Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

HeLa Baseret Cell ytringsfrihed Systemer til ekspression af Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

Ekspression af malaria proteiner i cellebaserede systemer stadig en udfordring. Vi demonstrerer to trin og et skridt IVT (in vitro translation) celle gratis ekspressionssystemer til at udtrykke malaria rekombinante rhoptry proteiner fra HeLa-celler. Vi bruger en Ni-harpiks affinitet baseret rensningssystemet for at oprense rhoptry proteiner.

Abstract

Malaria forårsager betydelig global sygelighed og dødelighed. Ingen rutinemæssig vaccine er i øjeblikket tilgængelig. En af de vigtigste årsager til manglen på en vaccine er udfordringen at identificere egnede vaccinekandidater. Malaria proteiner udtrykkes under anvendelse af prokaryote og eukaryote cellebaserede ekspressionssystemer er dårligt glycosylerede, generelt uopløselige og undergår ukorrekt foldning fører til reduceret immunogenicitet. De hvedekim, kaninreticulocytlysat og Escherichia coli lysat cellefrie ekspressionssystemer øjeblikket anvendes til ekspression af malaria proteiner. Men længden af ​​ekspression tid og forkert glycosylering af proteiner stadig en udfordring. Vi demonstrerer ekspressionen af Plasmodium proteiner in vitro ved hjælp af HeLa baseret celle fri ekspressionssystemer, betegnet "in vitro celle fri ekspressionssystemer menneskelige". De 2 HeLa baseret cellefrie ekspressionssystemer transskribere mRNA i 75 min og 3 pi transcribed mRNA er tilstrækkeligt til at omsætte proteiner i 90 min. Den 1-trins ekspressionssystem er en transkription og translation koblet ekspressionssystem; transkription og co-translation forekommer i 3 timer. Processen kan også udvides til 6 timer ved at give ekstra energi. I 2-trins ekspressionssystem mRNA først transkriberes og derefter tilsat til oversættelse mix for proteinekspression. Vi beskriver, hvordan man kan udtrykke malaria proteiner; en hydrofob PF3D7_0114100 Maurers kløft - 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, et hydrofilt PF3D7_0925900 protein og et bæltedyr gentagelser indeholder protein PF3D7_1361800, ved hjælp af HeLa baserede celle ytringsfriheden system. Proteinerne udtrykkes i mikro mængder anvender 2-trins og 1-trins expression strategier. En affinitet oprensningsmetode at oprense 25 pi proteiner, der udtrykkes ved hjælp af in vitro humane celle fri ekspressionssystem er også beskrevet. Proteinudbytte bestemmes ved Bradfords assay og det udtrykteog oprensede proteiner kan bekræftes ved western blotting-analyse. Udtrykte rekombinante proteiner kan anvendes til immuniseringer, immunassays og protein-sekventering.

Introduction

I malaria forskning, ekspression af immunogene proteiner under anvendelse prokaryote eller eukaryote cellebaserede systemer fortsat en udfordring. AT rigdom af Plasmodium genom og ukendte indlæg translationelle mekanismer 14,7, bidrage til de vanskeligheder, der er forbundet med at få ordentligt foldede og immunogene proteiner for antistof produktion og vaccine undersøgelser. Prokaryote systemer såsom Escherichia coli er blevet anvendt til rekombinant proteinekspression. Prokaryote systemer er billige, effektive, producerer høje udbytter af rekombinant protein og har flere kloningsvektorer. Vært E. coli-celler er lette at omdanne og celler vokser hurtigt. Men prokaryote systemer har begrænsninger såsom manglende aminosyresubstitution, posttranslationel modifikation, risiko for forurening, heterogene produkter og akkumulering af rekombinante proteiner i inklusionslegemer 24.

I enundersøgelse af Mehlin et al. (2006), blev 1000 åbne læserammer (ORF) udtrykkes. Ca. 7% af de udtrykte proteiner var opløselige 14. Uopløseligheden observerede skyldes den forspændte karakter af generne og den høje frekvens af kodoner, der anvendes ideelt set inden Plasmodium AT rige genom 14. En alternativ strategi til at overvinde dette problem er blevet udviklet ved anvendelse af plasmider eller værtsceller indeholdende tRNA'er der genkender sjældne kodoner eller kodoner, der svarer til frekvenserne 3. Selv efter udførelse af disse optimeringer, er meget små portioner af proteiner udtrykt som opløselig, aktiv og immunogen 14. De cellefrie ekspressionssystemer indeholder alle de komponenter, der er nødvendige for transskription og translation, såsom ribosomer, initieringsfaktorer, forlængelse faktorer (oversættelser faktorer), tRNA og aminoacyl-tRNA syntetaser. Både transkriptions- og translationsreaktioner er koblet i ettrinsprocedure 11,29. Den transcriptio n reaktion udføres i et rør før passende mængde mRNA inkuberes med oversættelse maskiner i et andet rør 11,29. Selv om disse fremgangsmåder har succes i Plasmodium sp. Proteinekspression, en væsentlig ulempe er længden af tid for proteinekspression, der er ca. 22 timer 29. Hertil kommer, at høje omkostninger af forsyninger til optagelse i protokollerne 29, de arbejdskraftintensive præparater af cellelysat og uoverensstemmelser i komponent præparater, gør disse systemer uopnåelige. Hovedfokus for forskere for udvikling af en celle ytringsfrihed systemet afhænger af faktorer såsom hurtig genetisk modifikation, hurtige udbytter med høje koncentrationer og ligetil præparater lysat 1.

Eukaryote systemer, såsom gær, mammale cellelinier, baculovirus medieret ekspressionssystem, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum og parasitære ekspressionssystemer such som Leishmania er blevet anvendt til rekombinant proteinekspression 7. Eukaryote systemer deler fylogenetiske forhold, og derfor også dele karakteristika såsom glycosylering, acylering, disulfidbindingsdannelse, chaperone interaktion, proteolyse og sub-cellulær opdeling. Proteinsekretion begivenheder i eukaryoter forhindre ansamling og reducerer toksiciteten for ekspressionssystemer 13. Anvendelsen af gær-systemer foretrækkes, da de er egnede til proteinekspression i stor skala og til opnåelse af høje udbytter 4. To P. falciparum-proteiner PfCP-29 og Pvs25 blev fremstillet under anvendelse gærsystemet 4. Imidlertid en stor ulempe ved syntesen af de fleste af proteinerne var uregelmæssige N og O-glycosyleringsmønstre, forkert foldning og trunkering af proteiner fra deres native form 4.

Anvendelsen af ​​mammale celler til syntese af rekombinante proteiner er arbejdskrævende, og det er omkostSive at opretholde stabile rekombinante cellelinier 4. Derfor er pattedyrceller været begrænset til analyse af protein-signalering, protein-interaktioner og parasit-værts-interaktioner og også til afprøvning DNA-vacciner 4. The Human DNA og mRNA in vitro proteinekspression cellefrit system beskrevet heri er en HeLa-celle-afledt pattedyr-baseret system, der udtrykker proteiner i 3 timer. Proteiner udtrykt ved hjælp pT7CFE1-Chis ekspressionsvektoren har en C-terminal tag letter identifikation og rensning. Den HeLa baserede system suppleres med translationsinitierings- faktorer og en oversættelse regulator, og derved øge effektiviteten af ​​oversættelsen systemet. Proteiner kan hurtigt oversat, afskærmet, verificeret og forarbejdet til brug i forskellige immunologiske og strukturelle applikationer 15.

Eukaryote cellefrie ekspressionssystemer, såsom hvedekim og kaninreticulocyt øjeblikket anvendes til ekspression af varskellige eukaryote proteiner, herunder Plasmodium proteiner 11,29. Desuden E. coli baserede cellefrie systemer er også anvendes til eukaryotisk proteinekspression 11. Tabel 1 opsummerer forskellige cellefrie ekspressionssystemer ved at sammenligne træk ved de systemer samt letheden ved hjælp af systemer til proteinekspression. Den humane cellefrit system i forhold til de andre har evnen til at udføre post- og co-translationelle modifikationer og er billigere. Kodonoptimering er muligt og alle reaktionerne kan udføres i 3 timer. Den HeLa-systemet er et ideelt oversættelsessystem for proteinsyntese i indstillingen laboratorium.

En væsentlig fordel ved humane cellefrie ekspressionssystemer end andre cellefrie systemer er tilgængeligheden af ​​adskillige forskellige cellelinjer afledt af forskellige organer og væv. Flere sorter af cellefrie systemer kan udformes afhængigt af cellelinjen. Ekstraktens afledt fra pattedyrceller har højere effektivitet til at syntetisere store proteiner end nogen andre celle fri ekspressionssystemer. Disse celle fri ekspressionssystemer kan også bruges i diagnostiske og protein karakterisering applikationer såsom mikro arrays 30. De populære HeLa-cellelinjer anvendes mest til at udføre ekspression af proteiner 33. Det endoplasmatiske reticulum i HeLa-cellelinjer er underudviklet, hvilket fører til fravær af post-translationel glycosylering modifikationsaktivitet 33. Imidlertid er dette system menes at være fordelagtig for Plasmodium proteinsyntese som Plasmodium mangler også glycosylering efter translation modificering 29. Den HeLa cellefri transkription-translation-protokol er let at udføre, billig og proteiner kan udtrykkes i 90 min, klar til rensning og yderligere efterfølgende anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af Parasite Cell Cultures, Indsamling af Parasite Pellets

  1. Forbered RPMI-1640-HEPES medier ved tilsætning af 10 g RPMI-1640 pulver, 66 mg gentamycin sulfat, 2 g natriumbicarbonat, 5,9 g HEPES-buffer, 50 mg hypoxanthin og 3,8 g dextrose i 1 liter sterilt dH 2 O. Bland bruge tabel magnetomrører, indtil alt pulveret er opløst i 1 liter destilleret vand. Udfør mikro filtrering af medier ved hjælp 0,22 um filter. Opbevar medier i sterile flasker.
  2. Vask uinficeret (friske) type A + erytrocytter hjælp RPMI. Forbered 5% hæmatokrit af erythrocytter (0,5 ml vaskede friske erythrocytter i 9,5 ml 10% RPMI + humant serum).
  3. Gøre 15% humant serum + RPMI (15 ml humant serum og 85 ml RPMI) at indlede dyrkning af parasitter. Gøre 10% humant serum og RPMI (10 ml humant serum og 90 ml RPMI) at fortsætte dyrkning af parasitter i de røde blodlegemer.
  4. Kultur P. falciparum (3D7 og FCR-3 stammer) typeA + humane erythrocytter ved 5% hæmatokrit og 20% parasitæmi i petriskål eller en 75 cm 3 dyrkningskolbe. Opretholde kulturen in vitro ifølge fremgangsmåden af Trager og Jensen fotoforer 26. Alternativt opretholde kulturer er i inkubator ved 37 ° C opretholdelse 9,5% CO2 og 3,4% N2-gas. Kultur P. falciparum i RPMI 1640-HEPES-medier tilsat 10% humant serum.
  5. Synkroniser P. falciparum kultur ved tilsætning 65% percoll (65 ml Percoll + 35 ml RPMI-1640 uden humant serum) til kulturen koncentrat 27.
  6. Centrifugeres kulturen koncentratet med percoll ved 2500 xg i 5 min, hvilket resulterer i 3 lag. Omhyggeligt med en overførsel pipette isolere schizonter fra det midterste lag overførsel til et separat rør under aseptiske betingelser 27.
  7. Vask de isolerede kulturer med 10% humant serum + RPMI-1640 to gange for at fjerne overskydende percoll ved centrifugering ved 7500 x g i 5 min. Discard supernatanten hver gang under aseptiske forhold 27.
  8. Fortsat dyrkning af synkroniserede P. falciparum-schizonter i 10% humant serum + RPMI-1640 27.
  9. Indsamle schizonter ved behandling Plasmodium inficerede erythrocytter med 10 mM Tris pH 8,8 og centrifugering ved 15000 xg i 15 min 23. Store parasit pellets ved -70 ° C efter tilsætning af 5 pi proteasehæmmer (aprotinin) til pellets. Bruge parasit pellets for protein ekstraktion, genomisk DNA-isolering og RNA-isolering.

2. Forberedelse Plasmid Vector

  1. Isolere genomisk DNA fra P. falciparum schizont pellets fremstillet fra kulturer af ca. 20% parasitæmi.
  2. Tilsættes 600 pi 10 mM Tris-HCI med pH 7,6, 50 mM EDTA, pH 8,0, 0,1% SDS og 1 mg / ml proteinase K, til pellets i et mikrocentrifugerør, homogeniseres pellet anvendelse af en 1 ml sprøjte fastgjort til en 26 G nål. Alternate sprøjten fyldesmed pelleten blandingen og tømning i et mikrocentrifugerør 20 gange. Inkuber rør indeholdende homogenat O / N i et 50 ° C vandbad.
  3. Udføre phenol - chloroform (P + C) ekstraktion ved tilsætning af 600 pi af P + C (300 pi phenol og 300 pi chloroform) til homogeniseret pellet. Cap rør stramt og ryst blandingen kraftigt ved at vende røret end-to-end. Centrifugerør ved 14.000 xg i 2 min og indsamle øvre vandige opløsning under anvendelse af en mikropipette til et nyt mikrocentrifugerør. Gentag dette trin to gange.
  4. Tilsættes 600 pi chloroform til det vandige lag i den nye slange fra trin 2.1.2. Vortexes røret i 10 sek, og der centrifugeres ved 14.000 xg i 2 min. Mål den øvre vandige lag med en mikropipette og overføres til et nyt mikrocentrifugerør.
  5. Tilføje 0,1 vol 5 M natriumacetat pH 5,5 og 1 vol isopropanol (hvis vandige lag er 300 pi tilsættes 30 pi 5 M natriumacetat, pH 5,5 + 330 pi isopropanol) til vandig layis fra trin 2.1.3. Inkuber røret ved stuetemperatur i 15 minutter.
  6. Centrifugeres røret ved 14.000 x g i 10 min for at udfælde DNA pellet. Supernatanten fjernes, og pellet vaskes med 100 pi 70% ethanol (70 pi ethanol og 30 pi dH 2 O) for at fjerne overskydende salt fra DNA'et. Store DNA i 50 pi dH2O ved -20 ° C.
  7. Designe fremadrettede og reverse primere ved hjælp af software eller manuelt til amplifikation af P. falciparum-gener PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 og PF3D7_0114100 tidligere identificeret i proteomanalyse studier 16,18 med passende restriktionssteder for at tillade kloning af gensekvenser i de multiple kloningssteder af ekspressionsplasmid pT7CFE1-CHIS som vist i tabel 2.
  8. Lav en 50 pi reaktionsblanding ved tilsætning; 5 ul isolerede P. falciparum genomisk DNA, 5 pi 10x buffer, 5 pi MgCl2, 1,5 pi fremadrettet primer, 1,5 pirevers primer, 0,5 pi T7-DNA-polymerase og 31,5 pi dH2O og udføre polymerasekædereaktion (PCR) ved 94 ° C i 8 minutter til denaturering, 50 ° C i 1 min 30 sek til udvidelse og 72 ° C i 9 min til annealing og renaturering til amplifikation gener vist i tabel 1.
  9. Separate PCR-produkter på 1% agarosegel (1 g agarose og 100 ml Tris-acetat EDTA (TAE) puffer) 32.
  10. Skær PCR amplificerede DNA-bånd fra agarosegelen, placere gelskiverne indeholder DNA i en DNA-gel ekstraktion spinkolonne og nedfryses til -20 ° C i 5 min. Tilsættes 100 pi isopropanol til de frosne gelskiver og centrifugeres ved 14.000 xg i 5 min.
  11. Mål vandige gennemstrømning filtreres i opsamlingsrøret fra trin 2.5, under anvendelse af en mikropipette og overføres til et nyt rør. Tilføje 0,1 vol 5 M natriumacetat og centrifugeres ved 14.000 xg i 5 min. Supernatanten fjernes, og tilføje 10 pi dH2O til the DNA pellet.
  12. Fordøje pT7CFE1-Chis ekspressionsvektor og oprenset DNA-fragmenter (fra 2,6) i to separate rør ved tilsætning af 3 pi plasmid og 5 pi PCR genprodukter til hvert rør. Tilføj til hvert rør, 1 pi specifikke restriktionsenzymer, 2 pi reaktionsbuffer og 14 pi dH 2 O.
  13. Tilsæt 3 pi fordøjet plasmid, 5 pi fordøjede DNA-fragmenter, 2 pi 10x ligase-puffer, 1 pi ligase og 9 pi dH2O i et mikrocentrifugerør. Inkuber ved 12 ° CO / N.
  14. Tilføje 0,1 vol 3 M natriumacetat ved pH 5,5 og 2 volumener ethanol (hvis din ligeringsfremgangsmåder rør volumen er 20 pi tilsættes 2 pi 3 M natriumacetat + 44 pi ethanol) til røret fra trin 2.14. Bland godt og inkuber ved -20 ° C i 15 minutter.
  15. Centrifugeres røret ved 14.000 xg i 15 min. Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af en mikro pipette uden at forstyrre pelleten.
  16. Tilføj 100 ul 70% ethanol to pelleten fra trin 2.10. Centrifugeres røret ved 14.000 x g i 5 min. Fjern og kassér supernatanten. Tilsæt 10 pi nuclease-frit vand til DNA-pelleten.

3. Protein Expression Brug i Vitro Menneskelig Cell Free Expression System

  1. Forbered 20 ul transkription blanding ved måling 2 pi af det rekombinante pT7CFE1-Chis plasmid-DNA, 4 pi 5x transcription buffer, 4 pi NTP mix, 2 pi T7 RNA-polymerase og 8 pi nuclease-frit vand i 2-trins human in vitro Protein Expression anvendelse af DNA-skabeloner. Bland komponenterne i et mikrocentrifugerør og inkuberes i 75 minutter ved 30 ° C i et vandbad.
  2. Take 2 pi af transkription blandingen og føje den til 23 pi oversættelse blanding indeholdende 12,5 pi HeLa-cellelysat, 2,5 pi accessoriske proteiner, 1 pi saltopløsning A, 0,5 pi aminosyrer -Met, 0,5 pi aminosyrer Leu, 181 l af RNAse-inhibitor, 1,25 pi energimiks og 3,75 ul nuklease-frit vand.
  3. Inkuber oversættelsen blandingen fra trin 3.2 ved 30 ° C i 90 minutter. Opbevares oversat produkter ved -20 ° C.
  4. Forbered 25 pi transkription og translation blanding ved tilsætning af 3 pi af det rekombinante pT7CFE1-Chis plasmid-DNA, 2 pi nuclease-frit vand, 5 pi reaktionsblanding, 12,5 pi HeLa lysat og 2,5 pi accessoriske proteiner for 1-trin human Koblet IVT Protein Expression for DNA templates.
  5. Inkubere reaktionsblandingen fra trin 3.4 i 90 minutter til 6 timer ved 30 ° C. Opbevar oversættelse produkter til -20 ° C.

4. Oprensning af udtrykte rekombinante proteiner

  1. Tilføje 75 pi 1x oprensning buffer til 25 pi translationsprodukt til at gøre 100 pi oprensning blanding.
  2. Tilsættes 100 pi nikkel-chelaterende harpiks til 100 pi rensning mixture. Wash Ni-harpiks to gange ved tilsætning af 300 pi dH2O og 300 pi af bindingsbuffer. Resuspender harpiks og centrifugeres ved 14.000 xg i 1 min for at fjerne overskydende ethanol.
  3. Tilsættes 100 pi oprensning blandingen fra trin 4,2-100 pi nikkel-chelaterende resin og inkuber blandingen i 60 minutter ved stuetemperatur.
  4. Centrifuger blandingen ved 14.000 x g i 1 min og indsamle supernatanten i et frisk rør mærket som "flyde igennem".
  5. Vask af resin med 100 pi 1X vaskebuffer (20 mM imidazol, 250 mM NaH 2 PO 4 ved pH 8, 2,5 M NaCl og dH 2 O). Centrifugeres ved 14.000 xg i 1 min og samle bundfald i frisk rør mærket "vask". Gentag trin 4.5 to gange.
  6. Tilsættes 100 pi 1x elueringspuffer (100 mM imidazol, 250 mM Na 2 PO 4 ved pH 8,0, 2,5 M NaCl og dH2O) til harpiksen og inkuberes i 15 min. Centrifugere ved 14.000 x g i 1 min. Gør elueringstrinnet to gange. Hvertid samle bundfald i frisk mikrocentrifugerør og etiket som "eluat".
  7. Efter eluering vaskes harpiks to gange som beskrevet i trin 4.5. Store strømme igennem, vasker og eluering prøver ved -20 ° C eller derunder. Harpiks skal opbevares ved 4 ° C. Bruge 30 pi af hver prøve til SDS-PAGE og immunoblotting-analyse.

5. Coomassie (Bradford) Protein Assay 34

  1. Forbered standard bovint serumalbumin (BSA) opløsninger med koncentrationen 20 ug / ml (bland 10 pi BSA (2 mg / ml) og 90 pi dH 2 O), 40 ug / ml (mix 20 pi BSA (2 mg / ml) og 80 pi dH 2 O), 60 ug / ml (bland 30 pi BSA (2 mg / ml) og 70 pi dH 2 O), 80 ug / ml (mix 40 pi BSA (2 mg / ml) og 60 pi dH 2 O), 100 ug / ml (bland 50 pi BSA (2 mg / ml) og 50 pi dH 2 O), 160 ug / ml (mix 80 pi BSA (2 mg / ml) og 20 pi dH2 O) og 200 ug / ml (100 pi BSA (2 mg / ml).
  2. Mål 5 ul gennemstrømning, vasker og eluat prøver fra trin 4.7. Tilføj 95 pi dH 2 O.
  3. Der tilsættes 5 ml Coomassieblåt reagens til blandingerne fra trin 5.1 og 5.2. Dæk reagensglassene med parafilm og vortex i 10 sekunder derefter inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
  4. Anvendelse af et spektrofotometer, måle optisk densitet (OD) ved bølgelængde på 650 nm for protein-rør fra trin 5.3. Plot koncentration vs. OD-aflæsning til at bestemme de proteinkoncentrationer 34.

6. Western Blotting

  1. Tilsæt 5 pi schizont uddrag fra P. falciparum, 2 pi Escherichia coli udtrykte rekombinante rhOP-3-proteiner 31, 5 pi af rekombinante proteiner udtrykt ved anvendelse af 2-trins og 1-trins in vitro humane ekspressionssystemer og 10 pi proteinprodukter oprenset under anvendelse affinitet metode til separate rør. Tilføj elektroforese prøvebuffer indeholdende mercaptoethanol til hvert rør for et endeligt volumen på 20 pi at gøre solubiliserede proteinprøver. Kog rør i 2 min.
  2. Indlæse solubiliserede proteinprøver på 10% SDS-PAGE-geler til at adskille proteinerne.
  3. Overfør adskilte proteiner fra SDS-PAGE-geler til nitrocellulose papir (NCP) ved elektroforese ved 35 mA strøm pr gel i en halvtør western blotting kammer i 2 timer.
  4. Block nationale kontaktpunkter efter overførsel med 2% fedtfri mælk.
  5. Der inkuberes blokeret NKP'er med følgende polyklonale antistoffer fortyndet 1: 100 i 2% mælk til at udføre western blotting; kanin-antistof # 676 21 specifikke for P. falciparum merozoit rhoptries, mus antistoffer 20 specifikke for P. yoelii og P. berghei merozoit rhoptries, antisera # 685 specifikke for P. falciparum parasitophore vacuole-protein, SERA (serinrigt antigen) 22 og antistoffer specifikke for Maurer217; s kløft protein PfMC-2TM 28.
  6. Inkuber NKP'erne også i 1: 100 fortyndet normale mus og kanin serum og brugt kultursupernatant (SCS) fra SP2 myelomaceller som negative kontroller.
  7. Inkuber nationale kontaktpunkter med antistoffer og kontroller ved 4 ºC O / N.
  8. Vask NKP'er 4x med Blot buffer og inkuberes nationale kontaktpunkter med artsspecifikke sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP) fortyndet 1: 1000 i 2% mælk.
  9. Vask nationale kontaktpunkter 4x med Blot buffer. Der inkuberes vasket NKP'er med udviklingen opløsning farve A + B (Opløsning A: tilføje 50 ml 1x Blot puffer og 30 pi H2O 2; Opløsning B: der tilsættes 10 ml methanol og 30 mg 3-chlor-naphtol) i 30 min i mørke. Analyser Western blot resultater kolorimetrisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering af de udtrykte rekombinante proteiner gennem reaktivitet med specifikke antistoffer er et vigtigt første skridt i at bekræfte korrekt foldning af de udtrykte proteiner. Rekombinante malaria proteiner blev udtrykt ved hjælp af et trin og to skridt i vitro menneskelig celle gratis ekspressionssystemer. De rekombinante proteiner oprenses Ni-chelaterende affinitet metode. Vi derefter brugt antisera mod hele merozoit rhoptries i western blotting af SDS-PAGE separerede rekombinante proteiner.

Figur 1 viser PCR amplificerede genfragmenter af PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 og PF3D7_1436300 i en 1% agarosegel. DNA-bånd blev udskåret og DNA oprenset ved frysning i DNA-ekstraktion Spin Column.

Malaria-gener med succes amplificeret (vist i tabel 2) fra genomisk DNA blev klonet ind i pT7CFE-Chis ekspressionsvektor. Re-amplifikation af generne fra recombinant plasmider viste tilstedeværelsen af ​​de klonede genfragmenter i vektoren. Rutediagrammet i ekspressionssystemer anvendes til protein translation er vist i figur 2. Figur 2A og 2B viser en trinvis fremgangsmåde af 2-trins in vitro human celle fri ekspressionssystem og 1-trins IVT koblet translation system. Vellykket ekspression af Plasmodium proteiner ved hjælp in vitro human celle fri ekspressionssystemer blev bekræftet ved rhoptry specifik kaninantisera. Som illustreret i figur 3A blev rekombinante proteiner genkendes af rhoptry specifik kanin antisera # 676. Som vist tidligere, udtrykte rekombinante proteiner blev ikke genkendt af antisera mod parasitophore vacuole proteiner fra P. falciparum og P. yoelii demonstrerer specificiteten af kaninantisera 676 mod de udtrykte proteiner 32. Normalt kaninserum (NRS) reagerede ikke med rekombinante proteineromregnes 2-trins in vitro human celle ytringsfriheden, og 1-trins IVT koblede oversættelse (figur 3B). Den vellykkede udtryk for Plasmodium rekombinante proteiner blev bekræftet ved forskellige teknikker såsom In-gel histidin farvning og nikkel-HRP farvning 32. Udtrykte proteiner blev oprenset ved affinitetsoprensning system. Oprensning udføres i batch-metoden (ingen kolonner anvendes). Teknikken er optimeret ved at ændre koncentrationen af ​​imidazol fra 60 mM til 100 mM. Den optimale koncentration til eluering er 250 mM. Figur 4 viser vellykket oprensning af oversatte proteiner fra 25 pi oversatte proteinprodukter. Figur 4A viser vellykket oprensning af Maurers kløft transmembranprotein 18. Figur 4B viser vellykket oprensning af PF3D7_0925900, P. falciparum ortholog af Plasmodium yoelii gen PY17X_0830000, enhypotetisk protein 32. Figur 4C viser vellykket oprensning af bæltedyr gentagelser indeholder protein PY17X_1139200, et hypotetisk protein under anvendelse Ni harpiksperler og 100 mM imidazol i 1x elueringsbuffer. Udbyttet af protein efter oprensning er 3,5 ug / 25 ul.

Figur 1
Figur 1. Amplifikation af P. falciparum og P. yoelii gener. 1% agarose gel, der viser ethidiumbromidfarvede PCR-produkter af genfragmenter af PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 og PFA0680cw amplificeret fra P. falciparum genomisk DNA.

Figur 2
Figur 2. Flow diagram af HeLa bas ed celle ytringsfriheden system. Skematisk fremstilling af både 2-trins og 1-trin in vitro menneskelig celle fri ekspressionssystemer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Immunoblotting bekræftelse af proteinekspression. Western blot-analyse af udtrykte rekombinante proteiner ved anvendelse hele rhoptry specifik kanin anti-sera # 676 og normalt kaninserum. (A) Reaktivitet af antisera 676 med udtrykte rekombinante proteiner. (B) normalt kaninserum reagerede ikke med det udtrykte rekombinante proteiner. Parasitophore vacuole-protein reagerede ikke med rekombinante proteiner 32.hres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Oprensning af proteiner fra mikroorganismer volumener translationsprodukt. Oprensning af udtrykte rekombinante proteiner under anvendelse af Nikkel chelaterende harpiks affinitet metode. Udtrykte proteiner (oversættelse) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, og (C) PY17X_1139200 proteiner blev inkuberet med nikkel - chelaterende harpiks oprenses med nikkel- chelaterende harpiks i fravær af imidazol i bindingsbuffer og rensning buffer. Efter inkubation blev perlerne centrifugeret, ubundne proteiner blev separeret og perlerne vasket to gange i vaskepuffer. Bundne rekombinante proteiner blev elueret to gange efterfulgt af vask af perlerne. Oversatte proteiner, vasker, eluater og perlerblev solubiliseret i elektroforese-prøvepuffer. Imidazol blev anvendt i vask (20 mM imidazol) og eluering (100 mM imidazol) puffere. Antisera # 676 succesfuldt anerkendt udtrykt og oprensede rekombinante proteiner. Normalt kaninserum reagerede ikke med udtrykte proteiner som vist på Figur 3B. Klik her for at se en større version af dette tal.

<td> 200 KDa
Egenskaber Human celle-Free ekspressionssystem Hvedekim celle fri ekspressionssystem Kaninreticulocyt ekspressionssystem E.coli lysat proteinekspressionssystem
Tid Udført transskription og translation i 3 timer Transskription for 6 timer og oversættelse for 10 - 20 timer RNA skal isoleres oversættelse tager 90 min Done i 1 time
Egnet vektor T7 vektor kan være SP6 vektor T7 kan anvendes T7 kan anvendes
Egnet skala Egnet til laboratoriet syntese Anvendes til stor skala proteinsyntese Velegnet til laboratorie- og immunisering undersøgelser Velegnet til laboratorie- og immunisering undersøgelser
Ekstrakt HeLa cellefrie ekstrakter Embryo af ekstrakter af hvede Reticulocyt celleekstrakter E. coli-cellelysat ekstrakter
Ændring Co-translationel og post translationel modifikation Posttranslationelle modifikation Co-translationel modifikation Post-translationel modifikation
Størrelse af protein oversat 8 kDa til 250 kDa 220 kDa 250 kDa
Kodonoptimering Stram Stram Løs Stram
Disulfidbindingsdannelse Ja Ja Ingen Ja
Udbytte Lavt udbytte Højt udbytte Lav Yield Meget højt udbytte
Koste 130,00 dollar for 10 reaktioner $ 173,00 for 10 reaktioner $ 136,00 for 5 reaktioner 159,00 $ til 8 reaktioner
Proteinkoncentration 3 til 5 ug pr reaktion 100 pg / ml 100 pg / ml 500 ug / ml
Referencer 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

Tabel 1. Cell fri ekspressionssystemer i malaria forskning. Sammenligning af cellegratis ekspressionssystemer øjeblikket anvendes i malaria forskning.

Gene ID Ortolog ID Protein Primer Sekvens for PCR
PF3D7_1436300 Translocon komponent CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 PfMC-2TM Maurers kløft protein GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 Hypotetisk Protein GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 Hypotetisk Protein GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

Tabel 2. Rhoptry gener i undersøgelsen. Primere af forskellige gener udtrykt i denne undersøgelse 19.

Navnet Material Firma Katalognummer Beskrivelse
2-trins in vitro human celle ytringsfriheden systemet 32 Thermo Fisher 88.856 Afbrudt. Opbevar altid ved -80 ° C. Må ikke tø i varmt vand.
1-trins in vitro koblet oversættelsessystem Thermo Fisher 88.860 Opbevar altid ved -80 ° C. Må ikke thaw i varmt vand.

Tabel 3. Hela baseret cellefrie ekspressionssystemer. Kits anvendes til ekspression af proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De vigtige skridt for en vellykket ekspression af proteiner ved hjælp af to-trins in vitro human celle ytringsfriheden systemet og rensning er: 1) vellykket forstærkning og kloning af gener i pT7CFE-Chis plasmidvektor; 2) overførsel af RNA ved 30 ° C; 3) oversættelse af protein ved 30 ° C i nærvær af RNAse-inhibitor; 4) udvikling af affiniteten baseret oprensningsprotokol hjælp harpiks perler overtrukket med Ni og 5) analyse resultaterne på western blot under anvendelse af polyklonale og monoklonale antistoffer. De vigtige skridt for vellykket ekspression af proteiner under anvendelse et skridt IVT koblet protein oversættelsessystem er: 1) vellykket amplificering og kloning af gener ind pT7CFE-Chis plasmidvektor; 2) Transkription og translation af proteiner ved 30 ° C; 3) udvikling af affiniteten baseret oprensningsprotokol hjælp harpiks perler overtrukket med Ni og 4) analyse resultaterne på western blot under anvendelse af polyklonale og monoklonale antistoffer.

Nuværendely, er celle gratis ekspressionssystemer anvendes til at udtrykke rekombinante malaria proteiner. De kritiske træk ved cellefri ekspressionssystemer til at udtrykke malaria proteiner er evnen til at afkode AT rige gener, mangel på lang translationel pause, vellykket ekspression af gentagne aminosyresekvenser, manglende glycosylering mekanismer og evnen af ​​plasmider til at styre gen-trunkering. I denne undersøgelse har vi demonstrere brugen af en to-trins in vitro human celle fri ekspressionssystem 32 og en ét-trins IVT koblet oversættelsessystemer til ekspression af P. falciparum gen orthologer af P. yoelii merozoit rhoptry gener som vist i tabel 1. En oprensning protokol blev udviklet og optimeret til oprensning mikro-volumener rekombinante proteiner opnået ud fra 1-trin og 2-trins in vitro human cellefrie ekspressionssystemer. 4 s falciparum-gener, PF3D7_0114100 et transmembrant hydrofobt protein, et forudsagt hypotetisk ARM repeatprotein PF3D7_1361800 og en hydrofil protein PF3D7_0925900, blev udtrykt ved hjælp af en 2-trins og 1-trin in vitro human celle ytringsfriheden system. Oprensede protein udbytter blev bestemt. Proteinet PfMC-2TM blev inkluderet i disse studier, fordi det er et integreret membranprotein med to transmembrane domæner, og vi var interesseret i at bestemme, om in vitro ekspressionssystem korrekt kunne udtrykke det transmembrane protein og muliggøre nem oprensning.

Den vigtigste forskel i både ene trin og to trin ekspressionssystemer er, at totrins ekspressionssystemet er et mRNA afhængig ordning, hvor et stabilt mRNA transkriberes og sættes til translationsreaktionen. I modsætning hertil et trin in vitro koblet transskription / oversættelse system indebærer en kontinuerlig transkription og levering af mRNA efterfulgt af co-translation af protein under reaktionen. Både 1-trins IVT transkription / translation koblet eXPRESSION-system og 2-trins in vitro human celle fri ekspressionssystem blev testet for ekspression af proteiner med høj molekylvægt. Begge systemer lykkedes udtrykke lavmolekylære rekombinante proteiner. I 1-trins ekspressionssystem blev antistof krydsreaktivitet med proteiner i oversættelsen reaktionsblanding observeres. De specifikke proteiner krydser reagerer med antistofferne er ukendte og kræver yderligere undersøgelse. Ekspression af proteiner med høj molekylvægt mislykkedes anvendelse af både 1-trins og 2-trins-systemer. En oprensning protokol blev udviklet til rensning microvolumes af rekombinante proteiner af forskellige opløselighedsegenskaber udtrykt ved anvendelse af både 1-trins og 2-trins in vitro human cellefrie ekspressionssystemer. Proteiner blev med held oprenset og det opnåede udbytte var 3,5 ug pr 25 pi, når det udtrykkes under anvendelse af 2-trins in vitro protein translationssystem og 1,5 ug pr 25 pi når oversat med 1-trin IVT proteinekspressionssystem. Ekspression af proteiner med lav molekylvægt varierende fra 18 kDa til 37 kDa er reproducerbar og ligetil. Men høj molekylvægt ekspression resulterer i protein-trunkeringer. På grund af de microvolumes opnået for klonede DNA blev PCR-amplifikation anvendes til at verificere klonede produkter. Potentielle hindringer for at udtrykke højmolekylære proteiner ved hjælp af celle gratis ekspressionssystemer kunne være konstant fosforylering af eIF2 alpha-underenhed på grund af høj koncentration af ATP i reaktionen. Dette forringer translationsinitiering i systemet, som potentielt påvirker forlængelsen af proteinsyntese under syntese af store proteiner i cellefri ekspressionssystemer 10.

Protokollen beskrevet her er upåvirket af optimering betingelser for ekspression af proteiner. Hverken gen-kodoner eller plasmidet blev optimeret til ekspression af proteiner og protein refoldning var ikke påkrævet. Dette system udtrykker proteins i 3 timer og oprensningen af ​​proteinet kan opnås i 2 timer, hvilket muliggør yderligere efterfølgende anvendelser såsom forarbejdning af det rekombinante protein til immuniseringer eller peptidsekventering. Flere rekombinante proteiner kan udtrykkes med HeLa cellefri system, ved hjælp microarray formater til immunsera screening og identifikation af potentielle vaccine kandidatmolekyler. Endvidere kan potentielt immunogene proteiner identificeres gennem skærme og udvalgte proteiner opnået ved at opskalere ekspression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
  2. Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
  3. Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  4. Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
  5. Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
  6. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
  7. Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
  8. Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
  9. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
  10. Hinnebusch, A. Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).
  11. Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
  12. Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
  13. Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
  14. Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
  15. Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
  16. Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
  17. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
  18. Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
  19. Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
  20. Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
  21. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
  22. Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
  23. Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
  24. Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
  25. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  26. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  27. Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
  28. Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
  29. Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
  30. Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
  31. Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
  32. Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
  33. Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Tags

Biokemi Cell fri in vitro-transskription-translation HeLa celle frie udtryk rhoptry proteiner pattedyrscelle ytringsfrihed-system, Pro Bond affinitetsoprensning
HeLa Baseret Cell ytringsfrihed Systemer til ekspression af<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa… More

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter