Summary
Выражение малярийных белков в клеточных системах на основе остается сложной. Мы демонстрируем две системы шаг и один шаг IVT (в пробирке перевод) бесплатно экспрессии клеток для выражения малярийных рекомбинантных белков rhoptry из HeLa клеток. Мы используем систему очистки на основе Ni-смолы сродства для очистки rhoptry белки.
Abstract
Малярия вызывает серьезную глобальную заболеваемости и смертности. Нет дня вакцина не доступна в данный момент. Один из главных причин, из-за отсутствия вакцины задача выявления подходящих кандидатов вакцины. Малярийные белки выражается с помощью прокариотических и эукариотических систем экспрессии клеток на основе плохо гликозилирован, как правило, нерастворимы и пройти ненадлежащее складывание приводит к снижению иммуногенности. Свободные системы экспрессии зародышей пшеницы, лизата ретикулоцитов кролика и кишечная палочка лизат клеток в настоящее время используются для выражения малярийных белков. Однако продолжительность времени экспрессии и неправильного гликозилирования белков до сих пор остается проблемой. Мы демонстрируем выражение Plasmodium белков в пробирке с помощью системы свободного выражения клеток HeLa основе их называют "сотовые системы экспрессии бесплатно в пробирке человека". Свободные системы экспрессии клеток HeLa основе 2 транскрипции мРНК в 75 мин и 3 мкл transcribред мРНК достаточно, чтобы перевести белки в течение 90 мин. Система 1-шаг выражение транскрипции и трансляции системы в сочетании выражение; транскрипция и со-перевод происходит в 3 ч. Этот процесс также может быть расширен в течение 6 ч, обеспечивая дополнительную энергию. В системе 2-ступенчатой экспрессии мРНК сначала транскрибируется, а затем добавить в смесь перевода для экспрессии белка. Мы опишем, как выразить малярии белки; гидрофобный Волчья PF3D7_0114100 Маурера - 2 трансмембранный (PFMC-2TM) белок, белок гидрофильный PF3D7_0925900 и броненосец повторы, содержащие белок PF3D7_1361800, использующие систему свободного выражения клеток HeLa основе. Белки выражается в микро объемов использующих 2-ступенчатые и 1-шаг стратегии экспрессии. Метод аффинной очистки, чтобы очистить 25 мкл белков, выраженных с использованием человеческих клеток системы свободного выражения в пробирке также описаны. Выход белка определяется анализом Брэдфорда и выразили очищенные белки могут быть подтверждены с помощью анализа вестерн-блоттинга. Выраженные рекомбинантные белки могут быть использованы для иммунизации иммунологических и секвенирования белка.
Introduction
В малярией исследования, выражение иммуногенных белков с использованием прокариотических или эукариотических систем, основанных клеток остается проблемой. НА богатство Plasmodium геноме и неизвестных посттрансляционных механизмов 14,7, способствуют трудности, связанные с получением правильно сложенные и иммуногенные белки для производства антител и вакцин исследований. Прокариотических системах, таких как кишечной палочки были использованы для экспрессии рекомбинантного белка. Прокариотических системах являются низкая стоимость, эффективный, высокие урожаи рекомбинантного белка и имеют несколько векторов клонирования. Принимающая Е. палочки клетки легко трансформировать и клетки быстро расти. Тем не менее, прокариотические системы имеют ограничения, такие как отсутствие замещения аминокислоты, посттрансляционной модификации, риск загрязнения, гетерогенных продуктов и накопления рекомбинантных белков в тельцах включения 24.
ВИсследование Mehlin др. (2006), были выражены 1000 открытые рамки считывания (ORF). Примерно 7% выраженных белков растворяются 14. Нерастворимость наблюдается из-за смещенного природы генов и высокой частоты кодонов, которые используются в идеале от Plasmodium у богатых генома 14. Альтернативная стратегия для преодоления этой проблемы была разработана с помощью плазмиды или клеток-хозяев, содержащих тРНК, которые распознают редкие кодоны или кодоны, которые соответствуют частоты 3. Даже после выполнения этих оптимизацию, очень небольшие порции белков выражены как растворима активна и иммуногенной 14. Системы экспрессии бесклеточные содержать все компоненты, необходимые для транскрипции и трансляции, такие как рибосомы, факторы инициации, элонгации факторов (факторов) переводы, тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы. Обе реакции транскрипции и трансляции соединены в один шаг процедуры 11,29. TranscriРеакция автомеханик выполняется в трубе, прежде чем соответствующее количество мРНК инкубировали с перевода техники в другом трубки 11,29. Хотя эти методы являются успешными в Plasmodium Sp. Экспрессии белка, основным недостатком является продолжительность времени для экспрессии белка, который составляет примерно 22 ч 29. Кроме того, высокая стоимость расходных материалов для включения в протоколы 29, трудоемких препараты клеточного лизата и несоответствия в компонент препаратов, сделать эти системы недостижима. Основное внимание исследователей для развития свободной системы экспрессии клеток зависит от таких факторов, как быстрое генетической модификации, быстрых выходов с высокой концентрацией и прямо вперед лизатов препаратов 1.
Эукариотических системах, таких как дрожжи, клеточные линии млекопитающих, бакуловируса опосредованной системы экспрессии, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum и паразитарных системах экспрессии суч в Leishmania были использованы для экспрессии рекомбинантного белка 7. Эукариотических системах поделиться филогенетическое родство и, следовательно, общие характеристики, такие как гликозилирование, ацилирование, образование дисульфида облигаций, шаперонной взаимодействия, протеолиза и субклеточном раздробленности. Белковые секреции события в эукариот предотвратить накопление и уменьшается токсичность для систем экспрессии 13. Применение дрожжей систем является предпочтительным, поскольку они пригодны для экспрессии белка в большом масштабе и для получения высоких урожаев 4. Два П. тропической белки PFCP-29 и Pvs25 были произведены с использованием системы дрожжей 4. Тем не менее, основным недостатком в синтезе большинства белков нерегулярные N и О-гликозилирования узоры, неадекватное складывания и усечение белков из их родной форме 4.
Использование клеток млекопитающих для синтеза рекомбинантных белков является трудоемким, и это expenSive для поддержания стабильных рекомбинантных клеточных линий 4. Таким образом, клетки млекопитающих были ограничены для анализа сигналов белка, белковых взаимодействий и паразит-хозяин взаимодействий, а также для тестирования вакцин ДНК 4. ДНК человека и РНК в пробирке бесклеточной системе экспрессии белка, описанный здесь, млекопитающих система на основе клеток, полученных HeLa, что выражает белки в 3 ч. Белки выражается с помощью pT7CFE1-Chis вектор экспрессии имеют C-концевой метки облегчая идентификацию и очистку. Система основана HeLa дополнена факторов инициации трансляции и регулятора перевода, тем самым повышая эффективность системы перевода. Белки могут быть быстро переведен, экранированный, проверены и обработаны для использования в различных иммунологических и конструкционных применений 15.
Эукариотических системах экспрессии клеток-Free, такие как зародыши пшеницы и ретикулоцитов кролика в настоящее время используется для выражения Varдолговые расписки эукариот белки, включая белки Plasmodium 11,29. Кроме того, Е. Системы, основанные палочки бесклеточные также используются для выражения эукариотических белков 11. В таблице 1 приведены различные системы экспрессии клеток бесплатно, сравнивая особенности систем, а также простоту использования системы для экспрессии белка. Бесклеточной системе человеческого в сравнении с другими имеет возможность выполнять пост и ко-трансляционных модификаций и дешевле. Оптимизация кодонов можно и все эти реакции могут быть осуществлены в 3 ч. Система HeLa является идеальной системой перевод синтеза белка в лабораторных условиях.
Основным преимуществом систем экспрессии клеток человека свободным по сравнению с другими свободными системами клеток является наличие нескольких различных клеточных линий, полученных из различных органов и тканей. Несколько разновидностей свободных клеточных системах могут быть разработаны в зависимости от клеточной линии. Экстрактс, полученные из клеток млекопитающих имеют более высокую эффективность, чтобы синтезировать большие белки, чем любых других системах экспрессии клеток бесплатно. Эти системы экспрессии клеток свободным и может быть использован в диагностических и белковых приложений характеризации таких как микро наборов 30. Популярные клеточные линии HeLa наиболее широко используются для проведения экспрессию белков 33. Эндоплазматическая сеть в клеточных линиях HeLa недоразвита, что приводит к отсутствию посттрансляционная гликозилирования модификации активности 33. Тем не менее, эта система, как полагают, чтобы быть выгодным для синтеза белка Plasmodium, как плазмодий также не гликозилирования после модификации перевода 29. Свободный протокол транскрипции-трансляции HeLa клетки легко выполнить, недорогой и белки могут быть экспрессированы в течение 90 мин, готова для очистки и далее вниз по течению приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка паразита клеточных культур, Сборник Parasite Пеллеты
- Подготовка RPMI-1640-HEPES носитель добавлением 10 г RPMI-1640 порошка, 66 мг гентамицина сульфата, 2 г бикарбоната натрия, 5,9 г HEPES буфера, 50 мг гипоксантина и 3,8 г декстрозы в 1 л стерильной дН 2 О. Смешайте не с помощью таблицы магнитной мешалки, пока все не растворится в порошковых 1 л дистиллированной воды. Выполните микро фильтрацию массовой информации, использующих 0,22 мкм фильтр. Храните носители в стерильные бутылки.
- Вымойте заражения сифилисом (свежие) типа А + эритроциты, используя RPMI. Подготовьте 5% гематокрита эритроцитов (0,5 мл промытых свежих эритроцитов в 9,5 мл 10% RPMI + сыворотке крови человека).
- Сделайте 15% человеческого сывороточного + RPMI (15 мл сыворотки крови человека и 85 мл RPMI), чтобы начать выращивание паразитов. Сделайте 10% человек сыворотки и RPMI (10 мл сыворотки крови человека и 90 мл RPMI), чтобы продолжить культивирование паразитов в эритроцитах.
- Культура П. тропической (3D7 и ФКР-3 штамма) по типуA + эритроциты человека в 5% гематокрита и 20% паразитемии в чашке Петри или культуральной колбе 75 см 3. Поддерживать культуру в пробирке в соответствии с методом Träger и Дженсен свечи банку 26. С другой стороны, поддерживать культуры в термостате при 37 ° С поддержание 9,5% CO 2, и 3,4% N 2 газа. Культура П. тропической в RPMI 1640-HEPES, дополненной 10% сыворотки человека.
- Синхронизация P. тропической культуры с добавлением 65% Percoll (65 мл перколлом + 35 мл RPMI-1640 без сыворотки человека) в культуре концентрата 27.
- Центрифуга культуры концентрата с перколлом при 2500 х г в течение 5 мин, что приводит к 3-х слоев. Осторожно, с помощью пипетки передачи изолировать шизонты из среднего слоя в передаче отдельную пробирку в асептических условиях 27.
- Промыть выделенных культур с 10% человеческой сыворотки + RPMI-1640 в два раза, чтобы удалить избыток перколлом центрифугированием при 7500 х г в течение 5 мин. ДиSCard супернатант каждый раз в асептических условиях 27.
- Продолжить культивирование синхронизированный P. Falciparum шизонты в 10% человеческой сыворотки + RPMI-1640 27.
- Сбор шизонты обработкой Plasmodium -infected эритроциты 10 мМ Трис, рН 8,8 и центрифугированием при 15000 х г в течение 15 мин 23. Магазин паразитов гранулы при -70 ° С после добавления 5 мкл ингибитора протеазы (апротинин) в гранулах. Используйте паразитов гранулы для извлечения белка, выделения геномной ДНК и РНК изоляции.
2. Подготовка вектор плазмиды
- Изолировать от геномной ДНК P. тропической шизонт гранулы, полученные из культур примерно 20% паразитемии.
- Добавить 600 мкл 10 мМ Трис-HCl рН 7,6, 50 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,1% SDS и 1 мг / мл протеиназы К, чтобы гранулы в микроцентрифужных трубки, гомогенизации осадка с использованием 1 мл шприц, присоединенный к игле 26 г. Альтернативный заполнения шприцас гранул смеси и опорожнения в микроцентрифужных трубки 20 раз. Выдержите трубки, содержащей гомогенат O / N в С на водяной бане 50 °.
- Выполнение фенол - хлороформ (Р + С) экстракции добавлением 600 мкл P + C (300 мкл фенола и 300 мкл хлороформа) к гомогенизированной гранул. Крышка трубки плотно и встряхнуть смесь энергично обращения конец-в-конец трубки. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 2 мин и собирают верхнюю водного раствора с помощью микропипетки в новую пробирку микроцентрифужных. Повторите этот шаг дважды.
- Добавить 600 мкл хлороформа к водному слою в новую пробирку с шага 2.1.2. Vortex трубку в течение 10 сек и центрифуге при 14000 х г в течение 2 мин. Измерить верхний водный слой с помощью микропипетки и перенести его на новой трубки микроцентрифужных.
- Добавить 0,1 об ацетата рН 5 М натрий 5,5 и 1 об изопропанола (если водный слой составляет 300 мкл добавить 30 мкл ацетата рН 5 М натрия 5,5 + 330 мкл изопропанола) к водному яйцекладкиэ с шага 2.1.3. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 10 мин для осаждения осадка ДНК. Жидкость над осадком сливают и мыть гранул с 100 мкл 70% этанола (70 мкл этанола и 30 мкл дН 2 O), чтобы удалить избыток соли из ДНК. Магазин ДНК в 50 мкл дН 2 O при -20 ° С.
- Конструкция прямого и обратного праймеров с использованием программного обеспечения или вручную для амплификации P. Falciparum гены PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 и PF3D7_0114100 ранее определены в протеома исследований 16,18 с соответствующими сайтами рестрикции чтобы позволить клонирование последовательностей генов в нескольких клонирования сайтов выражение плазмиды pT7CFE1-Chis, как показано в таблице 2.
- Делают 50 мкл реакционной смеси путем добавления; 5 мкл выделенной P. тропической геномной ДНК, 5 мкл 10х буфера, 5 мкл MgCl 2, 1,5 мкл прямого праймера, 1,5 мклобратный праймер, 0,5 мкл ДНК-полимеразы Т7 и 31,5 мкл дН 2 O и выполнения полимеразной цепной реакции (ПЦР) при 94 ° С в течение 8 мин для денатурации, 50 ° С в течение 1 мин 30 сек для расширения и 72 ° С в течение 9 мин для отжига и ренатурации амплификации генов, приведенных в таблице 1.
- Отдельные продукты ПЦР на 1% агарозном геле (1 г агарозы и 100 мл Трис ацетата ЭДТА (ТАЕ буфера)) 32.
- Нарезать ПЦР-амплификации полосы ДНК из агарозного геля, разместить ломтики гель, содержащий ДНК в геле ДНК извлечения спин колонки и заморозить при -20 ° С в течение 5 мин. Добавьте 100 мкл изопропанола, замороженных срезах геля и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин.
- Измерьте водный поток-через фильтрованную в пробирку с шагом 2,5, используя микропипетку и передать в новую пробирку. Добавить 0,1 об из 5 М ацетата натрия и центрифугируют при 14000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и добавить 10 мкл дН 2 O в гое ДНК осадок.
- Дайджест вектор экспрессии pT7CFE1-Chis и фрагменты очищенной ДНК (от 2.6) в двух отдельных труб, добавив 3 мкл плазмиды и 5 мкл генных продуктов ПЦР в каждую пробирку. Добавить в каждую пробирку, 1 мкл специфических рестрикционных ферментов, 2 мкл реакционного буфера и 14 мкл дН 2 O.
- Добавить 3 мкл переваренной плазмидой 5 мкл переваренной ДНК-фрагментов, 2 мкл 10х буфера лигазы, 1 мкл лигазы и 9 мкл дН 2 O в микроцентрифужных трубки. Выдержите в 12 ° CO / N.
- Добавить 0,1 об 3 М ацетата натрия при рН 5,5 и 2 объемами этанола (если объем реакционной трубки 20 мкл добавляют по 2 мкл 3 М ацетата натрия + 44 мкл этанола) к трубе с шагом 2.14. Хорошо перемешать и инкубировать при температуре -20 ° С в течение 15 мин.
- Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 15 мин. Осторожно удалите супернатант, используя микро пипетки, не нарушая гранул.
- Добавить 100 мкл 70% этанола тО гранулы со стадии 2.10. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 5 мин. Снимите и выбросьте супернатант. Добавить 10 мкл нуклеазы без воды к осадку ДНК.
3. Экспрессия белка, используя в пробирке клеток человека свободу выражения системе
- Готовят 20 мкл смеси транскрипции путем измерения 2 мкл рекомбинантного pT7CFE1-Chis плазмидной ДНК, 4 мкл 5х буфера транскрипции, 4 мкл смеси NTP, 2 мкл РНК-полимеразы Т7 и 8 мкл нуклеазы без воды в течение 2-шага человек в Vitro экспрессии белка, используя шаблоны ДНК. Смешайте компоненты в микроцентрифужных трубки и инкубировать в течение 75 мин при 30 ° С на водяной бане.
- Возьмите 2 мкл транскрипции смеси и добавить его в 23 мкл смеси, содержащей перевода 12,5 мкл лизата клеток HeLa, 2,5 мкл вспомогательных белков, 1 мкл солевого раствора А, 0,5 мкл аминокислот -Met, 0,5 мкл аминокислот -Leu, 181; л ингибитора РНКазы, 1,25 мкл энергобалансе и 3,75 мкл нуклеазы без воды.
- Инкубируйте перевода смеси со стадии 3.2 при 30 ° С в течение 90 мин. Магазин переведен продуктов при -20 ° С.
- Готовят 25 мкл транскрипции и трансляции смеси путем добавления 3 мкл рекомбинантного pT7CFE1-Chis плазмидной ДНК, 2 мкл нуклеазы без воды, 5 мкл реакционной смеси, 12,5 мкл лизата HeLa и 2,5 мкл вспомогательных белков на 1-шага человек сочетании ИВТ Экспрессия белка для шаблонов ДНК.
- Инкубируйте реакционной смеси, полученной на стадии 3.4 в течение 90 мин до 6 ч при 30 ° С. Храните продукты при температуре от -20 перевода ° С.
4. Очистка выраженных рекомбинантных белков
- Добавить 75 мкл буфера 1x очистки до 25 мкл перевод продукта, чтобы сделать 100 мкл смеси очистки.
- Добавить 100 мкл никель хелатообразующей смолы до 100 мкл очистки микстЮр. Промыть Ni-смолы в два раза путем добавления 300 мкл дН 2 O и 300 мкл буфера для связывания. Повторное приостановить смолы и центрифуги при 14000 мкг в течение 1 мин для удаления избытка этанола.
- Добавить 100 мкл смеси очистки от шага 4.2 к 100 мкл никелевой хелатирующих смол и инкубируют смесь в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга смеси при 14000 х г в течение 1 мин и собирают супернатант в свежую пробирку как "течь через".
- Промыть смолу со 100 мкл 1х промывочным буфером (20 мМ имидазола, 250 мМ NaH 2 PO 4 при рН 8, 2,5 М NaCl и дН 2 O). Центрифуга при 14000 мкг в течение 1 мин и собрать супернатант в новую пробирку с надписью "мыть". Повторите шаг 4,5 раза.
- Добавить 100 мкл буфера для элюции 1x (100 мМ имидазол, 250 мМ Na 2 PO 4 при рН 8,0, 2,5 М NaCl, и дН 2 O) к смоле и инкубируют в течение 15 мин. Центрифуга при 14000 мкг в течение 1 мин. Сделайте шаг элюирования в два раза. КаждыйВремя собирать супернатант в новые микропробирок и метки как «элюата".
- После элюирования, мыть смолы в два раза, как описано в шаге 4.5. Магазин течь через, моет и образцы элюции при -20 ° С или ниже. Смола должна храниться при температуре 4 ° С. Использование 30 мкл каждого образца для SDS-PAGE и иммуноблоттинга анализа.
5. Кумасси (Bradford) анализа белка 34
- Подготовка стандарт бычьего сывороточного альбумина (BSA решения) с концентрацией 20 мкг / мл (смесь 10 мкл BSA (2 мг / мл) и 90 мкл дН 2 O), 40 мкг / мл (смесь 20 мкл BSA (2 мг / мл) и 80 мкл дН 2 O), 60 мкг / мл (смешать 30 мкл BSA (2 мг / мл) и 70 мкл дН 2 O), 80 мкг / мл (смесь 40 мкл BSA (2 мг / мл) и 60 мкл дН 2 O), 100 мкг / мл (смесь 50 мкл BSA (2 мг / мл) и 50 мкл дН 2 O), 160 мкг / мл (смесь 80 мкл BSA (2 мг / мл) и 20 мкл дН2 O) и 200 мкг / мл (по 100 мкл BSA (2 мг / мл).
- Мера 5 мкл потока через, моет и элюата образцов с этапа 4.7. Добавить 95 мкл дН 2 O.
- Добавляют 5 мл кумасси синим реагента к смеси из шагов 5.1 и 5.2. Покрытие трубы с парафином и вихря в течение 10 сек затем инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Использование спектрофотометра измерения оптической плотности (OD) при длине волны 650 нм для белка труб из шага 5.3. Концентрация земля против OD чтения, чтобы определить концентрации протеина 34.
6. Вестерн блот
- Добавьте 5 мкл шизонтами выписок из P. тропической, 2 мкл кишечной палочки экспрессируемого рекомбинантного Rhop-3 белкам 31, 5 мкл рекомбинантных белков выражается с помощью 2-х ступенчатый и 1-шаг в пробирке систем экспрессии человека и 10 мкл белковых продуктов очищали с использованием метода сродства к отдельные пробирки. Добавить электрофореза буфера, содержащего меркаптоэтанол в каждую пробирку для конечного объема 20 мкл, чтобы растворенные образцы белка. Варить трубы в течение 2 мин.
- Загрузка растворенные образцы белка на 10% ПААГ с ДСН, чтобы отделить белки.
- Перевести разделенных белков из гелей SDS-PAGE на нитроцеллюлозные бумаги (NCP) в электрофореза в 35 мА на гель в полусухого блоттинга западной камере в течение 2 ч.
- Блок НКТ после переноса с 2% обезжиренного молока.
- Инкубировать их НКП со следующими поликлональных антител разводили 1: 100 в 2% молока для выполнения вестерн-блоттинга; кролика антитела # 676 21 специфичны для P. Falciparum мерозоитам rhoptries, мыши антитела, специфичные для 20 P. yoelii и П. berghei мерозоитам rhoptries, антисыворотки # 685, специфичные к P. тропической паразитофорной белок вакуоли, сыворотки (серин богатые антиген) 22 и антитела, специфичные для Maurer217; s расщелина белок PFMC-2TM 28.
- Выдержите НКП также в 1: 100 разбавленные нормальные мыши и кролика в сыворотке и провел супернатанта культуры (СКС) с клетками миеломы SP2 в качестве отрицательных контролей.
- Выдержите НКП с антителами и управления при 4 ºC O / N.
- Промыть НКТ 4x с Тех буфер и инкубировать с НКП видов конкретных вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP), разбавленный 1: 1000 в 2% молока.
- Вымойте НКТ 4x с Клякса буфера. Инкубировать промывали НКП с раствором проявления цвета A + B (Раствор A: добавить 50 мл 1x Тех буфер и 30 мкл H 2 O 2; Раствор B: добавить 10 мл метанола и 30 мг 3-хлор-нафтола) в течение 30 мин в темноте. Анализ результатов западные блот колориметрическим.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Проверка выраженных рекомбинантных белков через реактивности со специфическими антителами является важным первым шагом в подтверждении надлежащего складывание выраженных белков. Были выражены рекомбинантные белки малярийные помощью один шаг и два шага в пробирке бесплатных систем экспрессии клеток человека. Рекомбинантные белки очищают методом Ni-хелатный сродства. Затем мы использовали антисыворотки против целых мерозоитов rhoptries в западной блоттинга SDS-PAGE разделенных рекомбинантных белков.
На рисунке 1 показана ПЦР-амплификации фрагментов генов PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 и PF3D7_1436300 в 1% агарозном геле. Полосы ДНК вырезали и ДНК очищают путем замораживания в ДНК добыча Спин колонке.
Гены малярии успешно усиленные (показанные в таблице 2) с геномной ДНК клонировали в векторе экспрессии pT7CFE-Chis. Re-амплификации генов с RECOmbinant плазмиды продемонстрировали наличие клонированных фрагментов гена в векторе. Блок-схема системы экспрессии, используемых для трансляции белка показана на рисунке 2. 2А и 2В показан этап мудрое процедуру 2-шага в пробирке свободного системы экспрессии клеток человека и IVT в сочетании системы перевода 1-ступенчатой. Успешное выражение Plasmodium белков с использованием в пробирке системы свободного выражения человеком клеток была подтверждена rhoptry конкретной кроличьей антисыворотки. Как показано на фигуре 3А, рекомбинантные белки были признаны rhoptry конкретных кроличьей антисыворотки # 676. Как было показано ранее, выраженные рекомбинантные белки не были признаны антисыворотки против паразитофорной вакуоли белков из P. тропической и П. yoelii демонстрируя специфику кроличьей антисыворотки против 676 выраженными белков 32. Нормальной кроличьей сыворотки (NRS) не реагируют с рекомбинантными белкамипересчитываются с использованием 2-шаг в пробирке системы свободного выражения человеческих клеток и 1-ступенчатой IVT сочетании системы перевода (Рис 3В). Успешный выражение Plasmodium рекомбинантных белков была подтверждена различными методами, например, в геле гистидин окрашивания и никель-HRP окрашивания 32. Выраженные белки очищали с помощью аффинной очистки системы. Очистка осуществляется в методе партии (столбцы не используется). Методика оптимизирована путем изменения концентрации имидазола от 60 до 100 мм. Оптимальная концентрация для элюирования 250 мм. Рисунок 4 показывает успешное очищение переведенных белков из 25 мкл переведенных белковых продуктов. 4А показывает успешное очищение волчьей трансмембранного белка Маурера 18. 4В показывает успешную очистку PF3D7_0925900, P. тропической ортолог Plasmodium yoelii гена PY17X_0830000, вгипотетический белок 32. Рисунок 4C показывает успешную очистку броненосцев повторов, содержащих белок PY17X_1139200, гипотетический белок с использованием никель гранул смолы и 100 мМ имидазола в буфере 1x элюирования. Выход белка после очистки составляет 3,5 мкг / 25 мкл.
Рисунок 1. Усиление P. тропической и П. yoelii гены. 1% агарозном геле, показывая этидийбромида окрашенные продукты ПЦР генных фрагментов PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 и PFA0680cw усиленных из P. тропической геномной ДНК.
Рисунок 2. Блок-схема HeLa барельеф бесплатно система экспрессии клеток ред. Схематическое представление как 2 шага и 1-шаг в пробирке систем свободы выражения человеческой клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. иммуноблоттинга подтверждение экспрессии белка. Вестерн-блот-анализ, выраженных с использованием рекомбинантных белков в целом rhoptry конкретный кролика антисыворотки # 676 и нормальной кроличьей сыворотки. (А) Реакционная способность антисыворотки 676 с выраженными рекомбинантных белков. (В) нормальной кроличьей сыворотки не реагировали с выраженными рекомбинантных белков. Паразитофорной белок вакуоли не реагируют с рекомбинантными белками 32.hres.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Очистка белков от микро объемов перевода продукта. Очистка рекомбинантных белков, выраженных с использованием никель хелатных метод смолы сродства. Экспрессированных белков (перевод) (А) PF3D7_0114100, (Б) PY17X_0830000, и (с) PY17X_1139200 белки инкубировали с никель - хелатирующие смолы очищают с никелем хелатирующих смол в отсутствие имидазола в буфере для связывания и очистки буфера. После инкубации гранулы центрифугируют, несвязанных белков были отделены и гранулы промывают дважды в промывочном буфере. Связанные рекомбинантные белки элюировали в два раза с последующей промывкой шариков. Перевод белки, моет, элюаты и бусысолюбилизировали в буфере выборки электрофореза. Имидазол был использован при стирке (20 мМ имидазола) и элюирование (100 мМ имидазол) буферов. Сыворотки # 676 успешно признан выражены и очищенные рекомбинантные белки. Нормальный кролик сыворотки не реагируют с выраженными белков, как показано на рисунке 3B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Особенности | Система экспрессии клеток человека-Free | Зародышей пшеницы без клеток система экспрессии | Кролик система экспрессии ретикулоцитов | E.coli лизат система экспрессии белка |
| Время | Совершено транскрипцию и перевод в 3 часа | Транскрипция в течение 6 ч и перевод в течение 10 - 20 часов | РНК должна быть выделена перевод занимает 90 мин | Доне в 1 час |
| Подходит вектор | Т7 вектор может быть | SP6 вектор | Т7 можно использовать | Т7 можно использовать |
| Подходит масштаб | Подходит для лабораторного синтеза | Используется для синтеза крупномасштабных белка | Подходит для лабораторных и иммунизации исследований | Подходит для лабораторных и иммунизации исследований |
| Экстракт | Бесплатные экстракты HeLa клеток | Зародыш пшеницы экстрактами | Ретикулоцитов клеточные экстракты | E.coli, клеточных лизатов экстракты |
| Модификация | Со-поступательное и после трансляционной модификации | Сообщение трансляционной модификации | Со-трансляционной модификации | Посттрансляционной модификации |
| Размер белка перевод | 8 кДа до 250 кДа | 220 кДа | 250 кДа | <TD> 200 кДа|
| Оптимизация кодонов | Плотно | Плотно | Свободный | Плотно |
| Формирование дисульфида облигаций | Да | Да | Нет | Да |
| Уступать | Низкая доходность | Высокий выход | Низкая доходность | Очень высокая урожайность |
| Стоимость | $ 130.00 в течение 10 реакций | $ 173.00 в течение 10 реакций | $ 136.00 в течение 5 реакций | $ 159.00 на 8 реакций |
| Концентрация белка | От 3 до 5 мкг на реакцию | 100 мкг / мл | 100 мкг / мл | 500 мкг / мл |
| Ссылки | 32, 30 | 7, 28, 29 | 7 | 7, 24, 25 |
Таблица 1. Сотовые системы свободы слова в малярийной исследований. Сравнение клеткиБесплатные системы экспрессии в настоящее время используется в малярийной исследований.
| Джин ID | Ортолог ID | Белок | Праймера для ПЦР |
| PF3D7_1436300 | Транслокон компонент | CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG | |
| GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC | |||
| PF3D7_0114100 | Расщелина белок PFMC-2Tm Маурера | GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA | |
| CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA | |||
| PY17X_0830000 | PF3D7_0925900 | Гипотетический белок | GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA |
| CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60; | |||
| PY17X_1139200 | PF3D7_1361800 | Гипотетический белок | GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA |
| CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT |
Таблица 2. Rhoptry гены в исследовании. Праймеры различных генов, экспрессируемых в этом исследовании 19.
| Название материала | Компания | Номер по каталогу | Описание |
| 2 шаг в системе 32 Свободное выражение пробирке клеток человека | Thermo Fisher | 88856 | Снято. Всегда храните при температуре -80 ° C. Не оттаивать в теплой воде. |
| 1-шаг в пробирке в сочетании системы перевода | Thermo Fisher | 88860 | Всегда храните при температуре -80 ° C. Не гоAW в теплой воде. |
Клеточные основе свободных системы экспрессии Таблица 3. Hela. Наборы, используемые для экспрессии белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важные шаги для успешного экспрессии белков с использованием двух шаг в пробирке свободного системы экспрессии клеток человека и очистки: 1) успешной амплификации и клонированию генов в pT7CFE-Chis плазмидного вектора; 2) расшифровки РНК на 30 ° С; 3) перевод белка при 30 ° С в присутствии ингибитора рибонуклеазы; 4) разрабатывает протокол аффинной очистки на основе смолы с использованием шарики, покрытые Ni и 5) анализ результатов вестерн-блоттинга на использованием поликлональных и моноклональных антител. Важными шагами для успешного экспрессии белков с использованием один шаг IVT системы в сочетании перевод белка являются: 1) усиление успешно и клонирование генов в pT7CFE-Chis плазмиды вектора; 2) Транскрипция и перевод белков при 30 ° С; 3) разрабатывает протокол аффинной очистки на основе смолы с использованием шарики, покрытые Ni и 4) анализ результатов вестерн-блоттинга на использованием поликлональных и моноклональных антител.
ТекущийLY, бесплатные системы экспрессии клеток используются для экспрессии рекомбинантных белков малярии. Критические особенности систем бесплатно экспрессии клеток, чтобы выразить малярии белки это способность декодировать у богатых генами, отсутствие длительного поступательного паузы, успешного выражения повторяющихся аминокислотных последовательностей, отсутствие механизмов гликозилирования и способности плазмид для контроля гена усечение. В этом исследовании мы демонстрируем использование двухступенчатой в пробирке системы свободного выражения человеком 32 клеток и через IVT сочетании систем перевода один шаг для выражения P. Falciparum генные ортологи P. yoelii гены мерозоитов rhoptry, как показано в таблице 1. протокол очистки был разработан и оптимизирован для очистки микро-объемов рекомбинантных белков, полученных из 1-шага и 2-шага в пробирке свободных системах экспрессии клеток человеческого. 4 П. Falciparum гены, PF3D7_0114100 трансмембранный белок, гидрофобный прогнозируемое гипотетический повторения ARMбелок PF3D7_1361800 и гидрофильные белок PF3D7_0925900, были выражены с использованием 2-шаг и 1-шаг в пробирке системы свободного выражения человеком клеток. Очищенные выходы белка были определены. Белок PFMC-2TM был включен в этих исследованиях, потому что это интегральный мембранный белок с двумя трансмембранных доменов, и мы были заинтересованы в определении, может ли в пробирке система выражения, правильно выразить трансмембранный белок и позволяют для простоты очистки.
Основное различие в обоих системах на один шаг и два шага экспрессии является то, что система двухэтапного выражение мРНК зависит от системы, в которых необходим стабильный мРНК транскрибируется и к реакционной смеси добавляли перевода. В противоположность этому, один шаг в пробирке в сочетании транскрипции / Система перевода включает непрерывную подачу транскрипции и мРНК с последующим совместным переводе белка в процессе реакции. И 1-шаг ИВТ транскрипции / перевод в сочетании адресСистема Xpression и 2-шаг в пробирке системы свободного выражения клеток человека тестировали на экспрессию белков высокой молекулярной массой. Обе системы были успешными в выражении низкомолекулярные рекомбинантных белков. В системе 1-ступенчатой экспрессии, наблюдалось перекрестной реактивности антител с белками в реакционной смеси перевод. Конкретные белки пересечь реагирующие с антителами неизвестны и требуют дальнейшего изучения. Выражение высокомолекулярных белков была неудачной с использованием как 1-шаг и 2-ступенчатых систем. Протокол очистки был разработан для очистки микрообъемах рекомбинантных белков различными свойствами растворимости выражается с помощью как 1-шаг и 2-шаг в пробирке бесплатных систем экспрессии клеток человека. Белки были очищены и успешно Выход составляет 3,5 мкг на 25 мкл при экспрессии с использованием 2-шаг в пробирке системы трансляции белка и 1,5 мкг на 25 мкл при переводе с 1-я шагаVT система экспрессии белка. Выражение низкомолекулярных белков колеблется от 18 кДа до 37 кДа является воспроизводимой и прямо вперед. Тем не менее, выражение высокой молекулярной массой приводит в белковых укорочения. Из-за полученных микрообъемах для клонированной ДНК, ПЦР-амплификации использовали для проверки клонировали продуктов. Потенциальные препятствия для выражения высоких рные протеины, используя бесплатные системы экспрессии клеток может быть постоянным фосфорилирования eIF2 альфа-субъединицы из-за высокой концентрации АТФ в реакции. Это ухудшает инициации трансляции в системе, которые потенциально влияет на удлинение синтеза белка в процессе синтеза больших белков в системах экспрессии клеток свободно 10.
Протокол, описанный здесь без влияния условий оптимизации для экспрессии белков. Ни генные кодоны ни плазмида не были оптимизированы для экспрессии белков, и белки повторной укладки не требуется. Эта система выражает рroteins в 3 ч и очистки белка могут быть получены в 2 ч, что позволяет далее вниз по течению приложений, таких как обработка рекомбинантного белка для иммунизации или пептидной последовательности. Несколько рекомбинантные белки могут быть экспрессированы при свободном системы HeLa клеток, используя форматы микрочипов для иммунной сыворотки скрининга и идентификации потенциальных молекул-кандидатов вакцины. Кроме того, потенциально иммуногенные белки могут быть идентифицированы с помощью экранов и выбрано белки, полученные путем расширения выражение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-step in vitro human cell free expression system | Thermo Fisher | 88856 | Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water |
| 1-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at RT |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4 °C. |
References
- Alexandrov, K., et al.
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A.
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y.
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
