Summary
Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.
Abstract
Sıtma önemli küresel morbidite ve mortaliteye neden. Hiçbir rutin aşı mevcut değildir. Bir aşının olmaması için en önemli nedenlerinden biri, uygun aşı adayları belirleme mücadeledir. Sıtma proteinleri prokaryotik ve ökaryotik hücre tabanlı ifade sistemleri zayıf düşürülmüş immünojenikliği giden uygunsuz katlama, genellikle çözünmez glıkosıle ve tabi olan kullanarak dile getirdi. buğday tohumu, tavşan retikülosit lizat ve Escherichia coli lisat hücresiz sentezleme sistemleri şu anda sıtma protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Ancak, ifade, zaman ve proteinlerin yanlış glikolizasyonu uzunluğu hala bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu "in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemleri" olarak adlandırılan HeLa göre hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak in vitro Plasmodium proteinlerin sentezlenmesini göstermektedir. 2 HeLa tabanlı cep özgür ifade sistemleri 75 dakika ve transcrib 3 ul mRNA uyarlamaked mRNA, 90 dakika proteinleri çevirmek yeterlidir. 1 adım sentezleme sistemi, bir transkripsiyon ve translasyon bağlanmış sentezleme sistemidir; transkripsiyonu ve eş için 3 saat içinde oluşur. süreci de ek enerji sağlayarak 6 saat süreyle uzatılabilir. 2 adımlı sentezleme sisteminde, mRNA, ilk transkripsiyonu ve daha sonra protein ekspresyonu için yapıldı karışımına ilave edildi. Biz sıtma proteinleri ifade açıklanmıştır; bir hidrofobik PF3D7_0114100 Maurer'in Yarık - 2 transmembran (KMYKK-2TM) proteini, bir hidrofilik PF3D7_0925900 proteini ve HeLa göre hücresiz sentezleme sistemi kullanılarak protein PF3D7_1361800 ihtiva eden bir armadillonun tekrarlar. Proteinler 2-adım ve 1 adım ifadesi stratejilerini kullanan mikro hacimlerde ifade edilir. Bir afinite saflaştırma yöntemi de tarif edilir ve in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemi kullanılarak ifade edilen proteinlerin 25 ul saflaştırmak için. Protein verimi Bradford tahliliyle belirlenir ve ekspreseve saflaştırılmış proteinler Western lekesi analizi ile teyit edilebilir. Sentezlenen rekombinant proteinler, aşılar, bağışıklık ve protein dizilemesi için kullanılabilir.
Introduction
Sıtma araştırmada, prokaryotik ya da ökaryotik hücre bazlı sistemler kullanılarak imünojenik protein ekspresyonu, bir sorun olmaya devam etmektedir. Plasmodium genomu ve bilinmeyen post-translasyonel mekanizmalar 14,7, AT zenginliği, antikor üretimi ve aşı çalışmaları için uygun bir şekilde katlanmış ve immünojenik proteinlerini elde etmekle bağlantılı güçlükler katkıda bulunur. Escherichia coli gibi prokaryotik sistemlerde rekombinan protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Prokaryotik sistemleri, etkili, düşük maliyetli olan rekombinant proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi ve birden çok klonlama vektörleri. E. Ev Sahipliği E. coli hücrelerini dönüştürmek için kolay ve hızlı bir şekilde hücreler büyür. Bununla birlikte, prokaryotik sistemler gibi amino asit ikamesi, post-translasyonel modifikasyon, inklüzyon gövdelerinin 24 içinde kirlenme heterojen ürünlerin ve rekombinant proteinlerin birikmesi riski eksikliği gibi sınırlılıklara sahiptir.
IçindeMehlin ve arkadaşları tarafından çalışma. (2006), 1000, açık okuma çerçeveleri (ORF) olarak ifade edildi. Ifade edilen proteinlerin yaklaşık% 7 çözünen 14 idi. gözlenen çözünmeme genlerinin önyargılı doğası ve zengin genom 14 AT Plasmodium tarafından ideal kullanılan kodonların yüksek frekans kaynaklanmaktadır. Bu problemin üstesinden gelmek için bir alternatif strateji, plazmidler veya nadir kodonları ya da frekansları 3 eşleşen kodonları tanıyan tRNAs ihtiva eden konakçı hücreler kullanılarak geliştirilmiştir. Hatta bu en iyi duruma gerçekleştirdikten sonra, proteinler, çok küçük bölümleri, çözülebilir aktif 14 imünojenik olarak ifade edilmiştir. hücresiz sentezleme sistemleri, ribozom, başlatma faktörleri, uzatma faktörleri (çevirileri faktörler), tRNA ve aminoasil-tRNA sentetaz olarak transkripsiyonu ve translasyonu için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. Hem transkripsiyon ve translasyon reaksiyonları tek aşamalı prosedür 11,29 içinde birleştirilir. transcrimRNA uygun bir miktar farklı boru 11,29 çeviri makine ile inkübe edilmeden önce ption Reaksiyon tüpü içinde gerçekleştirilir. Bu yöntemler, Plasmodium sp., Protein ekspresyonu başarılı olsa da, önemli bir dezavantajı, yaklaşık 22 saat 29 olan protein ekspresyonu için zaman dilimidir. Buna ek olarak, protokoller 29 eklenmek üzere malzeme yüksek maliyet, bileşen hazırlıkları emek-yoğun hücre lizatının hazırlıkları ve tutarsızlıklar, bu sistemler ulaşılamaz olun. Bir hücre özgür ifade sisteminin geliştirilmesi için araştırmacıların ana odak bu hızlı genetik modifikasyon, yüksek konsantrasyonlarda ve yalındır lisatı hazırlıkları 1 hızlı verim gibi faktörlere bağlıdır.
Maya, memeli hücre çizgileri, bakulovirüs dolayımlı sentezleme sistemi, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum ve parazitik ekspresyon sistemleri su olarak ökaryotik sistemlerdeLeishmania olarak kanal yeniden birleştirici protein ekspresyonu 7 kullanılmaktadır. Ökaryotik sistemler filogenetik ilişkiyi paylaşmak ve bu nedenle de bu tür glikosilasyon, asilleme, disülfür bağı oluşumu, hastabakıcı etkileşimi, proteoliz ve alt hücresel bölümlendirme gibi özelliklere paylaşabilirsiniz. Ökaryotlarda protein salgılanması olayları birikmesini önlemek ve ifade sistemleri 13 toksisite azalır. bunlar, büyük ölçekli protein ekspresyonu için ve yüksek verim 4 elde etmek için uygun olan maya sistemlerinin kullanılması tercih edilir. İki P. falsiparum proteinleri PfCP-29 ve Pvs25 maya sistemi 4 kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin çoğu sentezinde önemli bir dezavantajı, düzensiz N ve O-glikosilasyon modelleri, uygun olmayan katlama ve doğal biçiminde 4 proteinlerin kesme oldu.
Rekombinant proteinlerin sentezi için memeli hücrelerinin kullanımı, emek yoğun ve masraflı olup bustabil yeniden birleştirici hücre çizgileri 4 muhafaza etmek sive. Bu nedenle, memeli hücreleri, protein sinyalizasyon, protein etkileşimleri ve parazit konakçı etkileşimleri analiz için sınırlı kalmıştır ve DNA aşıları 4 test etmek için. Burada tarif edilen insan DNA'sı ve mRNA in vitro protein ekspresyonu, hücre içermeyen sistemi 3 saat proteinleri eksprese eden bir HeLa hücre-türevli, memeli-bazlı bir sistemdir. Proteinler kimlik ve saf hale getirilmesini kolaylaştıran bir C-terminali etiket pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü olan kullanılarak ifade edilir. HeLa tabanlı sistem, böylece çeviri sisteminin etkinliğinin artırılması, çeviri başlatma faktörleri ve çeviri regülatörü ile takviye edilmiştir. Proteinler hızla çevrilmiştir filtrelenmiş, belirlenmiş ve çeşitli immünolojik ve yapısal uygulamalar 15 kullanılmak üzere işlenebilir.
Buğday tohumu ve tavşan retikülosit gibi ökaryotik hücre içermeyen sentezleme sistemleri şu anda var ekspresyonu için kullanılanPlasmodium proteinleri de dahil olmak üzere 11,29 ious ökaryotik proteinler. Buna ek olarak, E. E. coli göre hücre içermeyen sistemler de ökaryotik protein ekspresyonu için kullanılmaktadır 11. Tablo 1, sistemin özelliklerinin yanı sıra, protein ekspresyonu için sistemler kullanılarak kolaylığı karşılaştırarak farklı hücre serbest sentezleme sistemleri özetlemektedir. diğerlerine kıyasla insan hücresi serbest sistemi sonrası ve co-translasyonel modifikasyonlar yapmak yeteneğine sahiptir ve daha az pahalıdır. Kodon optimizasyonu da mümkündür ve bütün reaksiyonlar, 3 saat içinde uygulanabilir. HeLa sistem laboratuvar ortamında protein sentezi için ideal bir çeviri sistemidir.
Diğer hücre barındırmayan sistemler üzerinde insan hücre serbest sentezleme sistemlerinin önemli bir avantajı, farklı organ ve dokularda türetilen birkaç farklı hücre hatları mevcudiyetidir. Hücresiz sistemlerin pek çok çeşidi, hücre hattı ile ilgili olarak dizayn edilebilir. özütMemeli hücrelerinden türetilen ler başka hücre özgür ifade sistemlerine göre büyük proteinleri sentezlemek için yüksek verimliliğe sahiptir. Bu hücresiz sentezleme sistemleri, aynı zamanda, mikro dizileri 30 gibi teşhis ve protein karakterizasyon uygulamalarında kullanılabilir. Popüler HeLa hücre hatları, en yaygın olarak protein 33 ekspresyonunu gerçekleştirmek için kullanılır. HeLa hücre hatları, endoplazmik retikulum post-translasyonel glikosilasyon modifikasyon aktivitesi 33 yokluğuna yol az gelişmiştir. Bununla birlikte, bu sistem, aynı zamanda, Plasmodium glikosilasyon sonrası değişikliği bir 29 yoksun olarak Plasmodium protein sentezi için yararlı olduğuna inanılmaktadır. HeLa hücre serbest transkripsiyon için protokol, ucuz, kolay uygulanabilir ve proteinlerin saflaştırılması ve daha sonraki alt akış uygulamaları için hazır, 90 dakika içinde ifade edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Parazit Hücre Kültürleri 1. Hazırlık, Parazit Peletleri Koleksiyonu
- 1 L RPMI-1640 tozun 10 g, gentamisin sülfat, 66 mg, 2 g sodyum bikarbonat, 5.9 g HEPES tamponu, 50 mg hipoksantin ve 3.8 g dekstroz eklenerek RPMI-1640-HEPES ortamları hazırlamak steril dH 2 O 1 L damıtılmış su içinde her türlü toz çözünene kadar Tablo manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 0.22 mikron filtre kullanarak medya mikro filtrasyon gerçekleştirin. Steril şişelerde medyayı saklayın.
- Bulaşmamış (taze) yıkayın RPMI kullanarak A + eritrositleri yazın. Eritrositlerin% 5 hematokrit (9.5 mi,% 10 RPMI + insan serumu içinde yıkandı, taze eritrositlerin 0.5 ml) hazırlayın.
- % 15 insan serumu + RPMI (insan serumu ve 15 ml RPMI 85 mi) parazitlerin ekimi başlatmak için yapın. % 10 insan serumu ve RPMI (insan serumu ve 10 ml RPMI 90 mi), kırmızı kan hücreleri parazitlerin kültürlenmesini devam edin.
- Kültür P. falsiparum (3D7 ve FCR-3 suşları) tip% 5 ve% 20 hematokrit parazitemya petri veya 75 cm 3 kültür şişesi A + insan eritrosit. Trager ve Jensen mum kavanozu 26 yöntemine göre, in vitro olarak kültür muhafaza edin. Alternatif olarak, kültürler% 9.5 CO2 ve% 3.4 N2 gazı muhafaza 37 ° C'de inkübatör içinde korumaktadır. Kültür P. falciparum'un RPMI 1640-HEPES ortam,% 10 insan serumu ile takviye edilmiştir.
- P. senkronize % 65 Percoll kültürüne (Percoll + insan serum olmadan RPMI-1640 içinde 35 mi, 65 ml) ilave edilerek falciparum kültürü 27 konsantre edilir.
- 3 kat sonuçlanan 5 dakika 2500 xg'de Percoll'un kültür konsantresini santrifüjleyin. Dikkatle, bir transfer pipet kullanarak aseptik koşullarda 27 altında ayrı bir tüp içine orta tabaka transferi schizontsun izole.
- 5 dakika boyunca 7500 x g'de santrifüjleme ile, fazla Percoll temizlemek için iki kez% 10 insan serumu + RPMI-1640 ile izole edilmiş kültürleri yıkayın. DiSüpernatan, aseptik koşullar altında 27 her scard.
- Senkronize P. kültürleme Devam % 10 insan serumu + 27 RPMI-1640 falciparum şizont.
- 10 mM Tris pH 8.8 ile Plasmodium enfekte olan eritrositlerin tedavisi ve 15 dakika 23 15000 xg'de santrifüjleme ile schizontsun toplayın. Peletlere proteaz inhibitörü (aprotinin) içinde 5 ul ilave edildikten sonra -70 ° C'de saklayın, parazit topakları. Protein ekstre etme, genomik DNA izolasyonu ve RNA izolasyonu için parazit topakları kullanın.
2. plazmid vektörünün hazırlanması
- P. genomik DNA izole yaklaşık% 20 parazitemya kültürlerinden hazırlanabilir falsiparum şizont peletler.
- Bir mikrosantrifüj tüpü içinde peletlere pH 7.6 olan 10 mM Tris-HCI, 50 mM EDTA, pH 8.0,% 0.1 SDS ve 1 mg / ml proteinaz K, 600 ul ekle 26 G iğne takılı bir 1 ml şırınga ile pelet homojenleştirin. Şırınga doldurma AlternatifPelet karışımı bir mikrosantrifüj tüpü içine boşalma 20 kez. Bir 50 ° C su banyosu içinde tüp içeren homojenat O / N inkübe edin.
- P + C, 600 ul (300 ul fenol ve kloroform 300 ul) homojenize edilmiş pelet eklenerek, kloroform (P + C) çıkarma - fenol gerçekleştirin. Cap tüpü sıkıca ve tüp uçtan uca ters çevirerek kuvvetlice karışımı sallayın. 2 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin ve tüp yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine bir mikropipet kullanılarak, üst sulu çözelti toplar. İki kez bu adımı yineleyin.
- Aşama 2.1.2 yeni bir tüp içinde, sulu tabaka kloroform 600 ul ekle. 2 dakika için 14,000 x g'de 10 saniye ve santrifüj tüpü vorteksleyin. Bir mikropipet ile üst sulu tabaka ölçün ve yeni bir mikrosantrifüj tüp transfer.
- Sulu, yumurtlama (sulu katman, 300 ul 5 M sodyum asetat pH izopropanol 5.5 + 330 ul, 30 ul ise), 5 M sodyum asetat pH 5.5 ve 0.1 hacim izopropanol ile 1 hacim eklemeadım 2.1.3 den er. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü.
- DNA pelet çökeltmek için 10 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin tüpü. Süpernatant atılır ve DNA fazla tuzu çıkarmak için% 70 etanol içinde 100 ul (etanol içinde 70 ul ve dH 2 O 30 ul) ile pelet yıkayın. -20 ° C'de dH 2 O 50 ul saklayın DNA arasında değişir.
- P. yükseltilmesi için elle ileri Tasarım ve yazılımı kullanarak ters primerleri veya Tablo 2'de gösterildiği gibi, falsiparum genleri PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 ve PF3D7_0114100 önce proteome çalışmaları sentezleme plasmidi pT7CFE1-CHIS'in çoklu klonlama sitelerinin gen dizilerinin klonlanması izin vermek için uygun sınırlama siteleri ile 16,18 tespit etmesidir.
- Ilave bir 50 ul reaksiyon karışımı yapmak; Izole edilmiş P. 5 ul falsiparum genomik DNA'sı, 10x tampon 5 ul, MgCl2 5ul, ileri primer, 1.5 ul, 1.5 ulters primer, T7 DNA polimerazı 0.5 ul dH 2 O 31.5 ul ve denatürasyon için 8 dakika boyunca 94 ° C 'de, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yerine, uzatma 1 dakika 30 saniye için 50 ° C, 9 72 ° C Tablo 1 'de gösterilen genlerin amplifiye edilmesi için tavlama ve renatürasyon için min.
- % 1 agaroz jeli (agaroz 1 g Tris asetat EDTA, 100 ml (TAE) tamponu) 32 ile ayrı ayrı PCR ürünleri.
- Agaroz jelinden PCR ile çoğaltılan DNA bantları kesin bir DNA jel özütleme spin kolon DNA ihtiva eden jel dilimleri yerleştirmek ve 5 dakika boyunca -20 ° C'de dondurun. 5 dakika için 14,000 x g'de donmuş jel dilimlerinin ve santrifüj izopropanol 100 ul ekle.
- Mikropipet kullanılarak sulu akış yoluyla adım 2.5 arasında bir toplama tüpü içinde, süzüldü ölçülür ve yeni bir tüpe aktarılır. 5 dakika için 14,000 x g'de 5 M sodyum asetat ve santrifüj 0.1 hacim ekleyin. Süpernatantı atın ve inci dH 2 O 10 ulE DNA pelleti.
- Plazmid 3 ul ve her bir tüpe, PCR gen ürünlerinin 5 ul ekleyerek iki ayrı tüplerde pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü ve (2.6) ile birlikte saflaştınlmış DNA fragmanlarının Digest. Her bir tüpe belirli bir kısıtlama enzimleri 1 ul reaksiyon tampon maddesi, 2 ul ve dH 2 O 14 ul ekle
- Sindirilmiş plasmid 3 ul, sindirilmiş DNA fragmanlarının 5 ul 10x ligaz tampon maddesi, 2 ul, ligaz 1 ul bir mikrosantrifüj tüpü içinde dH 2 O 9 ul ekle. 12 ° CO / N inkübe.
- PH 5.5 ve 2 hacim etanol ile 3 M sodyum asetat ve 0.1 hacim ekleme adımında 2.14 tüpe (daki bağlama borular hacmi ise 20 ul 3 M sodyum asetat, etanol içinde, + 44 ul 2 ul). İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
- 15 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin tüpü. Dikkatle pelet bozmadan mikro pipet kullanarak süpernatant kaldırmak.
- % 70 etanol, t, 100 ul ekleadım 2.10 den pelet o. 5 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin tüpü. Süpernatantı çıkarın ve atın. DNA pelet nükleaz içermeyen su, 10 ul ekle.
Vitro İnsan Hücre Özgür İfade Sistemde Kullanılması 3. Protein Ekspresyonu
- Rekombinant pT7CFE1-CHIS plazmid DNA, 2 ul 5x transkripsiyon tamponu 4 ul NTP karışımı 4 ul, T7 RNA Polimeraz 2 ul ve nükleaz içermeyen su 8 ul 2-adım için ölçülerek transkripsiyon karışımından 20 ul hazırlanması DNA şablonları kullanarak Vitro Protein Ekspresyonu İnsan. Mikrosantrifüj tüpü içinde karıştırın ve bir su banyosunda 30 ° C'de 75 dakika inkübe edilir.
- Transkripsiyon karışımı 2 ul almak ve HeLa hücre lisatı, 12.5 ul, yardımcı proteinler 2.5 ul tuz çözeltisi A 1 ul, amino asitler 0.5 ul Met, amino asitler 0.5 ul ihtiva eden için karışım 23 ul eklemek Leu, 181; RNaz inhibitörü l, enerji karışımları 1.25 ul ve nükleaz içermeyen su 3.75 ul.
- 90 dakika boyunca 30 ° C 'de aşama 3.2 için karışımı inkübe edin. Mağaza -20 ° C'de ürünleri çevrilmiştir.
- 1-adım için rekombinant pT7CFE1-CHIS plasmid DNA 3 ul, nükleaz içermeyen su, 2 ul reaksiyon karışımı 5 ul HeLa lizat 12.5 ul ve yardımcı proteinlerinin 2.5 ul ekleyerek transkripsiyon ve çeviri karışımı 25 ul hazırlanması DNA şablonları İnsan Coupled IVT Protein Ekspresyonu.
- 30 ° C'de 90 dakika ila 6 saat süreyle için adım 3.4 reaksiyon karışımı inkübe edin. Çeviri ürünleri de Mağaza -20 ° C.
Sentezlenen rekombinant proteinler, 4. saflaştırılması
- Bu saflaştırma karışımına 100 ul yapmak için ürünün 25 ul 1x saflaştırma tamponunda 75 ul ekle.
- Saflaştırma mikst 100 ul nikel kenetleme reçinesi 100 ul ekleure. Yıkama Ni-reçine iki kez dH 2 O 300 ul ve bağlayıcı tampon 300 ul ekleyerek. Aşırı etanolü ortadan kaldırmak için 1 dakika için 14,000 x g'de reçine ve santrifüj yeniden askıya.
- Aşama nikel kenetleme reçinesi 4,2-100 ul saflaştırma karışımına 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 60 dakika süreyle inkübe karışımı.
- 1 dakika boyunca 14.000 xg'de karışımı Santrifüj ve "akışı" olarak etiketlenmiş Taze bir tüp içine süpernatant toplamak.
- 1x yıkama tamponu içinde 100 ul (20 mM imidazol, 250, pH 8 mM NaH 2 PO 4, 2.5 M NaCl ve dH 2 O) ile yıkayın reçinesi. 1 dakika boyunca 14.000 xg'de Santrifüj ve "yıkama" etiketli taze tüp içinde süpernatant toplamak. Adımı yineleyin 4.5 kez.
- 1x elüsyon tamponu 100 ul ekle (pH 8.0, 100 mM imidazol, 250 mM Na-2 PO 4, 2.5 M NaCI ve DH 2 O) reçineye ve 15 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin. İki kez elüsyon adımı yapın. Herzaman "elüat" taze mikrosantrifüj tüpleri ve etiket içine süpernatant toplamak.
- Aşama 4.5 de tarif edildiği gibi yıkanmasından sonra, iki kez reçine yıkayın. Mağaza -20 ° C veya daha düşük sıcaklıklarda aracılığıyla yıkar ve elüsyon örnekleri akış. Reçine, 4 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir. SDS-PAGE ve immunoblotting analizi için, her numune için 30 ul kullanın.
5. Coomassie (Bradford) Protein Deneyi 34
- Konsantrasyon, standart sığır serum albümini (BSA) çözelti hazırlayın 20 ug / ml, 40 ug / ml (BSA içinde 20 ul karışımı (BSA (2 mg / ml) ve dH 2 O 90 ul 10 ul karışımı) (2 mg / ml) ve DH 2 O), 80 ul, 60 ug / ml ((2 mg BSA (2 mg / ml) ve DH 2 O), 70 ul, 80 ug / ml (BSA içinde 40 ul karışımı 30 ul karıştırın / ml) ve DH 2 O), 60 ul, 100 ug / ml (BSA (2 mg / ml) 50 ul ve DH 2 O) 50 ul, 160 ug / ml (BSA içinde 80 ul mix (2 mg / ml) ve dH 20 ul2 O) ve 200 ug / ml (BSA, 100 ul (2 mg / ml).
- Ölçü aşama 4,7 boyunca akış, yıkama ve elüat numune 5 ul. DH 2 O. 95 ul ekleyin
- Adım 5.1 ve 5.2 arasında karışımlarına Coomassie mavisi reaktif 5 ml. Sn daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir, 10 için parafilm ve vorteks Tüpleri örtün.
- Bir spektrofotometre kullanılarak, Aşama 5.3 protein borular 650 nm dalga boyunda optik yoğunluk (OD) ölçün. OD okuma vs Plot konsantrasyonu protein konsantrasyonlarını belirlemek için 34.
6. Western Blot
- P. şizont özler 5 ul ekle falciparum, Escherichia coli 2 ul rekombinant rhOP-3 proteinler 31 belirtilmiştir, yeniden birleştirici proteinlerin 5 ul tüpleri ayırmak için afinite yöntemi kullanılarak 2-adım ve in vitro insan ekspresyon sistemlerinde 1 adım ve protein ürünleri 10 ul saflaştırılmış kullanılarak ifade edilir. Çözündürülmüş protein örnekleri yapmak için 20 ul bir son hacim için, her bir tüpe elektroforez örnek tamponu ihtiva eden merkaptoetanol ekleyin. 2 dakika süreyle tüpleri kaynatın.
- Proteinleri ayırmak için% 10 SDS-PAGE jelleri üzerine çözündürülmüş protein örneklerinin yükleyin.
- 2 saat için bir yarı kuru VVestern blot odasındaki jel başına 35 mA akımda elektroforezlenerek nitroselüloz kağıda (NCP), SDS-PAGE jelleri ayrılmış proteinler aktarın.
- % 2 yağsız süt ile transferi aşağıdaki Blok NCP'ler.
- Inkübe 1 seyreltilmiş aşağıdaki poliklonal antikorlarla NCP'ler bloke: batı blotting gerçekleştirmek için% 2 süt 100; tavşan antikoru P. özgü 676. 21 falsiparum Merozoit rhoptries, P. 20, belirli fare antikorları ve P. yoelii P. özgü berghei Merozoit rhoptries antiserumlar # 685 Maurer için spesifik falsiparum parasitophorous vacuole'nin proteini, SERA (serin bakımından zengin antijeni) 22 ve antikorlar217; s yarık protein KMYK-2TM 28.
- 1 de NCP'ler inkübe: 100 seyreltilmiş normal fare ve tavşan serumu ve SP2 miyelom hücrelerinin harcanan kültürün üzerinde yüzer (SCS) olarak negatif kontroller.
- 4 ºC O / N de antikorlar ve kontroller ile NCP'ler kuluçkaya yatmaktadır.
- Blot ile yıkayın NCP 4x tampon ve yaban turpu peroksidazı (HRP) konjuge edilmiş türler, belirli sekonder antikor ile inkübe NCP suyla 1: 2,% süt 1000.
- Leke tamponu ile yıkayın NCP 4x. Inkübe renk gelişimi çözeltisi ile yıkandı, NCP A + B (Çözelti A: tampon 1x Blot 50ml ekleyebilir ve H2O 2 30 ul; Çözelti B: 10 ml metanol ve 3-kloro-naftol, 30 mg) eklemek için 30 Karanlıkta min. Kolorimetrik western blot sonuçlarını analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spesifik antikorlar ile reaktivite ile eksprese edilen rekombinant proteinleri Doğrulama ifade edilen proteinlerin düzgün katlanmasını teyit önemli bir ilk adımdır. Rekombinant sıtma proteinler bir adım ve in vitro insan hücre özgür ifade sistemlerinde iki adımı kullanarak ifade edildi. Rekombinant proteinler, saflaştırılmış Ni-kelat yapıcı afinite yöntemdir. Daha sonra, SDS-PAGE, ayrılmış yeniden birleştirici proteinlerin western blotting bütün Merozoit rhoptries karşı antisera kullanılır.
Şekil 1, bir% 1 agaroz jeli içinde PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 ve PF3D7_1436300 PCR amplifiye edilmiş gen parçalarını gösterir. DNA bantları çıkarıldı ve DNA DNA ekstraksiyon Spin Sütun dondurma ile arıtılmış.
Genomik DNA 'dan (Tablo 2'de gösterilmektedir) başarılı bir şekilde büyütülmüş Sıtma genleri pT7CFE-CHIS sentezleme vektörü içine klonlandı. Yeniden amplifikasyon reco genlerinmbinant plazmid vektöründe klonlanmış gen fragmanlarının varlığını göstermiştir. Protein translasyon için kullanılan ekspresyon sistemleri akış şemasıdır. Şekil 2'de gösterildiği gibi Şekil 2A ve 2B, in vitro insan hücre serbest ekspresyon sisteminde 2 adım 1 adım IVT bağlanmış için sisteminin adım adım prosedürü gösterir. In vitro insan hücre serbest sentezleme sistemleri kullanılarak Plasmodium proteinlerinin başarılı sentezleme rhoptry spesifik tavşan antiserumları ile teyit edilmiştir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, rekombinant proteinleri rhoptry spesifik tavşan antisera # 676 tarafından kabul edilmiştir. Daha önce gösterildiği gibi, eksprese edilen rekombinant proteinleri, P., parasitophorous vacuole'nin büyümesi proteinlere karşı antiserumlar tarafından tanınan değil falciparum ve P. yoelii ifade edilen proteinlerin 32 karşı tavşan antisera 676 özelliğini gösterir. Normal tavşan serumu (NRS) yeniden birleştirici protein ile reaksiyona girmemiştirin vitro insan hücre barındırmayan sentezleme sistemi ve 1 adım IVT bağlanmış translasyon sistemi (Şekil 3B) içinde bir 2-aşaması kullanılarak çevrilmiştir. Plasmodium rekombinant proteinlerin başarılı bir şekilde ekspresyonu,-jel histidin boyama ve nikel-HRP 32 lekeleme gibi farklı teknikler ile teyit edilmiştir. Eksprese edilen proteinler afinite saflaştırma sistemi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma (bir sütun kullanılır) parti yöntemi gerçekleştirilir. tekniği 100 mM 60 mM ila imidazol konsantrasyonlarını değiştirerek optimize edilir. elüsyon için optimum konsantrasyonu 250 mM kadardır. Şekil 4, çevrilen protein ürünlerinin 25 ul çevrilen protein saflandırılmasında gösterir. Şekil 4A Maurer'in Yarık transmembran proteinin 18 saflandırılmasında gösterir. Şekil 4B PF3D7_0925900, P. başarılı saflaştırılmasını göstermektedir Plasmodium yoelii gen PY17X_0830000, a falciparum ortologuhipotetik protein 32. Şekil 4C proteini PY17X_1139200, Ni reçine boncuk ve 1x elüsyon tamponu 100 mM imidazol kullanarak varsayımsal protein içeren armadillo tekrarların başarılı arınma gösterir. saflaştırma işlemlerinden sonra, proteinin verimi 3.5 ug / 25 ul.
P. Şekil 1. Büyütme falciparum ve P. yoelii genler. P. amplifiye PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 ve PFA0680cw gen fragmanlarının% 1 agaroz jel gösteren etidyum bromid lekeli PCR ürünleri falciparum genomik DNA olabilir.
HeLa bas Şekil 2. Akış şeması ed hücresi ücretsiz sentezleme sistemi. 2 adım ve in vitro insan hücre özgür ifade sistemlerinde 1 adım hem şematik gösterimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protein ekspresyonu Şekil 3. Bağışıklık onayı. 676. anti serum ve normal tavşan serumu tam rhoptry spesifik tavşan kullanılarak sentezlenen rekombinant proteinlerin Western blot analizi. Eksprese edilen rekombinant proteinleri ile antisera 676 (A) reaktivite. (B) normal tavşan serumu eksprese edilen rekombinant proteinleri ile reaksiyona girmemiştir. Parasitophorous vacuole'nin proteini rekombinant proteinler 32 ile reaksiyona girmemiştir.hres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil translasyon ürününün mikro hacim proteinlerin 4. saflaştırılması. Nikel reçinesi afinite yöntemi kenetleme kullanılarak sentezlenen rekombinant proteinlerin saflaştırılması. Eksprese edilen proteinler (çevirisi) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, ve (C) PY17X_1139200 proteinler Ni ile kuluçkalanmıştır - kenetleme reçineler tamponu ve arıtma için bağlama tamponu içerisinde imidazol yokluğunda Nikel kenetleme reçinesi ile saflaştırılır. Kuluçkadan sonra, boncuklar, santrifüjlendi Bağlanmamış proteinleri ayrıldı ve boncuk yıkama tamponu içinde iki kez yıkanmıştır. Bağlı rekombinant proteinler iki boncuk yıkama izlemiştir elüt edilmiştir. Çeviri proteinler, yıkar, eluatlar ve boncuklarelektroforez örnek tamponu içinde çözüldü. İmidazol yıkaması (imidazol 20 mM) ve elüsyon tamponlarının (imidazol, 100 mM) 'de kullanılmıştır. Antisera # başarılı bir şekilde kabul 676 eksprese edilmiş ve saflaştırılmış rekombinant proteinleri. Normal tavşan serumu Şekil 3B'de gösterisi olarak ifade edilen proteinler ile tepki vermedi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Özellikler | İnsan Hücresiz sentezleme sistemi | Buğday germ hücreli ücretsiz sentezleme sistemi | Tavşan retikülosit sentezleme sistemi | E.coli lisatı, protein sentezleme sisteminin |
| Zaman | 3 saat içinde, transkripsiyon ve çeviri yapılır | 20 saat - 10 saat 6 ve çeviri için Deşifre | RNA vardır izole çeviri 90 dakika sürer | Don1 saat e |
| Uygun vektör | T7 vektörü olabilir | SP6 vektör | T7 kullanılabilir | T7 kullanılabilir |
| Uygun ölçek | Laboratuar sentezi için uygun | Büyük ölçekli protein sentezi için kullanılır | Laboratuar ve bağışıklama çalışmaları için uygundur | Laboratuar ve bağışıklama çalışmaları için uygundur |
| Özüt | HeLa hücre özütler | Buğday özleri Embriyo | Retikülosit hücre ekstreleri | E. Hücre lizatı özleri coli |
| Değişiklik | Co-translasyonel ve post translasyonel modifikasyon | Translasyon sonrası değişiklik | Eş-translasyonel modifikasyon | Post-translasyonel modifikasyon |
| Protein boyutları tercüme | 250 KDa 8 kDa | 220 KDa | 250 KDa | <td> 200 KDa|
| Kodon optimizasyonu | Sıkı | Sıkı | Gevşek | Sıkı |
| Disülfür bağı oluşumu | Evet | Evet | Hayır | Evet |
| Verim | Düşük verim | Yüksek verim | Düşük Verim | Çok yüksek verim |
| Maliyet | 10 reaksiyonlar için 130,00 $ | 10 reaksiyonlar için 173,00 $ | 5 reaksiyonlar için 136,00 $ | 8 reaksiyonlar için 159,00 $ |
| Protein konsantrasyonu, | Reaksiyon başına 3-5 ug | 100 ug / ml | 100 ug / ml | 500 ug / ml |
| Kaynaklar | 32, 30 | 7, 28, 29 | 7 | 7, 24, 25 |
Sıtma araştırma Tablo 1. Hücre ücretsiz ekspresyon sistemleri. Hücresinin karşılaştırılmasıözgür ifade sistemleri şu anda sıtma araştırmalarda kullanılan.
| Gen ID | Ortologu Kimliği | Protein | PCR için primer sekans |
| PF3D7_1436300 | Translokon bileşeni | CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG | |
| GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC | |||
| PF3D7_0114100 | KMYK-2TM Maurer'in yarık protein | GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA | |
| CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA | |||
| PY17X_0830000 | PF3D7_0925900 | Varsayımsal Protein | GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA |
| CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60; | |||
| PY17X_1139200 | PF3D7_1361800 | Varsayımsal Protein | GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA |
| CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT |
Çalışmaya Tablo 2. Rhoptry genler. Bu çalışmada 19 olarak ifade edilmiştir, farklı genlerin primerler.
| Malzeme Adı | Şirket | Katalog numarası | Tanım |
| Vitro insan hücresi ücretsiz ifade sisteminde 32 2 adımlı | Thermo Fisher | 88856 | Durdurulan. Daima -80 ° C'de saklayın. Ilık su ile çözülme etmeyin. |
| Nitro bağlanmış için sistemde 1 adımlı | Thermo Fisher | 88860 | Daima -80 ° C'de saklayın. Inci etmeyinIlık suda w. |
Tablo 3. Hela göre hücresiz ekspresyon sistemleri. Proteinlerin ekspresyonu için kullanılan Setleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
vitro insan hücre barındırmayan sentezleme sistemi ve arıtma iki adımı kullanarak proteinin başarılı bir şekilde ifadesi için önemli adımlardır: 1) başarılı bir yükseltme ve pT7CFE-CHIS plazmid vektörü içine genlerin klonlanması; 2) 30 o C RNA transkripsiyonu; RNaz inhibitör varlığında, 30 ° C'de protein 3) yapıldı; 4) poliklonal ve monoklonal antikorlar kullanılarak reçine Ni ve 5 ile kaplı haplar), batı lekesi üzerinde analiz sonuçları kullanılarak afinite bazlı saflaştırma protokolü geliştirilmesi. bir adım IVT bağlanmış bir protein için sistemi kullanılarak protein ifadesi için başarılı bir şekilde önemli adımlardır: 1) başarılı bir yükseltme ve pT7CFE-CHIS plazmid vektörü içine genlerin klonlanması; 2) 30 ° C 'de transkripsiyon ve proteinlerin çevirisi; 3) poliklonal ve monoklonal antikorlar kullanılarak reçine Ni ve 4 ile kaplanmış boncuklar), batı lekesi üzerinde analiz sonuçları kullanılarak afinite bazlı saflaştırma protokolü geliştirilmesi.
Şimdikily, hücresiz ekspresyon sistemleri rekombinant sıtma proteinleri ifade etmek için kullanılır. Sıtma proteinleri ifade etmek için hücresiz sentezleme sistemlerinin önemli özellikleri bakımından zengin genlerin kodunu çözmek için yeteneği, uzun bir translasyon durdurma, tekrar bir amino asit sekansları başarılı bir şekilde ifade glikosilasyon mekanizmasının olmaması ve gen kesme kontrol etmek için plasmidlerin kabiliyetinin olmaması. Bu çalışmada, in vitro insan hücresiz sentezleme sistemi 32, bir iki adım ve P. ifadesi için tek aşamalı bir IVT bağlanmış çeviri sistemlerinin kullanımını göstermektedir P. falciparum gen ortologlar . Tablo 1 'de gösterilen bir saflaştırma protokolü geliştirilmiş ve 1 adım ve in vitro insan hücre serbest ekspresyon sistemleri içinde bir 2-aşamasından elde edilen yeniden birleştirici protein mikro-hacimleri saflaştırılması için optimize edildiği gibi yoelii Merozoit rhoptry genler. 4 P. falsiparum genler, bir zar-ötesi hidrofobik protein, bir tahmin edilen varsayımsal KOL tekrar PF3D7_0114100Protein PF3D7_1361800 ve bir hidrofilik bir protein PF3D7_0925900, bir 2-adım ve in vitro insan hücre serbest ekspresyon sisteminde 1 aşaması kullanılarak ifade edildi. Saflaştırılmış protein verimi saptanmıştır. iki transmembran bir integral membran proteinidir ve in vitro sentezleme sistemi doğru transmembran proteini ifade ve saflaştırma kolaylığı için izin verebilir belirlemede ilgi nedeniyle, protein KMYKK-2TM, bu çalışmalara dahil edilmiştir.
her ikisi de bir basamak ve iki aşamalı bir sentezleme sistemlerinde temel fark, iki aşamalı bir ekspresyon sistemi stabil mRNA transkripsiyonu ve çevirisi reaksiyona ilave bir mRNA bağlıdır sistem olmasıdır. Bunun aksine, in vitro bağlanmış transkripsiyon bir adım / çeviri sistemi reaksiyon sırasında proteinin eş çeviri ardından sürekli bir transkripsiyon ve mRNA kaynağı içerir. Her ikisi de 1 adım IVT transkripsiyon / çeviri birleştiğinde eXPression sistemi ve in vitro insan hücre serbest ekspresyon sisteminde 2 adımlı yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin ifadesi için test edilmiştir. Her iki sistem de düşük molekül ağırlıklı rekombinant proteinleri ifade başarılı oldu. 1-adım sentezleme sisteminde, dönüştürme reaksiyonu karışımı içinde proteinler ile antikor çapraz reaktivite gözlemlenmiştir. çapraz antikorlar ile reaksiyona spesifik proteinlerin bilinmeyen ve daha fazla araştırma gerekiyor. Yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin sentezlenmesi 1. adım 2 aşamalı sistemler her ikisini de kullanarak başarısız oldu. Bir saf hale getirme protokolü 1 adım ve in vitro insan hücre serbest ekspresyon sistemleri içinde bir 2-adım her ikisini birden kullanarak ifade edilen farklı çözünürlük özelliklerine rekombinant proteinlerin saflaştırma microvolumes için geliştirilmiştir. Proteinler başarıyla saflaştırılmış ve 1 adım ile çevrilmiş zaman in vitro protein çeviri sistemi 2-adım ve 25 ul başına 1.5 ug kullanılarak ifade elde edilen verim 25 ul başına 3.5 ug oldu benVT protein ekspresyon sistemi. 18 kDa 37 kDa değişen düşük molekül ağırlıklı proteinlerin sentezlenmesi yalındır tekrarlanabilir ve olduğunu. Bununla birlikte, yüksek moleküler ağırlıklı tanımı, protein kesikler ile sonuçlanır. Nedeniyle klonlanmış DNA elde microvolumes, PCR amplifikasyon ürünleri klonlanmış doğrulamak için kullanılmıştır. Nedeniyle reaksiyon ATP yüksek konsantrasyonu, elF2 alfa alt-biriminin sabit fosforilasyonu olabilir hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin sentezlenmesi için olası engeller. Bu potansiyel hücre özgür ifade sistemlerinde 10 büyük proteinlerin sentezi sırasında protein sentezinin uzamasını etkileyen sisteminde çeviri başlamasını bozar.
Burada açıklanan protokol proteinlerinin ekspresyonu için optimizasyon koşullarından etkilenmeyen, tuzla. Ne gen kodonlar veya plazmid proteinlerinin ekspresyonu için optimize edilmiştir ve protein yeniden katlama gerekli değildi. Bu sistem p ifade3 saat ve protein saflaştırma roteinler gibi aşılamalar ya da peptid sekanslaması için rekombinant proteinin işleme gibi başka bir aşağı doğru uygulamalar için izin 2 saat içinde elde edilebilir. Birden fazla rekombinant proteinleri bağışıklık serumu tarama ve potansiyel aşı adayları moleküllerin tanımlanması için mikrodizi biçimlerini kullanarak, HeLa hücre barındırmayan sistem ile ifade edilebilir. Bundan başka, potansiyel olarak imünojenik protein ifade ölçeklendirme ile elde edilen proteinleri ekranlar ile tanımlanır ve seçilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-step in vitro human cell free expression system | Thermo Fisher | 88856 | Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water |
| 1-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at RT |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4 °C. |
References
- Alexandrov, K., et al.
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A.
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y.
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
