We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.
Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.
Modulazione colinergica circuito eccitabilità contribuisce ad aspetti fondamentali della cognizione, e modulazione colinergici alterato è una caratteristica di malattie neurodegenerative e neuropsichiatrici tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la schizofrenia e la dipendenza 1-4. Un meccanismo stabilito di facilitazione colinergici della trasmissione sinaptica nel sistema nervoso centrale è attraverso l'attivazione diretta di nAChR localizzati nei siti pre-sinaptici. L'attivazione di questi recettori presinaptici porta ad un aumento intracellulare Ca 2+ ([Ca 2+] i) nei terminali presinaptici – sia direttamente, a causa della relativamente alta conduttanza di calcio di alcuni sottotipi di nAChR, e indirettamente, tramite intracellulari cascate di segnalazione 5, rafforzando in tal modo il rilascio di neurotrasmettitore. Infatti, l'attivazione del nAChR pre-sinaptici è stato collegato con i cambiamenti nel rilascio di un'ampia varietà di neurotrasmettitori compresi glutammato, GABA, ACh, unnd dopamina 6-10. Sebbene questo processo è stato studiato indirettamente utilizzando metodi elettrofisiologici a vari sinapsi, reporter ottiche di [Ca 2+] i e riciclo delle vescicole sinaptiche permettono misura più diretta e temporalmente precisa dei fenomeni pre-sinaptici.
Localizzazione pre-sinaptica dei nAChR è stata dimostrata in modo convincente con etichettatura immuno-oro diretto della nAChR al microscopio elettronico (EM) il livello 11,12. Diverse altre tecniche sono state utilizzate anche per affrontare la localizzazione nAChR indirettamente, anche rilevando posizioni di nAChRs subunit- fluorescenti chimere proteine in neuroni in coltura 13,14, registrazione elettrofisiologica delle correnti nAChR nei terminali sinaptici 15,16, il monitoraggio nicotina indotto cambiamenti in [Ca 2 +] i in terminazioni nervose sinaptiche di immagini dal vivo delle cellule 17, e monitoraggio indiretto del rilascio di neurotrasmettitore al terminale sinaptico datecniche di imaging cellulare dal vivo con indicatori fluorescenti, tra cui esocitosi delle vescicole sinaptiche visti da stirilici coloranti anfipatiche FM (FM1-43 e FM4-64) e / o Synapto-pHluorin e da specifici neurotrasmettitori reporter fluorescenti, come CNiFERs per ACh e iGluSnFr per il glutammato 18-20. Nel complesso, questi approcci attuali per identificare la localizzazione pre-sinaptica di nAChR sono complicate e richiedono sistemi e tecniche speciali per permettere l'identificazione affidabile e monitoraggio fisiologico di attività pre-sinaptica.
Qui si descrive protocolli e attrezzature per un sistema di co-coltura in vitro di un ippocampo ventrale (vHipp) – nucleus accumbens (NACC) circuito che fornisce accesso diretto a identificare e analizzare i due componenti pre e post-sinaptici della trasmissione sinaptica. Mostriamo esempi di localizzazione pre-sinaptica di nAChR e imaging cellulare dal vivo di nAChR mediata Ca 2+ di segnalazione e di rilascio dei neurotrasmettitori aloassoni ng vHipp. Una naturale estensione (e semplice) del protocollo presentato qui è la preparazione di contatti pre e post-sinaptiche composti da neuroni provenienti da diversi genotipi. In questo modo il contributo di un particolare prodotto genico al pre e / o meccanismi di post-sinaptici di modulazione può essere valutata direttamente.
La preparazione co-coltura descritto ri-capitola ventrale circuiti dell'ippocampo-accumbens in vitro. Questo esame permette di preparazione relativamente semplice e affidabile dei profili spazio-temporali per cui l'attivazione di nAChR pre-sinaptici suscitare esaltata trasmissione glutamatergica 5, 21.
Co-colture sono definite come la crescita di diversi tipi cellulari specifici in un piatto che può fornire condizioni fisiologiche in vitro per dimostrare…
The authors have nothing to disclose.
We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.
1, Culture Media (50 ml) | |||
Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
2, washing media (HBSS, 100 ml) | |||
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
3, HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
5, Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |