Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

HeLa Basert Cell ytringsfrihet Systemer for Expression of Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

Uttrykk for malaria proteiner i cellebaserte systemer er fortsatt utfordrende. Vi viser to trinn og ett skritt IVT (in vitro oversettelse) celle gratis ekspresjonssystemer for å uttrykke malaria rekombinante rhoptry proteiner fra HeLa-celler. Vi bruker et Ni-resin affinitet baserte rensesystem for å rense rhoptry proteiner.

Abstract

Malaria forårsaker betydelig global sykelighet og dødelighet. Ingen rutine vaksine er tilgjengelig for øyeblikket. En av de viktigste årsakene til mangelen på en vaksine er utfordringen med å finne egnede vaksinekandidater. Malaria proteiner uttrykkes ved hjelp av prokaryote og eukaryote cellebasert ekspresjonssystemer er dårlig glykosylert, generelt uløselig og gjennomgå uriktig folding fører til redusert immunogenisitet. De hvetekim, kanin retikulocyttlysat og Escherichia coli lysat celle ytringsfrihet systemer brukes i dag for uttrykk av malaria proteiner. Men lengden av uttrykket tid og uriktig glykosylering av proteiner forblir fortsatt en utfordring. Vi demonstrerer uttrykk for Plasmodium proteiner in vitro bruker HeLa basert celle gratis ekspresjonssystemer, kalt "in vitro humane celle gratis ekspresjonssystemer". De to HeLa basert celle gratis ekspresjonssystemer transkribere mRNA i 75 min og 3 pl transcribed mRNA er tilstrekkelig til å oversette proteiner i 90 min. Den en-trinns-ekspresjonssystem er en transkripsjon og translasjon koplet ekspresjonssystem; transkripsjonen og co-oversettelse skjer i 3 timer. Fremgangsmåten kan også utvides i 6 timer ved å tilveiebringe ytterligere energi. I to-trinns-ekspresjonssystem blir transkribert mRNA først og deretter tilsettes til blandingen oversettelsen for proteinekspresjon. Vi beskriver hvordan å uttrykke malaria proteiner; en hydrofob PF3D7_0114100 Maurer er Cleft - to trans (PfMC-2TM) protein, en hydrofil PF3D7_0925900 protein og en armadillo gjentar inneholder protein PF3D7_1361800, ved hjelp av HeLa basert celle ytringsfrihet system. Proteinene uttrykt i mikrovolumene som anvender to-trinns og en-trinns uttrykk strategier. En affinitetsrensing metode for å rense 25 ul av proteiner uttrykt ved hjelp av in vitro human cellefritt ekspresjonssystem er også beskrevet. Protein utbytte bestemmes av Bradford assay og uttrykteog rensede proteiner kan bli bekreftet ved western-blotting-analyse. Uttrykte, rekombinante proteiner kan bli brukt for immuniseringer, immunologiske analyser og proteinsekvensering.

Introduction

I malaria forskning, ekspresjon av immunogene proteiner ved anvendelse av prokaryote eller eukaryote cellebaserte systemer er fortsatt en utfordring. AT rikdom av Plasmodium genomet og ukjente posttranslasjonell mekanismer 14,7, bidra til vanskelighetene forbundet med å skaffe riktig brettet og immunogeniske proteiner for antistoffproduksjon og vaksinestudier. Prokaryote systemer, for eksempel Escherichia coli er blitt anvendt for rekombinant proteinekspresjon. Prokaryote systemer er rimelig, effektivt produsere høye utbytter av rekombinante proteiner og har flere Kloningsvektorene. Verts E. coli-celler er lett å omforme og celler vokse raskt. Men prokaryote systemer har begrensninger, for eksempel mangel aminosyresubstitusjon, post-translasjonell modifikasjon, risiko for forurensning, heterogene produkter og akkumulering av rekombinante proteiner i inklusjonslegemer 24 av.

I enstudie av Mehlin et al. (2006), ble 1000 åpne leserammer (ORF) uttrykt. Ca 7% av de uttrykte proteiner ble 14 løselige. Uoppløseligheten observerte skyldes forspent arten av genene og den høye frekvensen av kodoner som benyttes ideelt sett av Plasmodium AT-rike genom 14. En alternativ strategi for å overvinne dette problemet har blitt utviklet ved hjelp av plasmider eller vertsceller som inneholder tRNA som gjenkjenner sjeldne kodoner eller kodonene som svarer til tre frekvensene. Selv etter å ha utført disse optimaliseringer, er svært små deler av proteiner uttrykt som løselig, aktiv og immunogent 14. De cellefrie ekspresjonssystemer inneholder alle de komponenter som er nødvendige for transkripsjon og translasjon, slik som ribosomer, initiering faktorer, forlengelse faktorer (oversettelser faktorer), tRNA og aminoacyl-tRNA syntetaser. Både transkripsjons- og translasjonselementer reaksjoner er koplet i ett-trinns prosedyre 11,29. Den transcription Reaksjonen utføres i et rør før passende mengde av mRNA blir inkubert med oversettelse maskineri i et annet rør 11,29. Selv om disse metodene har lykkes i Plasmodium sp. Proteinekspresjon, er en stor ulempe hvor lang tid for proteinekspresjon, som er ca. 22 timer 29. I tillegg er den høye kostnaden av forbruksvarer for inkludering i protokollene 29, er arbeidskrevende forberedelser av cellelysatet og inkonsistens i komponent preparater, gjør disse systemene uoppnåelig. Hovedfokus for forskere for utvikling av en celle ytringsfrihet system er avhengig av faktorer som for eksempel rask genmodifisering, raske avlinger med høye konsentrasjoner og rett frem lysat forberedelser 1.

Eukaryote systemer slik som gjær, pattedyrcellelinjer, baculovirus mediert ekspresjonssystem, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum og parasitt ekspresjonssystemer such som Leishmania har blitt brukt for rekombinant protein uttrykk 7. Eukaryote systemer dele fylogenetisk forhold og derfor også dele egenskaper som glykosylering, Acyleringen, disulfidbindingen formasjon, anstand samhandling, proteolyse og sub-cellulære compartmentalization. Proteinsekresjon hendelser i eukaryoter hindre opphopning og reduserer giftighet for ekspresjonssystemer 13. Bruken av gjærsystemer er foretrukket som de er egnet for protein ekspresjon i stor skala, og for å oppnå høye utbytter 4. To P. falciparum proteiner PfCP-29 og Pvs25 ble produsert ved hjelp av gjær system 4. Imidlertid er en stor ulempe i syntesen av de fleste av proteinene var uregelmessige N- og O-glykosyleringsmønstre, uriktig folding og avkutting av proteiner fra deres native form 4.

Bruken av pattedyrceller for syntese av rekombinante proteiner er arbeidskrevende og den er kostbarSive å opprettholde stabile rekombinante cellelinjer 4. Derfor har pattedyrceller vært begrenset til analyse av protein signalisering, protein interaksjoner og parasitt-vert interaksjoner og også for testing av DNA-vaksiner 4. The Human DNA og mRNA in vitro protein ekspresjon cellefritt system som her er beskrevet er et HeLa celle-avledet pattedyr-basert system som uttrykker proteiner i 3 timer. Proteiner uttrykt ved hjelp pT7CFE1-Chis Ekspresjonsvektor har en C-terminal tag tilrettelegging identifisering og rensing. Den HeLa baserte systemet er supplert med translasjonsinitiering faktorer og en oversettelse regulator, og dermed øke effektiviteten til translasjonssystem. Proteiner kan raskt oversettes, screenet, verifisert og bearbeides for bruk i ulike immunologiske og strukturelle applikasjoner 15.

Eukaryote cellefrie ekspresjonssystemer så som hvetespirer og kanin retikulocytt er for tiden anvendt for ekspresjon av Various eukaryote proteiner inkludert Plasmodium proteiner 11,29. I tillegg E. coli-baserte cellefrie systemer er også anvendes for eukaryot protein ekspresjon 11. Tabell 1 oppsummerer forskjellige cellefritt ekspresjonssystemer ved å sammenligne trekk ved de systemer så vel som den enkle å bruke systemer for proteinekspresjon. Den humane cellefrie system i forhold til de andre, har evnen til å utføre post og co-translasjonelle modifikasjoner, og er mindre kostbart. Kodon optimalisering er mulig, og alle reaksjonene kan utføres i 3 timer. HeLa-systemet er et ideelt system for oversettelse proteinsyntese i laboratoriet omgivelser.

En stor fordel med humane celle fri ekspresjonssystemer enn andre cellefrie systemer er tilgjengeligheten av flere forskjellige cellelinjer avledet fra forskjellige organer og vev. Flere varianter av cellefrie systemer kan utformes avhengig av cellelinjen. Ekstraktets avledet fra pattedyrceller har høyere effektivitet for å syntetisere store proteiner enn noen andre celle gratis ekspresjonssystemer. Disse celle ytringsfrihet systemer kan også brukes i diagnostiske og protein karakterisering applikasjoner som mikro arrays 30. Den populære HeLa-cellelinjer som er mest brukt til å utføre ekspresjonen av proteiner 33. Det endoplasmatiske retikulum i HeLa cellelinjer er underutviklet, som fører til fravær av post-translasjonell modifikasjon glykosylering aktivitet 33. Imidlertid er dette systemet antas å være fordelaktig for Plasmodium proteinsyntese som Plasmodium også mangler glykosylering stolpe oversettelses modifisering 29. Den HeLa cellefrie transkripsjons-translation protokoll er enkel å utføre, billig og proteiner kan uttrykkes i 90 min, klar for rensing og videre nedstrøms applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av parasitt cellekulturer, Innsamling av Parasite Pellets

  1. Forbered RPMI-1640-Hepes media ved å tilsette 10 g av RPMI-1640-pulver, 66 mg gentamycin sulfat, 2 g natriumbikarbonat, 5,9 g HEPES-buffer, 50 mg hypoxantin og 3,8 g dekstrose i 1 liter sterilt dH 2 O. Bland bruker tabellen magnetrører til alt pulveret er oppløst i en L destillert vann. Utføre mikro filtrering av medier med 0,22 mikrometer filter. Oppbevar media i sterile flasker.
  2. Vask uinfiserte (frisk) type A + erytrocytter ved hjelp RPMI. Forbered 5% hematokritt av erytrocytter (0.5 ml vasket friske erytrocytter i 9,5 ml 10% RPMI + humant serum).
  3. Gjør 15% humant serum + RPMI (15 ml humant serum og 85 ml RPMI) for å initiere dyrking av parasitter. Gjør 10% humant serum og RPMI (10 ml humant serum og 90 ml RPMI) for å fortsette dyrkning av parasitter i røde blodceller.
  4. Kultur P. falciparum (3D7 og FCR-tre stammer) i typeA + humane erytrocytter ved 5% hematokritt og 20% parasitemia i petriskål eller en 75 cm 3 kultur kolbe. Oppretthold kultur in vitro i henhold til metoden for Trager og Jensen stearinlys jar 26. Alternativt opprettholde kulturer er i inkubator ved 37 ° C opprett 9,5% CO2 og 3,4% N2 gass. Kultur P. falciparum i RPMI 1640-Hepes-media supplementert med 10% humant serum.
  5. Synkron P. falciparum kultur ved tilsetning av 65% Percoll (65 ml Percoll + 35 ml RPMI-1640 uten menneskelig serum) til kulturen konsentrat 27.
  6. Sentrifuger kulturen konsentratet med Percoll® ved 2500 xg i 5 min som resulterer i tre lag. Nøye, ved hjelp av en overføring pipette isolere schizonter fra det midterste laget overføring i et eget rør under aseptiske forhold 27.
  7. Vask de isolerte kulturer med 10% humant serum + RPMI-1640 to ganger for å fjerne overskudd av Percoll ved sentrifugering ved 7500 xg i 5 min. Discard supernatanten hver gang under aseptiske forhold 27.
  8. Fortsett dyrking synkronisert P. falciparum schizonter i 10% humant serum + RPMI-1640 27.
  9. Samle schizonter ved behandling av Plasmodium -infected erytrocytter med 10 mM Tris pH 8,8 og sentrifugering ved 15 000 xg i 15 min 23. Butikk parasitt pellets ved -70 ° C etter tilsetning av 5 ul protease inhibitor (aprotinin) til pelletene. Bruk parasitt pellets for protein utvinning, genomisk DNA og RNA isolering.

2. Forbereder plasmidvektor

  1. Isolere genomisk DNA fra P. falciparum schizont pellets fremstilt fra kulturer av ca. 20% parasittemi.
  2. Legg 600 mL av 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS og 1 mg / ml proteinase K, til pellets i et mikrosentrifugerør, pellet homogeniseres ved anvendelse av en 1 ml sprøyte festet til en 26 G nål. Alternativ fylle sprøytenmed pelleten og blandingen munner ut i et mikrosentrifugerør 20 ganger. Inkuber rør inneholdende homogenat O / N i et 50 ° C vannbad.
  3. Utfør fenol - kloroform (P + C) ekstraksjon ved tilsetning av 600 ul av P + C (300 mL av fenol og 300 ul kloroform) og homogenisert pellet. Cap røret tett og rist kraftig blanding ved å vende røret ende-til-ende. Sentrifugerør ved 14 000 xg i 2 min, og samle øvre vandige løsning ved hjelp av en mikropipette inn i et nytt mikrosentrifugerør. Gjenta dette trinnet to ganger.
  4. Legg 600 mL av kloroform til det vandige sjikt i det nye røret fra trinn 2.1.2. Vortex-røret for 10 sekunder og sentrifuger ved 14.000 xg i 2 min. Mål øvre vandige lag med en mikropipette og overføre den til et nytt mikrosentrifugerør.
  5. Tilsett 0,1 vol 5 M natriumacetat pH 5,5 og 1 vol isopropanol (hvis vannlaget er 300 ul legge til 30 ul av 5 M natriumacetat pH 5,5 + 330 ul isopropanol) for å vandig layer fra trinn 2.1.3. Inkuber røret ved RT i 15 min.
  6. Sentrifuger røret ved 14.000 xg i 10 minutter for å felle ut DNA-pelleten. Kast supernatanten og vask pellet med 100 ul 70% etanol (70 mL etanol og 30 mL av dH 2 O) for å fjerne overskudd av salt fra DNA. Butikken DNA i 50 ul dH 2 O ved -20 ° C.
  7. Designe forover og bakover primere ved hjelp av programvare eller manuelt for forsterkning av P. falciparum gener PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 og PF3D7_0114100 tidligere er identifisert i proteomet 16,18 sammen med egnede restriksjonsseter for å tillate kloning av gensekvensene til de multiple kloningsseter av ekspresjonsplasmid pT7CFE1-chis som vist i tabell 2.
  8. Foreta en 50 ul reaksjonsblanding ved å tilsette; 5 mL av isolerte P. falciparum genomisk DNA, 5 ul 10X buffer, 5 ul MgCl2, 1,5 mL av forover-primer og 1,5 ulreverse primer, 0,5 ul av T7 DNA-polymerase og 31,5 ul dH 2 O og utføre en polymerasekjedereaksjon (PCR) ved 94 ° C i 8 minutter for denaturering, 50 ° C i 1 min 30 sek for forlengelse og 72 ° C i 9 min for gløding og renaturering for forsterkning av gener som er vist i tabell 1.
  9. Separate PCR-produkter på 1% agarosegel (1 g agarose og 100 ml Tris-acetat EDTA (TAE) -buffer) 32.
  10. Skjær PCR-amplifiserte DNA-bånd fra agarosegelen, plassere gelen skiver inneholdende DNA i en DNA-gel ekstraksjon spinnkolonne og fryses ved -20 ° C i 5 min. Tilsett 100 ul av isopropanol til den frosne gel skiver og sentrifuger ved 14.000 xg i 5 min.
  11. Mål vandige gjennomstrømnings filtrert i oppsamlingsrøret fra trinn 2.5, ved hjelp av en mikropipette og overføres til et nytt rør. Tilsett 0,1 vol 5 M natriumacetat og sentrifuger ved 14 000 xg i 5 min. Kast supernatanten og legge til 10 mL av dH 2 O til the DNA pellet.
  12. Fordøye pT7CFE1-chis ekspresjonsvektor og renset DNA-fragmenter fra (2.6) i to separate rør ved tilsetning av 3 ul av plasmid og 5 ul av PCR-genproduktene til hvert rør. Legg til hvert rør, 1 ul av spesifikke restriksjonsenzymer, 2 pl reaksjonsbuffer og 14 ul av dH 2 O.
  13. Tilsett 3 mL av fordøyd plasmid, 5 ul fordøyd DNA-fragmenter, 2 pl 10x ligasebuffer, 1 mL av ligase og 9 ul dH 2 O i en mikrosentrifugerør. Inkuber ved 12 ° CO / N.
  14. Tilsett 0,1 vol 3 M natriumacetat til pH 5,5, og to volumdeler ethanol (hvis ligeringsrørene volumet er 20 ul tilsett 2 ul av 3 M natriumacetat + 44 ul etanol) til røret fra trinnet 2.14. Bland godt og inkuber ved -20 ° C i 15 min.
  15. Sentrifuger røret ved 14.000 xg i 15 min. Fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av en mikro pipette uten å forstyrre pelleten.
  16. Tilsett 100 ul 70% etanol to pellet fra trinn 2.10. Sentrifuger røret ved 14.000 xg i 5 min. Fjern og kast supernatanten. Tilsett 10 mL av nuklease-fritt vann til DNA-pelleten.

3. Protein Expression Bruke in vitro humant Cell Free Expression System

  1. Forbered 20 ul av transkripsjon blanding ved å måle 2 ul av det rekombinante pT7CFE1-chis plasmid DNA, 4 pl 5x transkripsjon buffer, 4 ul av NTP-blanding, 2 ul av T7 RNA polymerase og 8 ul av nuklease-fritt vann til to-trinns human in vitro Protein Expression bruk av DNA maler. Bland komponentene i et mikrosentrifugerør og inkuberes i 75 minutter ved 30 ° C i et vannbad.
  2. Ta 2 ul av transkripsjons blandingen og tilsett det til 23 pl av oversettelses blanding inneholdende 12,5 pl av HeLa-celle-lysat, 2,5 mL av aksessoriske proteiner, 1 pl av saltløsning A, 0,5 ul av aminosyrer -Met, 0,5 mL av aminosyrer Leu, 181; l RNAse inhibitor, 1,25 mL av energimiksen og 3,75 mL av nukleasefritt vann.
  3. Inkuber oversettelsen blandingen fra trinn 3,2 ved 30 ° C i 90 min. Oppbevares oversatt produkter ved -20 ° C.
  4. Forbered 25 ul av transkripsjon og translasjon blandingen ved tilsetning av 3 ul av det rekombinante pT7CFE1-chis plasmid-DNA, 2 pl av nuklease-fritt vann, 5 ul av reaksjonsblandingen, 12,5 mL av HeLa-lysat og 2,5 ul av aksessoriske proteiner for ett-trinns Menneskelig Sammen IVT Protein Expression for DNA-maler.
  5. Inkuber reaksjonsblandingen fra trinn 3,4 i 90 min til 6 timer ved 30 ° C. Oppbevar translasjonsproduktene ved -20 ° C.

4. Rensing av Uttrykt rekombinante proteiner

  1. Legg 75 mL av 1x rensing buffer til 25 ul av oversettelse produkt for å gjøre 100 ul rensing blanding.
  2. Legg 100 mL av nikkel chelatdannende harpiks til 100 mL av rense mixture. Vask Ni-harpiks to ganger ved å tilsette 300 ul av 2 dH O og 300 ul av bindingsbuffer. Re-suspen harpiks og sentrifuger ved 14 000 xg i 1 min for å fjerne overskudd av etanol.
  3. Tilsett 100 ul av renseblanding fra trinn 4,2 til 100 ul av nikkel chelaterende harpiks og inkuberes blandingen i 60 minutter ved RT.
  4. Sentrifuger blandingen ved 14 000 xg i 1 min, og samle supernatanten til et nytt rør merket som "flow through".
  5. Vask harpiks med 100 ul av 1 x vaskebuffer (20 mM imidazol, 250 mM NaH 2PO 4 ved pH 8, 2,5 M NaCl og dH 2 O). Sentrifuger ved 14000 x g i 1 min, og samle supernatanten i nytt rør merket "vask". Gjenta steg 4,5 to ganger.
  6. Tilsett 100 ul av 1 x elueringsbuffer (100 mM imidazol, 250 mM Na 2 PO 4 ved pH 8,0, 2,5 M NaCl og dH 2 O) til harpiksen og inkuberes i 15 min. Sentrifuger ved 14000 x g i 1 min. Gjør elueringstrinnet to ganger. Hvertid samle supernatanten inn ferske mikrosentrifugerør og etikett som "eluatet".
  7. Etter eluering, vask harpiksen to ganger som beskrevet i trinn 4.5. Lagres strømme gjennom, vasker og eluering prøver ved -20 ° C eller lavere. Resin må oppbevares ved 4 ° C. Bruke 30 ul av hver prøve for SDS-PAGE og immunblotting-analyse.

5. Coomassie (Bradford) Protein Assay 34

  1. Lage standard bovint serumalbumin (BSA) løsninger med konsentrasjon 20 pg / ml (bland 10 ul av BSA (2 mg / ml) og 90 pl av dH 2 O), 40 ug / ml (blande 20 ul av BSA (2 mg / ml) og 80 pl av dH 2 O), 60 ug / ml (bland 30 ul av BSA (2 mg / ml) og 70 pl av dH 2 O), 80 ug / ml (blande 40 ul av BSA (2 mg / ml) og 60 pl av dH 2 O), 100 ug / ml (bland 50 ul av BSA (2 mg / ml) og 50 pl av dH 2 O), 160 ug / ml (blande 80 ul av BSA (2 mg / ml) og 20 pl av dH2 O) og 200 ug / ml (100 pl BSA (2 mg / ml).
  2. Mål 5 mL av flyt gjennom, vasker og eluat prøver fra trinn 4.7. Legg 95 mL av dH 2 O.
  3. Tilsett 5 ml av Coomassie blue-reagens til blandingen fra trinn 5.1 og 5.2. Dekk til rørene med parafilm og virvle i 10 sek og deretter inkuberes i 20 min ved RT.
  4. Ved hjelp av et spektrofotometer, måle optisk tetthet (OD) ved bølgelengden 650 nm for proteinet rørene fra trinn 5.3. Plot konsentrasjon vs. OD lesing å bestemme proteinkonsentrasjonen 34.

6. Western Blotting

  1. Tilsett 5 mL av schizont ekstrakter fra P. falciparum, 2 ul av Escherichia coli uttrykte rekombinante proteiner Rhop-3 31, 5 ul av rekombinante proteiner uttrykt ved hjelp av to-trinns og en-trinns in vitro humane ekspresjonssystemer og 10 ul av proteinproduktene renses ved bruk av affinitet metode for å separere rørene. Legg elektroforese-prøvebuffer inneholdende merkaptoetanol til hvert rør i et endelig volum på 20 ul for å gjøre oppløseliggjorte proteinprøver. Kok rør i 2 min.
  2. Load oppløseliggjorte proteinprøver på 10% SDS-PAGE-geler for å separere proteiner.
  3. Overfør separerte proteiner fra SDS-PAGE-geler til nitrocellulosepapir (NCP) av electrophoresing ved 35 mA pr gel i en halvtørr western blotting kammer i 2 timer.
  4. Block NCPene følgende overføring med 2% fettfri melk.
  5. Inkuber blokkert NCP med følgende polyklonale antistoffer fortynnet 1: 100 i 2% melk for å utføre Western blotting; kanin antistoff # 676 21 spesifikke for P. falciparum merozoit rhoptries, mus antistoffer 20 spesifikke for P. yoelii og P. berghei merozoit rhoptries, sera # 685 spesifikke for P. falciparum parasitophorous vacuole protein, SERA (serin rik antigen) 22 og antistoffer som er spesifikke for Maurer217; s kløft protein PfMC-2TM 28.
  6. Inkuber NCPene også i 1: 100 utvannet normale mus og kanin serum og tilbrakte kultursupernatantfluider (SCS) fra SP2 myelomaceller som negative kontroller.
  7. Inkuber NCPene med antistoffer og kontroller ved 4 ºC O / N.
  8. Vask NCPene 4x med Blot buffer og inkuberes NCPene med artsspesifikke sekundære antistoffer konjugert til pepperrot (HRP) fortynnet 1: 1000 i 2% melk.
  9. Vask NCPene 4x med Blot buffer. Inkuber vasket NCP med fargeutviklingsløsning A + B (løsning A: Tilsett 50 ml 1x Blot-buffer og 30 pl av H2O 2, Løsning B: Tilsett 10 ml metanol og 30 mg 3-klor-naftol) for 30 min i mørket. Analyser vestlige blot resultater rimet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av de uttrykte rekombinante proteiner gjennom reaktivitet med spesifikke antistoffer er et viktig første skritt i å bekrefte riktig folding av de uttrykte proteiner. Rekombinante malaria proteiner ble uttrykt ved hjelp av et skritt og to trinn in vitro human celle ytringsfrihet systemer. De rekombinante proteiner er renset Ni-gelaterende affinitet metoden. Vi brukte antisera mot hele merozoit rhoptries i western blotting av SDS-PAGE separerte rekombinante proteiner.

Figur 1 viser PCR-amplifikert gen fragmenter av PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 og PF3D7_1436300 i en 1% agarose gel. DNA-band ble skåret ut og DNA renses ved å fryse i DNA ekstraksjon Spin kolonne.

Malaria gener vellykket forsterker (vist i tabell 2) fra genomisk DNA ble klonet inn i pT7CFE-chis ekspresjonsvektor. Re-forsterkning av genene fra recombinant plasmider viste nærvær av de klonede genfragmenter i vektoren. Flytskjemaet for ekspresjonssystemer anvendes for proteintranslasjon er vist i figur 2. Figurene 2A og 2B viser en trinnvis fremgangsmåte for 2-trinns in vitro human cellefritt ekspresjonssystem og ett-trinns IVT koplet translasjonssystem. Vellykket uttrykk for Plasmodium proteiner ved hjelp av in vitro human celle gratis ekspresjonssystemer ble bekreftet av rhoptry bestemt kaninantiserum. Som illustrert i figur 3A, ble rekombinante proteiner gjenkjent av rhoptry spesifikke kaninantiserum # 676. Som vist tidligere, uttrykte rekombinante proteiner ble ikke anerkjent av antisera mot parasitophorous Vacuole proteiner fra P. falciparum og P. yoelii demonstrerer spesifisiteten av kanin sera 676 mot de uttrykte proteinene 32. Normalt kaninserum (NRS) reagerte ikke med rekombinante proteineromregnes 2-trinns in vitro menneskecelle ytringsfrihet system og 1-trinns IVT kombinert oversettelsessystem (figur 3B). Den vellykkede uttrykk for Plasmodium rekombinante proteiner ble bekreftet av ulike teknikker som i-gel histidin farging og Nickel-HRP flekker 32. Uttrykte proteiner ble renset ved affinitetsrensing system. Rensing er utført i PRODUKSJONS metode (ingen kolonner brukes). Teknikken er optimalisert ved å endre konsentrasjonen av Imidazol fra 60 mM til 100 mM. Den optimale konsentrasjon for elueringen er 250 mM. Figur 4 viser vellykket rensing av oversatte proteiner fra 25 ul av translaterte proteinprodukter. Figur 4A viser vellykket rensing av Maurer spalten transmembranprotein 18. Figur 4B viser vellykket rensing av PF3D7_0925900, P. falciparum ortolog av Plasmodium yoelii genet PY17X_0830000, enhypotetisk protein 32. Figur 4C viser vellykket rensing av armadillo gjentar inneholder protein PY17X_1139200, en hypotetisk protein ved hjelp Ni harpiks perler og 100 mm -imidazol i 1x elueringsbuffer. Utbyttet av protein etter rensing er 3,5 ug / 25 ul.

Figur 1
Figur 1. Forsterkning av P. falciparum og P. yoelii gener. 1% agarosegel viser ethidiumbromid farget PCR produktene genfragmenter av PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 og PFA0680cw forsterkede fra P. falciparum genomisk DNA.

Figur 2
Figur 2. Flytskjema for HeLa bas ed celle ytringsfrihet system. Skjematisk fremstilling av både 2-trinns og 1-trinns in vitro human celle gratis ekspresjonssystemer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Immunoblotting bekreftelse av proteinekspresjon. Western blot-analyse av rekombinante proteiner uttrykt ved hjelp av hele rhoptry spesifikke kanin anti-sera # 676 og normalt kaninserum. (A) Reaktivitet av antisera 676 med uttrykte rekombinante proteiner. (B) normalt kaninserum reagerte ikke med de uttrykte rekombinante proteiner. Parasitophorous vakuole protein reagerte ikke med rekombinante proteiner 32.hres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Rensing av proteiner fra mikro volumer av translasjonsproduktet. Rensing av uttrykte rekombinante proteiner ved anvendelse av nikkel-chelaterende harpiks affinitet metode. Uttrykte proteiner (oversettelse) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, og (C) PY17X_1139200 proteiner ble inkubert med Nickel - chelaterende harpikser blir renset med nikkel- chelaterende harpiks i fravær av imidazol i bindingsbuffer og rensebuffer. Etter inkubering, ble kulene sentrifugert, ubundne proteiner ble separert og kulene vasket to ganger i vaskebuffer. Bundet rekombinante proteiner ble eluert to ganger etterfulgt av vasking av kulene. Oversatt proteiner, vasker, Eluatene og perlerble løst i elektroforese prøvebuffer. Imidazol ble anvendt i vaske (20 mM imidazol) og eluering (100 mM imidazol) buffere. Sera # 676 hell anerkjent uttrykk og rensede rekombinante proteiner. Normal kaninserum reagerte ikke med uttrykte proteiner som viser i figur 3B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

<td> 200 kd
Spesifikasjoner Menneskecelle-Free uttrykk system Hvetekim celle ytringsfrihet system Rabbit reticulocyte uttrykk system E.coli lysatet protein expression system
Tid Ferdig transkripsjon og oversettelse i tre timer Transkripsjon i 6 timer og oversettelse for 10 - 20 timer RNA har til å bli isolert oversettelses tar 90 min Done i 1 time
Egnet vektor T7 vektor kan være SP6 vektor T7 kan benyttes T7 kan benyttes
Egnet skala Passer for laboratorie-syntese Brukes for storskala proteinsyntese Passer for laboratorie- og vaksinasjonsstudier Passer for laboratorie- og vaksinasjonsstudier
Utdrag HeLa cellefrie ekstrakter Embryo av hvete ekstrakter Reticulocyte celleekstraktene E. coli-celle lysat ekstrakter
Modifikasjon Co-translasjonell og post translasjonell modifikasjon Post translasjonell modifikasjon Co-translasjonell modifikasjon Post-translasjonell modifikasjon
Størrelse på protein oversatt 8 KDa til 250 kd 220 kd 250 kd
Kodon optimalisering Stramt Stramt Loose Stramt
Disulfidbindingen dannelse Ja Ja Nei Ja
Yield Lav avkastning High yield Low Yield Svært høy avkastning
Kostnad $ 130,00 for 10 reaksjoner $ 173,00 for 10 reaksjoner $ 136,00 for fem reaksjoner $ 159,00 for 8 reaksjoner
Proteinkonsentrasjonen 3 til 5 mikrogram per reaksjon 100 pg / ml 100 pg / ml 500 pg / ml
Referanser 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

Tabell 1. Celle gratis ekspresjonssystemer i malariaforskning. Sammenligning av celleytringsfrihet systemer brukes i dag i malariaforskning.

Gene ID Ortolog ID Protein Primer Sequence for PCR
PF3D7_1436300 Translocon komponent CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 PfMC-2TM Maurer sin kløft protein GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 Hypotetisk Protein GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 Hypotetisk Protein GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

Tabell 2. Rhoptry gener i studien. Grunning av ulike gener som uttrykkes i denne studien 19.

Navn Material Selskap Katalognummer Beskrivelse
2-trinns in vitro menneskecelle ytringsfrihet system 32 Thermo Fisher 88856 Avviklet. Oppbevar alltid ved -80 ° C. Ikke tine i varmt vann.
1-step in vitro kombinert oversettelsessystem Thermo Fisher 88860 Oppbevar alltid ved -80 ° C. Ikke thaw i varmt vann.

Tabell 3. Hela basert cellefrie ekspresjonssystemer. Kit som anvendes for ekspresjon av proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det viktige trinn for vellykket ekspresjon av proteiner ved anvendelse av to-trinns in vitro human cellefritt ekspresjonssystem og rensing er: 1) vellykket amplifikasjon og kloning av gener i pT7CFE-chis plasmidvektor; 2) transkribere RNA ved 30 o C; 3) translasjon av proteinet ved 30 ° C i nærvær av RNase inhibitor; 4) utvikling av affiniteten baserte renseprotokoll ved bruk av harpikskuler belagt med Ni og 5) analyserer resultatene på western blot ved anvendelse av polyklonale og monoklonale antistoffer. De viktigste trinnene for vellykket uttrykk av proteiner ved hjelp av ett skritt IVT kombinert proteintranslasjon system er: 1) vellykket forsterkning og kloning av gener i pT7CFE-Chis plasmidvektor; 2) transkripsjon og translasjon av proteinene ved 30 ° C; 3) å utvikle affiniteten baserte renseprotokoll ved bruk av harpikskuler belagt med Ni og 4) analysere resultatene på western blot ved anvendelse av polyklonale og monoklonale antistoffer.

Strømly, er celle ytringsfrihet systemer som brukes for å uttrykke rekombinante malaria proteiner. De kritiske trekk ved cellefrie ekspresjonssystemer for å uttrykke proteiner malaria er evnen til å dekode AT-rike gener, en mangel på lang translasjonell pause, vellykket ekspresjon av gjentatte aminosyresekvenser, mangel på glykosyleringsseter mekanismer og evnen av plasmider for å kontrollere genet avkutting. I denne studien har vi demonstrere bruken av en to-trinns in vitro menneskecelle ytringsfrihet system 32 og en ett-trinns IVT kombinert oversettelsessystemer for uttrykk av P. falciparum genet ortologer av P. yoelii merozoitt rhoptry gener som vist i tabell 1. En renseprotokoll ble utviklet og optimalisert for rensing av mikromengder av rekombinante proteiner erholdt fra ett-trinns og to-trinns in vitro human cellefrie ekspresjonssystemer. 4 P. falciparum gener, PF3D7_0114100 et trans hydrofob protein, en spådd hypotetisk ARM gjentaprotein PF3D7_1361800 og en hydrofil protein PF3D7_0925900, ble uttrykt ved hjelp av en 2-trinns og 1-trinns in vitro menneskecelle ytringsfrihet system. Purified proteinutbytter ble bestemt. Proteinet PfMC-2TM ble inkludert i disse studiene, fordi det er en integrert membranprotein med to transmembrandomener og vi er interessert i å bestemme om in vitro ekspresjonssystem kan fullstendig uttrykke transmembranprotein og gir mulighet for lettere rensing.

Den største forskjellen i både ett trinn, og to-trinns ekspresjonssystemer er at de to trinn ekspresjonssystemet er et mRNA avhengig system, hvor en stabil mRNA blir transkribert og tilsettes til translasjonsreaksjonen. I motsetning til dette et skritt in vitro-koblet transkripsjon / oversettelsessystem omfatter en kontinuerlig tilførsel og transkripsjon av mRNA, fulgt av ko-translasjon av proteinet i løpet av reaksjonen. Både 1-trinns IVT transkripsjon / translasjon kombinert eXpression system og to-trinns in vitro human cellefritt ekspresjonssystem ble testet for ekspresjon av proteiner av høymolekylvekt. Begge systemene var vellykket i å uttrykke lavmolekylære rekombinante proteiner. I ett-trinns ekspresjonssystem, ble antistoff kryssreaktivitet med proteiner i oversettelsen reaksjonsblandingen observert. De spesifikke proteiner krysser reagerer med antistoffene er kjent og trenger videre undersøkelser. Ekspresjon av proteiner av høymolekylvekt var mislykket med både ett-trinns og to-trinns system. En rensing protokollen ble utviklet for rensing av microvolumes av rekombinante proteiner av ulike oppløselighetsegenskaper uttrykkes ved hjelp av både en-trinns og to-trinns in vitro human celle ytringsfrihet systemer. Proteiner var vellykket renset og utbyttet oppnådde var 3,5 mikrogram per 25 ul da uttrykkes ved hjelp av to-trinns in vitro protein oversettelsessystem og 1,5 mikrogram per 25 ul når oversatt med 1-trinn IVT protein expression system. Ekspresjon av lavmolekylære proteiner som varierer fra 18 kDa til 37 kDa er reproduserbar og rett frem. Imidlertid fører høy molekylvekt uttrykk i protein trunkeringer. På grunn av de microvolumes oppnådd for klonet DNA, PCR-amplifikasjon ble brukt til å bekrefte klonede produkter. Potensielle hindringer for å uttrykke proteiner av høymolekylvekt ved hjelp av cellefrie ekspresjonssystemer kan være konstant fosforylering av eIF2 alfa-underenhet på grunn av høy konsentrasjon av ATP i reaksjonen. Dette svekker translasjons-initierings i systemet som potensielt påvirker forlengelsen av proteinsyntese i løpet av syntesen av store proteiner i cellefritt ekspresjonssystemer 10.

Protokollen er beskrevet her, er upåvirket av optimaliserings betingelser for ekspresjon av proteiner. Verken genet kodoner eller plasmidet ble optimalisert for ekspresjon av proteiner og protein refolding ble ikke nødvendig. Dette systemet uttrykker proteins i 3 timer og rensing av proteinet kan oppnås i 2 timer, noe som åpner for videre nedstrøms applikasjoner som for eksempel behandling av det rekombinante protein for immuniseringer eller peptid-sekvensering. Flere rekombinante proteiner kan uttrykkes med HeLa cellefritt system ved bruk av mikroarray formater for immunsera screening og identifisering av potensielle vaksinekandidat molekyler. Videre kan potensielt immunogene proteiner identifiseres gjennom skjermene og valgt proteiner erholdt ved å skalere opp uttrykk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
  2. Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
  3. Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  4. Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
  5. Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
  6. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
  7. Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
  8. Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
  9. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
  10. Hinnebusch, A. Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).
  11. Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
  12. Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
  13. Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
  14. Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
  15. Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
  16. Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
  17. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
  18. Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
  19. Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
  20. Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
  21. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
  22. Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
  23. Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
  24. Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
  25. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  26. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  27. Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
  28. Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
  29. Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
  30. Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
  31. Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
  32. Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
  33. Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Tags

Biokjemi Cell gratis in vitro transkripsjon-oversettelse HeLa celle ytringsfrihet rhoptry proteiner pattedyrcelle ytringsfrihet system, Pro Bond affinitetsrensing
HeLa Basert Cell ytringsfrihet Systemer for Expression of<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa… More

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter