシャープにする必要がありますのでご注意ください。しっかりと骨のスクレーパーを処理し、長い運動が骨を収集しています。小さいその1ミリメートルの骨チップを捨てます。
- ネイティブの骨チップを維持するために、1％抗生物質およびそれらを乾燥させない抗真菌剤を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で直径10cmのプラスチック皿に直接骨チップを配置します。
- 熱処理の影響を評価するために、被験者の骨チップは、80℃で30分間低温殺菌するか、または121℃で20分間オートクレーブ。
- 脱塩の影響を評価するために、4℃で4~6時間、1MのHCLに骨チップを振るし、pHが中性になるまで培養液で繰り返し洗浄します。
- 10ミリリットルあたりの骨チップ5gの新しいプラスチック皿に1％の抗生物質および抗真菌剤を補充した新鮮なDMEMの合計を配置します。
- 24時間、37℃の加湿雰囲気中で、プラスチック皿を置きます。そして、収穫BCM。遠心分離機、残骸を削除する滅菌（0.2 nm）をフィルタリングし、-80℃で凍結アリコートを維持するために10分間、200×gでBCM。
- 使用直前にBCMストックを解凍し、凍結融解の繰り返しサイクルを避けます。
- 示された実験のために、RTで1時間BCMまたは無血清培地を用いてコラーゲン膜を浸します。 PBSと激しく膜を洗浄し、96ウェルプレートに入れます。湿潤膜は、細胞を播種します。
- BCMの調製方法を図1に要約されています。
間葉系細胞に基づく2バイオアッセイ
- 30,000細胞/ cm 2の濃度で12ウェルプレートにシード（例えば、骨細胞、歯肉および歯根膜線維芽細胞のための）ヒト間葉系細胞。細胞を播種するにはDMEM、10％ウシ胎児血清および抗生物質からなる成長培地を使用します。細胞がプレートO / Nに接続してみましょう。
- 培地を廃棄し、37℃で予め加温したPBSで細胞を洗浄します。で、20％BCMなし予め温めた無血清培地を添加することによって細胞を刺激します。 24時間、37℃で加湿雰囲気中で細胞を配置します。
- 、培地を捨て、予め温めておいたPBSで細胞を洗浄し、お好みのプロトコルに従ってRNAを抽出します。
- 各試料中のRNAの同量を有するためにRNAの濃度を調整します。 cDNAを準備し、 表1に示すプライマーを用いて、選択された遺伝子を分析するためのqRT-PCRを行います。
注：2×SYBRグリーン、前方の20xプライマー、20Xプライマーリバース、5倍の滅菌DD水、5倍のcDNA：これらは、すべてのコンポーネントの希釈液です。定量RT-PCRは、95℃15秒、60℃1分の40サイクルで行われます。 - CT GAPDHおよびΔ（ΔCT）ΔCT刺激される - - ΔCT制御ΔCTがCTターゲットであるΔ（ΔCtの）メソッドを使用して、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに正規化することによって、相対的な発現レベルを計算します。
- この品質管理の後、間葉細胞、造血細胞または内皮細胞を含む細胞の全ての種類を刺激するために培地にBCMを追加します。
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Representative Results
骨馴化培地を、新鮮なブタの骨片から製造されます。 BCMを準備し、BCMと組み合わせて生体材料を使用するプロセスの概要をそれぞれ図1および図2に示されています。 BCMの準備中に、最終的なBCMの品質に影響を与えることができ、短い運動または非常に小さな骨チップ限り動きに大きな骨チップを得ることが重要です。 ADM、PTX3、IL11、IL33、PRG4のNox4と（ 図3）：BCMの品質BCM標的遺伝子の遺伝子発現を解析することによって制御することができます。 ADMとPTX3は0.4倍にまでダウンレギュレートされ、200倍にアップレギュレートさIL11、IL33、Nox4はとPRG4をすることができます。経口線維芽細胞を示すレベルでBCM標的遺伝子を発現しない場合は、4のディスプレイを図口腔線維芽細胞におけるBCMの標的遺伝子の発現の典型的な結果は、コラーゲンバリア膜上に播種された細胞の健康状態を確認するか、新しい下顎から新しいBCMを準備。低温殺菌骨チップからの馴化培地および脱灰骨チップからの馴化培地を20％刺激口腔線維芽細胞は、BCM（ 表2及び表3）で刺激した細胞と同様の遺伝子発現を示しました。しかし、滅菌（121℃）、骨チップからの馴化培地に暴露され、口腔線維芽細胞の遺伝子発現は、非刺激対照と同等でした。
図1.新鮮なブタ下顎骨の骨馴化培地を調製するために使用されるプロセスの概要。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.概要BCMとの間葉系細胞に基づくバイオアッセイの。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
口腔線維芽細胞における骨馴化培地標的遺伝子の3遺伝子発現を図。 BCM。遺伝子のADMとPTX3 の品質を制御するために使用される6つの遺伝子の典型的な結果は、ダウンレギュレートされる（A）およびIL11が、IL33、Nox4は、PRG4は、（B）をアップレギュレートされている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4.骨conditioneの遺伝子発現コラーゲンバリア膜上に播種し、口腔線維芽細胞におけるD媒体標的遺伝子。BCMの品質を制御するために使用される6つの遺伝子の典型的な結果。遺伝子のADMとPTX3はダウンレギュレートされる（A）およびIL11、Nox4を、PRG4は、（B）をアップレギュレートされています。使用される生体材料に応じて、成長因子の吸収が異なることができます。コラーゲン膜は、したがって、IL33の発現は、この設定では規制されていないIL33発現を制御する因子を吸収することができなかった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 略語 | フォワードプライマー | リバースプライマー |
| GAPDH | AGCCACATCGCTCAGACAC | GCCCAATACGACCAAATCC |
| ADM | GGACATGAAGGGTGCCTCTC | TGTTCATGCTCTGGCGGTAG |
| IL11 | TGCACCTGACACTTGACTGG | AGTCTTCAGCAGCAGCAGTC |
| IL33 | TCAGGTGACGGTGTTGATGG | GGAGCTCCACAGAGTGTTCC |
| のNox4 | TCTTGGCTTACCTCCGAGGA | CTCCTGGTTCTCCTGCTTGG |
| PRG4 | CGACGCCCAATGTAAGAAGT | GGTGATGTGGGATTATGCACT |
| PTX3 | TGTATGTGAATTTGGACAACGAA | CATTCCGAGTGCTCCTGAC |
表1：使用する6遺伝子のプライマー配列。
| 遺伝子 | 80℃の平均±SD | 121℃の平均±SD |
| ADM | 0.2±0.1 | 1.1±0.2 |
| PTX3 | 0.1±0.1 | 0.9±0.2 |
| IL11 | 20±10 | 1.5±1 |
| IL33 | 15±5 | 1.2±4 |
| のNox4 | 35±15 | 2±1 |
| PRG4 | 40±10 | 1.8±1 |
表2：ADM、PTX3、IL11、IL33、熱処理された骨片からの馴化培地の20％で刺激口腔線維芽細胞でのNox4とPRG4の典型的な遺伝子発現。
| 遺伝子 | 平均±SD |
| ADM | 0.1±0.1 |
| PTX3 | |
| IL11 | 15±5 |
| IL33 | 20±10 |
| のNox4 | 60±15 |
| PRG4 | 50±20 |
表3：ADM、PTX3、IL11、IL33、脱塩骨チップからの馴化培地の20％で刺激口腔線維芽細胞でのNox4とPRG4の典型的な遺伝子発現 。
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Discussion
骨馴化培地は、骨再生の初期段階の間に骨移植片の解放の活動を反映しています。ここで説明するプロトコルは、骨再生に関与する細胞の異なるタイプの応答を研究するために適合させることができます。さらに、プロトコルは、処理骨または骨充填剤からの馴化培地を調製するために用いることができます。様々な天然および処理骨から放出因子：方法は実行し、シンプルなコンセプトに依拠するのは簡単です。 BCMは、間葉系細胞にどのように影響するかを理解することは、移植片の統合と骨自家移植片の特性についての詳細を学ぶのを助けることができます。この考え方に基づき、我々は、3つの主要な系統への間葉系細胞の遺伝子発現にだけでなく、増殖、移動、および分化の11,15ネイティブおよび処理骨14,20から得られたBCMの影響に関する知識を蓄積してきました。骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞11。 BCMはまた、TAの能力を調べました破骨細胞形成13の変調に関しては、例えば、造血細胞を目標確認。多くの潜在的な標的細胞がin vitroで BCMに応答するために待っている、ここで紹介するプロトコルは、この研究のためのプライマーとして機能することができます。
提示されたプロトコルまたBCMは間葉細胞において特にTGF-β調節遺伝子を活性化する方法の分子機構を明らかにするためにアニメートすべきです。例えば、私はSB431542をアンタゴニスト、TGF-β受容体が遺伝子パネルのADMの発現にBCMの影響を遮断し、IL-11、Nox4を、PRG4、及びPTX3 11,15。興味深いことに、アルカリホスファターゼおよびIL33は、他の未知の経路がBCMによって規制されていることを示唆しているSB431542 11,15によって逆転されませんでした。他の未解決の問題は、細胞応答を担当するBCM中の分子がどのようなものでしょうか？ BCMは、TGF-βが含まれていますが、複雑な細胞反応10,11を説明していないです。 中に加えて携帯側面を体外、全体的な疑問は残る：どの拡張するBCMに反映されるように骨移植片の解放活動を行い、骨再生の in vivoでの処理に影響がありますか？バイオアッセイのプロトコルやデータは、この方向での研究を導入すべきです。
このプロトコルには限界があります。 BCMは完全にため、ドナーや収穫技術間のばらつきを標準化することはできません。また、 生体内に存在する酵素は、組成物またはBCMの活動にどのように影響するか不明です。今後の研究は、例えば、収穫技術はBCMの「生物学的活性」をどのように影響するかに焦点を当てるべきです。 BCMの組成に骨細胞の役割も詳細に検討されるべきです。 BCMは、スクレロスチン、骨12でほぼ独占的にリリースされ、分子が含まれています。制限は、しかし、研究の次のステップのためのインスピレーションを提供します。 BCMとの研究の臨床的関連性はHYのままにもかかわらず、potheticalは、我々のプロトコルは、骨移植片は、天然または処理後のいずれかは、「生物学的活性」をリリースすることを長年の概念をサポートしています。 BCMは、 インビトロで細胞にどのように影響するかを理解することは、おそらく骨自家移植は、 生体内でどのように機能するかを理解するのに役立ちます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。ジョルディカバリエ·セラーノは、歯科研究と教育、バーゼル、スイスの財団から奨学金を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
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