Summary
セルベースのシステムにおけるマラリアのタンパク質の発現は、依然として厳しいです。我々は、HeLa細胞からマラリアrhoptry組換えタンパク質を発現するための2つのステップと、一段階IVT（ インビトロ翻訳 ）無細胞発現系を示します。我々はrhoptryタンパク質を精製するのNi-樹脂親和性に基づく精製システムを使用しています。
Abstract
マラリアは、重要な世界的な罹患率および死亡率の原因となります。いいえルーチンワクチンは現在利用できません。ワクチンの欠如の主な理由の一つは、適切なワクチン候補を同定する課題です。マラリアタンパク質ベースの発現系が不完全にグリコシル化一般に不溶性及び免疫原性の低下につながる不適切なフォールディングを受けている原核および真核細胞を用いて発現させました。小麦胚芽、ウサギ網状赤血球溶解物および大腸菌溶解物の無細胞発現系は、現在、マラリアタンパク質の発現のために使用されます。しかし、発現時間およびタンパク質の不適切なグリコシル化の長さは、依然として課題のまま残されています。我々は、「 インビトロのヒト無細胞発現系」と呼ばれる、ヒーラ基づく無細胞発現系を用いてインビトロでマラリア原虫タンパク質の発現を示します。 2 HeLa細胞ベースの無細胞発現系では75分とtranscribの3μlの中のmRNAを転写しますED mRNAは、90分でタンパク質を翻訳するのに十分です。 1段階の発現系は、転写および翻訳結合発現系です。転写および同時翻訳が3時間で発生します。プロセスはまた、追加のエネルギーを提供することによって、6時間延長することができます。 2段階の発現系では、mRNAは、最初に転写され、次いで、タンパク質の発現のための翻訳混合物に加えました。私たちは、マラリアのタンパク質を発現する方法について説明します。疎水性PF3D7_0114100マウラーの裂 - 2貫通（PFMC-2TM）タンパク質、親水性PF3D7_0925900タンパク質およびタンパク質PF3D7_1361800を含むアルマジロリピート、HeLa細胞ベースの無細胞発現系を使用して。タンパク質は、2段と1段の発現戦略を採用したマイクロボリュームで表されています。アフィニティー精製の 方法も記載されているインビトロのヒト無細胞発現系を用いて発現されたタンパク質の25μLを精製します。タンパク質の収率は、ブラッドフォードアッセイによって決定され、発現されそして精製されたタンパク質は、ウェスタンブロット分析により確認することができます。発現された組換えタンパク質は、免疫化、免疫アッセイおよびタンパク質配列決定のために使用することができます。
Introduction
マラリア研究では、原核細胞または真核細胞に基づく系を用いて免疫原性タンパク質の発現が課題です。 マラリア原虫ゲノムの豊かさと未知の翻訳後の機構14,7 AT、抗体産生およびワクチン研究のために、適切に折り畳まれ、免疫原性タンパク質を得ることに関連する困難に貢献しています。 大腸菌などの原核生物系は、組換えタンパク質の発現のために使用されています。原核細胞系は、効果的な低コストであり、組換えタンパク質の高収量を産生します 複数のクローニングベクターを持っています。 E.ホストcoli細胞は、変換が容易であり、細胞が急速に成長します。しかしながら、原核生物のシステムは、アミノ酸置換、翻訳後修飾、封入体24内の汚染、異種の製品、および組換えタンパク質の蓄積の危険性の欠如などの限界があります。
でMehlin らの研究（2006）、1000年のオープンリーディングフレーム（ORF）を発現させました。発現されたタンパク質の約7％は、可溶性14でした。観察された不溶性は、遺伝子のバイアスされた自然と豊かなゲノム14 AT マラリア原虫によって理想的に使用されるコドンの高周波によるものです。この問題を克服するための別の戦略は、周波数3と一致する稀なコドンまたはコドンを認識するtRNAを含むプラスミドまたは宿主細胞を使用して開発されてきました。であってもこれらの最適化を行った後、タンパク質の非常に小さい部分が、可溶性の活性および免疫原性14として表されています。無細胞発現系は、リボソーム、開始因子、伸長因子（翻訳因子）、tRNAとアミノアシルtRNAシンテターゼのような転写および翻訳に必要なすべてのコンポーネントを含みます。両方の転写および翻訳反応を、一段階手順11,29に接続されています。 transcrimRNAの適切な量は、異なるチューブ11,29に翻訳機構とインキュベートする前に、ption反応管中で行われます。これらの方法は、 プラスモディウム属タンパク質の発現に成功しているが、主な欠点は、約22時間29であるタンパク質の発現のための時間の長さです。また、プロトコル29に含めるための供給の高コストでは、成分製剤中の細胞溶解物との不整合の労働集約的な調製物は、これらのシステムは実現不可能にします。無細胞発現系の開発のための研究の主な焦点は、このような急速な遺伝子改変、高濃度とまっすぐ溶解液調製1と高速利回りなどの要因に依存します。
酵母、哺乳動物細胞株、バキュロウイルス媒介発現系、 テトラヒメナthermophilia、細胞性粘菌と寄生発現システムのsuのような真核生物のシステムリーシュマニアなどのCHは、組換えタンパク質の発現7のために使用されています。真核生物系は、系統発生的関係を共有し、したがって、グリコシル化、アシル化、ジスルフィド結合形成、シャペロン相互作用、タンパク質分解および細胞下区画などの特性を共有しています。真核生物におけるタンパク質分泌イベントが蓄積するのを防止し、発現システム13のための毒性を減少させます。彼らは大規模タンパク質発現のための、高収量4を得るのに適しているとして、酵母系を使用することが好ましいです。二P.熱帯熱マラリア原虫タンパク質 PfCP-29及びPvs25は、酵母系4を用いて製造しました。しかし、ほとんどのタンパク質の合成における主要な欠点は、それらの天然の形態4からのタンパク質の不規則なN及びO-グリコシル化パターン、不適切な折りたたみと切り捨てました。
組換えタンパク質の合成のための哺乳動物細胞の使用は、労働集約的であり、それはexpenあります安定な組換え細胞株4を維持するためにSIVE。従って、哺乳動物細胞は、タンパク質のシグナル伝達、タンパク質相互作用及び寄生虫宿主相互作用の分析のために制限されており、また、DNAワクチンを試験するための4。本明細書中に記載のインビトロタンパク質発現の無細胞系におけるヒトDNAおよびmRNAは3時間でタンパク質を発現するHeLa細胞由来の哺乳動物ベースのシステムです。タンパク質を同定および精製を容易にするC末端タグを持っpT7CFE1-CHISの発現ベクターを用いて発現させました。 HeLa細胞ベースのシステムは、それによって翻訳システムの効率を向上させる、翻訳開始因子および翻訳調節が補充されます。タンパク質は、急速に、翻訳スクリーニング、確認、および様々な免疫学的および構造15の用途で使用するために処理することができます。
このような小麦胚芽とウサギ網状赤血球などの真核細胞を含まない発現系は、現在、VARの発現のために使用されていますマラリア原虫タンパク質 11,29を含むIOUの真核生物のタンパク質。さらに、E.大腸菌基づく無細胞系もまた、真核生物タンパク質の発現のために使用されている11。 表1は、システムの特徴ならびにタンパク質発現のためのシステムを使用しやすさを比較することによって、別の無細胞発現系をまとめたものです。他と比較してヒト細胞を含まない系は、ポストと共翻訳後修飾を行う能力を有し、かつ安価です。コドン最適化が可能であり、全ての反応は3時間で行うことができます。 HeLa細胞系は、実験室の設定におけるタンパク質合成のための理想的な翻訳系です。
他の無細胞系上のヒト無細胞発現系の主な利点は、異なる器官及び組織に由来するいくつかの異なる細胞株の利用可能性です。無細胞系のいくつかの種類は、細胞株に応じて設計することができます。エキス哺乳動物細胞由来の任意の他の無細胞発現系より大きなタンパク質を合成するためのより高い効率を有します。これらの無細胞発現系はまた、マイクロアレイ30として診断およびタンパク質特徴付け用途に使用することができます。人気のあるHeLa細胞株は、最も広くタンパク質33の発現を行うために使用されます。 HeLa細胞株での小胞体は、翻訳後グリコシル化修飾活性33の不在をもたらす、未発達です。 マラリア原虫はまた、グリコシル化の翻訳後修飾を欠く29しかし、このシステムは、 マラリア原虫のタンパク質合成のために有利で あると考えられます。 HeLa細胞無細胞転写翻訳プロトコルは、安価で実施が容易であり、タンパク質を精製し、さらに下流の適用の準備ができて、90分で表すことができます。
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Protocol
寄生虫の細胞培養の調製、寄生虫ペレットのコレクション
- 1リットルのRPMI-1640粉末10g、ゲンタマイシン硫酸塩66 mgを、2gの重炭酸ナトリウム5.9グラムのHEPES緩衝液、50mgのヒポキサンチン3.8グラムのブドウ糖を添加することによりRPMI-1640-HEPES培地を調製し、無菌のdH 2 O.全ての粉末を1Lの蒸留水に溶解するまでテーブルマグネチックスターラーを用いて混合します。 0.22μmフィルターを使用してメディアの精密ろ過を行います。滅菌ボトル内のメディアを保管してください。
- RPMIを使用して感染していない（新鮮な）タイプA +赤血球を洗浄します。赤血球の5％のヘマトクリット（9.5ミリリットルの10％RPMI +ヒト血清中で洗浄し、新鮮な赤血球の0.5ミリリットル）を準備します。
- 寄生虫の栽培を開始するために、15％ヒト血清+ RPMI（ヒト血清とRPMIの85ミリリットルの15ミリリットル）を作ります。赤血球において寄生虫の培養を継続するために、10％ヒト血清及びRPMI（ヒト血清10ml及びRPMI 90 ml）を作ります。
- 文化P.熱帯熱マラリア原虫 （3D7とFCR-3株）タイプ5％のヘマトクリット及び20％の寄生虫シャーレ内または75 cm 3の培養フラスコでのA +ヒト赤血球。トレーガーとジェンセンキャンドルジャー26の方法に従って、インビトロでの培養を維持します。あるいは、培養物が9.5％のCO 2と3.4％のN 2ガ ス維持し、37℃のインキュベーターである維持します。文化P. 10％ヒト血清を補充したRPMI 1640-HEPES培地で熱帯熱マラリア原虫 。
- Pを同期させます培養液に65％パーコール（ヒト血清を含まないRPMI-1640のパーコールの65ミリリットル+ 35ミリリットル）を追加することで熱帯熱マラリア原虫の培養は、27を集中します。
- 3層になる5分間、2500×gでパーコールを含む培養濃縮物を遠心します。慎重に、トランスファーピペットを用いて、無菌状態の下で27の別々のチューブに中間層転写からシゾントを分離します。
- 5分間7500×gで遠心分離することにより、過剰なパーコールを除去するために二回、10％ヒト血清+ RPMI-1640で分離された文化を洗ってください。ディ無菌状態の下で27上清を毎回SCARD。
- 同期P.を培養し続けます10％ヒト血清+ 27 RPMI-1640で熱帯熱マラリア原虫のシゾント。
- 10 mMトリスpHを8.8にマラリア原虫に感染した赤血球をを治療し、15分間23 15000×gで遠心分離することによって、シゾントを収集します。ペレットにプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン）5μlの添加以下の-70℃で保存寄生虫ペレット。タンパク質抽出、ゲノムDNAの単離およびRNA単離のために寄生虫ペレットを使用してください。
プラスミドベクターの準備2.
- PからゲノムDNAを単離約20％の寄生虫血の培養物から調製原虫シゾントペレット。
- 、マイクロチューブにペレットにpHが7.6の10mMのトリス-HCl、50mMのEDTA pH8.0の、0.1％SDSおよび1 mg / mlのプロテイナーゼK、600μlのを追加します26 G針に取り付けられた1mlシリンジを使用してペレットを均質化します。注射器に充填代替ペレットの混合物とし、微量遠心管に20回を空にする。 50℃の水浴中でホモジネートO / Nを含むチューブをインキュベートします。
- 均質化されたペレットに、P + C（フェノール300μlのクロロホルム300μlの）の600μLを添加することにより、クロロホルム（P + C）の抽出 - フェノールを実行します。キャップチューブをしっかりとチューブエンド·ツー·エンドを反転させて混合物を激しく振ります。 2分間、14,000×gで遠心分離管と新しいマイクロチューブにマイクロピペットを用いて、上部水溶液を収集します。二回、この手順を繰り返します。
- ステップ2.1.2から新しいチューブに水層にクロロホルム600μlのを追加します。 2分間14,000×gで10秒間遠心分離用チューブをボルテックス。マイクロピペットで上層の水層を測定して、新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 水性レイに（水層を300μlの5 M酢酸ナトリウムのpHをイソプロパノール5.5 + 330μlと30μlを添加する場合）5 M酢酸ナトリウムのpHを5.5の0.1容量のイソプロパノール1容量を追加ステップ2.1.3からえー。室温で15分間チューブをインキュベートします。
- DNAペレットを沈殿させ、10分間14,000×gでチューブを遠心。上清を捨て、DNAから過剰の塩を除去するために、70％エタノール（エタノール70μlのとのdH 2 O30μlの）100μlでペレットを洗浄。 -20℃でのdH 2 O50μlのストアDNA。
- 前方に設計し、Pの増幅のためのソフトウェアを使用して、または手動リバースプライマー表2に示すように、 熱帯熱マラリア原虫の遺伝子PF3D7_1361800、PF3D7_0925900、PF3D7_1436300とPF3D7_0114100は、以前プロテオーム研究発現プラスミドpT7CFE1-チスの多重クローニング部位への遺伝子配列のクローニングを可能にするために、適切な制限部位を有する16,18で識別されました。
- 追加することで、50μlの反応混合物を作ります。分離されたPの5μlの熱帯熱マラリア原虫のゲノムDNA、10×緩衝液5μl、MgCl 2を5μlの、フォワードプライマー1.5μlの、1.5μlのリバースプライマーは、T7 DNAポリメラーゼ0.5μlのとのdH 2 O 31.5μlのおよび変性のために8分間94℃でのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、拡張のために1分30秒間50℃、9を72°C 表1に示す遺伝子を増幅するためのアニーリングおよび再生分間。
- 1％アガロースゲル（アガロース1g及びトリス酢酸EDTA（TAE）緩衝液100ml）32上に独立したPCR産物。
- 、アガロースゲルからPCR増幅されたDNAバンドを切断されたDNAゲル抽出スピンカラムにDNAを含むゲルスライスを配置し、5分間、-20℃で凍結します。 5分間14,000×gで凍結したゲルスライスや遠心分離機にイソプロパノール100μlを添加します。
- マイクロピペットを用いて、水性フロースルーステップ2.5からコレクションチューブに濾過さを測定し、新しいチューブに移します。 5分間、14,000×gで5 M酢酸ナトリウムおよび遠心分離機の0.1容量を追加します。上清を捨て、目にのdH 2 O10μlのを追加EのDNAペレット。
- 各チューブにプラスミドおよび3μlのPCR遺伝子産物の5μLを添加することにより、2つの別々のチューブにpT7CFE1-CHIS発現ベクターと、（2.6）から精製されたDNA断片をダイジェスト。各チューブに特定の制限酵素の1μlを、反応緩衝液2μlのとのdH 2 Oの14μLを追加
- 消化されたプラスミドの3μlを、消化されたDNA断片の5μlを、10×リガーゼ緩衝液2μlのリガーゼの1μLとマイクロ遠心チューブ内のdH 2 Oの9μlを添加します。 12°CO / Nでインキュベートします。
- pHは5.5と2倍量のエタノールで3 M酢酸ナトリウムの0.1容量を追加し、ステップ2.14からチューブに（あなたの連結管容積がある場合は20μlの3 M酢酸ナトリウムのエタノール+ 44μLの2μlを添加します）。よく混ぜ、15分間-20℃でインキュベートします。
- 15分間14,000×gでチューブを遠心。ペレットを乱さないように注意し、マイクロピペットを用いて上清を除去します。
- 70％エタノールtの100μlを添加しますステップ2.10からペレットO。 5分間、14,000×gでチューブを遠心。上清を除去し、廃棄します。 DNAペレットにヌクレアーゼフリー水10μlを加えます。
インビトロヒト細胞フリー発現システムで使用3.タンパク質発現
- 2段階のための組換えpT7CFE1-チスプラスミドDNA、5×転写バッファー4μlの2μlのを測定することにより、転写混合物20μlの、NTPミックスの4μL、T7 RNAポリメラーゼおよびヌクレアーゼフリー水8μlの2μlのを準備しますDNAテンプレートを用いてin vitroタンパク質発現における人間。微量遠心管中の成分を混合し、水浴中で30℃で75分間インキュベートします。
- 転写混合物の2μLを取り、HeLa細胞溶解物の12.5μlを、アクセサリータンパク質の2.5μlを、塩溶液Aの1μlを、アミノ酸-Met0.5μlの、アミノ酸の0.5μLを含む翻訳混合物の23μlにそれを追加-Leu、181; RNaseインヒビター、エネルギーミックスの1.25μlのヌクレアーゼを含まない水の3.75μlのlの。
- 90分間、30℃でステップ3.2からの翻訳混合物をインキュベートします。ストア-20℃で製品を翻訳しました。
- 1段階のための組換えpT7CFE1-チスプラスミドDNAの3μL、ヌクレアーゼフリー水を2μl、反応ミックスを5μl、HeLa細胞溶解物12.5μlのとアクセサリータンパク質の2.5μLを添加することにより、転写および翻訳混合物25μlのを準備しますDNAテンプレートの人間の結合IVTタンパク質発現。
- 30℃で90分〜6時間のためのステップ3.4からの反応混合物をインキュベートします。 -20で翻訳産物を保存 °C。
発現された組換えタンパク質の精製4
- 精製混合物の100μlのを作るために翻訳産物の25μlに1×精製バッファー75μlのを追加します。
- 精製MIXTの100μlにニッケルキレート樹脂の100μlを添加しますURE。ウォッシュのNi-樹脂回のdH 2 O300μlのと結合バッファーを300μlを追加します。過剰のエタノールを除去するために、1分間14,000×gで樹脂と遠心分離機を再サスペンド。
- ステップからのニッケルキレート樹脂の4.2から100μLを精製混合物の100μlを添加して、室温で60分間混合物をインキュベートします。
- 1分間14,000×gで、混合物を遠心し、「フロースルー」と表示新しいチューブに上清を収集します。
- 1×洗浄バッファー（20 mMイミダゾール、pHが8で250 mMののNaH 2 PO 4、2.5 MのNaClとDH 2 O）を100μlで洗浄樹脂。 1分間14,000×gで遠心分離し、「洗浄」と表示された新たなチューブに上清を収集します。二回ステップ4.5を繰り返します。
- 1×溶出緩衝液100μl加える（pH8.0の100mMのイミダゾール、250mMののNa 2 PO 4、2.5MのNaClとのdH 2 O）樹脂と15分間インキュベートします。 1分間14,000×gで遠心分離します。二回溶出工程を行います。各時間は、「溶出液」として新たなマイクロ遠心チューブやラベルに上清を収集します。
- ステップ4.5で説明したように溶出した後、二回樹脂を洗浄。ストアは、を介して-20℃以下での洗浄及び溶出サンプルを流します。樹脂は、4℃で保存する必要があります。 SDS-PAGEおよびイムノブロッティング分析のために、各サンプルの30μlのを使用してください。
5.クマシー（ブラッドフォード）タンパク質アッセイ34
- 濃度の標準ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を調製20μgの/ mlのは、40μgの/ mlの（BSA20μlのを混ぜて（BSA（2 mg / mlの）とのdH 2 O90μlの10μlのをミックス）（2 mgの/ ml）およびのdH 2 O）の80μL、60μgの/ mlの（（2 mgのBSA（2 mg / mlの）とのdH 2 O）の70μL、80μgの/ mlの（BSA40μlのを混ぜ30μlのを混ぜます/ ml）およびのdH 2 O）、60μlの100μgの/ mlの（BSA（2 mg / mlの）を50μlとのdH 2 O）を50μl、160μgの/ mlの（BSA80μlのをミックスを混ぜる（2 mgの/ ml）をとDH20μlの2 O）と、200μgの/ mlの（BSAを100μl（2 mg / mlで）。
- メジャーステップ4.7からのフロースルー、洗浄および溶出液のサンプルの5μL。のdH 2 Oの95μLを追加
- ステップ5.1および5.2からの混合物にクマシーブルー試薬の5ミリリットルを追加します。その後、室温で20分間インキュベート10秒間パラフィルムとボルテックスでチューブをカバーしています。
- 分光光度計を使用して、ステップ5.3からのタンパク質のチューブ用の波長650nmでの光学密度（OD）を測定します。 OD読み取り対プロット濃度は、タンパク質濃度34を決定します。
6.ウェスタンブロッティング
- Pから分裂抽出物の5μlを添加します熱帯熱マラリア原虫 、 大腸菌の2μlを、組換えRhop-3蛋白質31を発現し、組換えタンパク質の5μlを、インビトロのヒト発現系およびタンパク質産物の10μl の 2段と1段を使用して表現チューブを分離するために、親和性方法を用いて精製しました。 可溶化したタンパク質サンプルを作るために20μlの最終容量のために各チューブにメルカプトエタノールを含有する電気泳動サンプルバッファーを加えます。 2分間チューブを沸騰させます。
- タンパク質を分離するために、10％SDS-PAGEゲル上に可溶化タンパク質試料をロードします。
- 2時間半乾燥ウエスタンブロッティングチャンバー内でゲルあたり35ミリアンペアの電流で電気泳動によりニトロセルロース紙（NCP）のSDS-PAGEゲルから分離したタンパク質を転送します。
- 2％の脱脂乳で転送以下のブロックのNCP。
- インキュベートは、1希釈し、以下のポリクローナル抗体とのNCPをブロック：ウエスタンブロッティングを行うために2％のミルクで100;ウサギ抗体Pの具体的な＃676 21 熱帯熱マラリア原虫メロゾイトrhoptries、Pの20特異的なマウス抗体ヨエリとP. Pの具体的なベルゲイメロゾイトrhoptries、抗血清＃685マウラーのための特定の熱帯熱マラリア原虫寄生虫液胞タンパク質、SERA（セリンリッチ抗原）22および抗体217; sの裂け目タンパク質PFMC-2TM 28。
- 1ものNCPをインキュベート100正常マウスおよびウサギ血清を希釈し、陰性対照としてSP2骨髄腫細胞からの培養上清（SCS）を費やしました。
- 4ºCO / Nでの抗体およびコントロールでのNCPをインキュベートします。
- 2％ミルクで1：1000ブロットを洗浄するNCP 4Xは、種とのNCPをバッファリングし、インキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合特異的二次抗体を1に希釈しました。
- ブロット緩衝液で洗浄するNCP 4倍。 30：;：インキュベートは、発色液A + B（メタノール10mlおよび3-クロロナフトール30mgを追加し、溶液Bは、1×ブロットバッファとH 2 O 2の30μLの50ミリリットルを追加溶液A）でのNCPを洗浄しました暗所で分。比色ウェスタンブロットの結果を分析します。
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Representative Results
特異的抗体との反応性を介して発現された組換えタンパク質の検証は、発現されたタンパク質の適切なフォールディングを確認する上で重要な最初のステップです。組換えマラリアタンパク質は、1つのステップと、インビトロのヒト無細胞発現系における2つの段階を用いて発現させました。組換えタンパク質をNiキレートアフィニティー法により精製されます。私たちはその後、組換えタンパク質を分離したSDS-PAGEのウエスタンブロッティングで全体メロゾイトrhoptriesに対する抗血清を使用していました。
図1は、PCRを1％アガロースゲルでPY17X_1139200、PY17X_1402200、PY17X_1366000、PY17X_0830000とPF3D7_1436300の遺伝子断片を増幅示します。 DNAバンドを切り出し、DNAを、DNA抽出スピンカラムで凍結することにより精製しました。
ゲノムDNAから増幅した正常マラリア遺伝子（ 表2に示される）pT7CFE-CHIS発現ベクターにクローニングしました。再増幅RECOからの遺伝子のmbinantプラスミドは、ベクター中のクローン化された遺伝子断片の存在を実証しました。タンパク質翻訳のために用いた発現系のフローチャートは、 図2に示され、図2Aおよび図2Bは、 インビトロのヒト無細胞発現系における 2段と1段IVT結合翻訳システムの段階的手順を示しています。 in vitroでのヒト無細胞発現系を用いて、 マラリア原虫の蛋白質の発現が成功rhoptry特異的ウサギ抗血清で確認しました。 図3Aに示されるように、組換えタンパク質はrhoptry特異的ウサギ抗血清＃676によって認識されました。先に示したように、発現された組換えタンパク質は、Pから寄生虫の液胞タンパク質に対する抗血清によって認識されませんでした熱帯熱マラリア原虫とP.ヨエリ発現されたタンパク質32に対するウサギ抗血清676の特異性を示しています。正常ウサギ血清（NRS）は、組換えタンパク質と反応しませんでしたインビトロのヒト細胞の無料発現系と1段階のIVT結合翻訳システム（ 図3B） で 2段を使用して翻訳。 マラリア原虫の組換えタンパク質の発現の成功は、ゲル内のヒスチジン染色およびニッケルHRP染色32などの異なる技術によって確認しました。発現されたタンパク質は、アフィニティー精製システムによって精製しました。精製は、（何列が使用されない）は、バッチ方式で行われます。技術は、100mMの60mMのイミダゾールの濃度を変えることにより最適化されます。溶出のための最適濃度は250 mMである。 図4は、翻訳されたタンパク質産物の25μlのから翻訳されたタンパク質の成功した精製を示す。 図4（a）は、マウラーの裂貫通タンパク質18の成功精製を示す。 図4Bは PF3D7_0925900、Pの成功精製を示しますマラリア原虫ヨエリ遺伝子PY17X_0830000の熱帯熱マラリア原虫オルソログ、A仮想タンパク質32。 図4Cは、タンパク質PY17X_1139200、仮想のニッケル樹脂ビーズを用いて、タンパク質と1×溶出緩衝液中の100mMのイミダゾールを含むアルマジロリピートの成功した精製を示します。精製後のタンパク質の収量は3.5μgの/25μlです。
P.の図1の増幅熱帯熱マラリア原虫とP.ヨエリ遺伝子。P.から増幅PFc14_0344、PF3D7_0925900、PF3D7_1361800、PY07482とPFA0680cwの遺伝子断片を1％アガロースゲルを示す臭化エチジウム染色PCR産物熱帯熱マラリア原虫のゲノムDNA。
ヒーラ浅の図2のフロー· チャート ED無細胞発現系。2ステップおよび in vitroヒト細胞フリーの発現系における 1ステップの両方の概略図。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
タンパク質発現の免疫ブロット図3確認全体 rhoptry特異的ウサギ抗血清＃676及び正常ウサギ血清を用いて発現された組換えタンパク質のウェスタンブロット分析。発現された組換えタンパク質と抗血清676の（A）反応性。 （B）正常ウサギ血清は、発現された組換えタンパク質と反応しませんでした。寄生虫液胞タンパク質は、組換えタンパク質32と反応しませんでした。hres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
翻訳産物のマイクロボリュームからのタンパク質の精製を図4。樹脂の親和性方法をキレート化ニッケルを用いて発現された組換えタンパク質の精製。発現されたタンパク質（翻訳）（A）PF3D7_0114100、（B）PY17X_0830000、及び（C）PY17X_1139200タンパク質は、ニッケルと共にインキュベートした-キレート樹脂を緩衝液および精製、結合緩衝液中のイミダゾールの非存在下でのニッケルキレート樹脂を用いて精製されます。インキュベーション後、ビーズを、遠心分離し、非結合タンパク質を分離し、ビーズを洗浄緩衝液で2回洗浄しました。結合した組換えタンパク質を二回ビーズを洗浄して溶出しました。翻訳されたタンパク質、洗浄液、溶出液とビーズ電気泳動試料緩衝液中で可溶化しました。イミダゾールは、洗浄液（20mMのイミダゾール）および溶出緩衝液（100mMのイミダゾールの）で使用しました。正常に認識された抗血清＃676を発現させ、精製された組換えタンパク質。正常ウサギ血清は、 図3Bのショーとして発現されたタンパク質とは反応しなかった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 特徴 | ヒト無細胞発現システム | コムギ胚芽無細胞発現系 | ウサギ網状赤血球発現系 | 大腸菌溶解物のタンパク質発現系 |
| 時間 | 3時間で転写および翻訳を完了 | 20時間 - 10のための6時間および翻訳に転写 | RNAが翻訳を単離することがありすると90分かかります | ドン1時間の電子 |
| 適切なベクター | T7ベクターとすることができます | SP6ベクター | T7を使用することができます | T7を使用することができます |
| 適切な規模 | 実験室での合成に適しました | 大規模タンパク質合成のために使用 | 実験室および免疫の研究のための適切な | 実験室および免疫の研究のための適切な |
| エキス | HeLa細胞を含まない抽出物 | 小麦抽出物の胚 | 網状赤血球の細胞抽出物 | 大腸菌細胞溶解物の抽出物 |
| 変更 | 同時翻訳および翻訳後修飾 | 翻訳後修飾 | 共同翻訳後修飾 | 翻訳後修飾 |
| タンパク質のサイズは、翻訳します | 250 KDaの8キロダルトン | 220キロダルトン | 250キロダルトン | <TD> 200キロダルトン|
| コドン最適化 | タイト | タイト | 緩いです | タイト |
| ジスルフィド結合形成 | はい | はい | いいえ | はい |
| 産出 | 収量が低いです | 高利回り | 低降伏 | 非常に高い収率 |
| コスト | 10の反応のための130.00ドル | 10の反応のための173.00ドル | 5反応のための136.00ドル | 8反応のための159.00ドル |
| タンパク質濃度 | 反応あたり3〜5μgの | 100μg/ mlの | 100μg/ mlの | 500 / mlの |
| リファレンス | 32、30 | 7、28、29 | 7 | 7、24、25 |
マラリア研究表1.無細胞発現系。セルの比較フリー発現システムは、現在、マラリア研究に使用しました。
| 遺伝子ID | オルソログID | タンパク質 | PCRのためのプライマー配列 |
| PF3D7_1436300 | トランスロコン成分 | CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG | |
| GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC | |||
| PF3D7_0114100 | PFMC-2TMマウラーの裂タンパク質 | GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA | |
| CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA | |||
| PY17X_0830000 | PF3D7_0925900 | 仮想タンパク質 | GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA |
| CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60; | |||
| PY17X_1139200 | PF3D7_1361800 | 仮想タンパク質 | GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA |
| CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT |
研究では、表2 Rhoptry遺伝子。本研究19で発現の異なる遺伝子のプライマー。
| 素材の名前 | 会社 | カタログ番号 | 説明 |
| インビトロのヒト細胞表現の自由システム32 の 2段階 | サーモフィッシャー | 88856 | 中止しました。常に-80℃で保存してください。ぬるま湯で解凍しないでください。 |
| インビトロ結合翻訳系における 1ステップ | サーモフィッシャー | 88860 | 常に-80℃で保存してください。番目はいけませんぬるま湯でAW。 |
表3ヒーラ基づく無細胞発現系。タンパク質の発現のために使用されるキット。
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Discussion
インビトロのヒト細胞の無料発現系および精製を2段階を使用して、タンパク質の発現の成功のための重要なステップは次のとおりです。1）増幅の成功とpT7CFE·チスのプラスミドベクターへの遺伝子のクローニング; 2）30°CのでRNAを転写。 RNA分解酵素阻害剤の存在下で30℃でのタンパク質の3）翻訳; 4）ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで分析した結果を）Niおよび5でコーティングされた樹脂ビーズを用いて、親和性に基づく精製プロトコルを開発します。 1ステップIVT結合タンパク質翻訳系を用いて、タンパク質の発現の成功のための重要なステップは次のとおりです。1）増幅の成功とpT7CFE·チスのプラスミドベクターへの遺伝子のクローニング; 2）30℃での転写およびタンパク質の翻訳。 3）ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで分析した結果を）Niおよび4で被覆された樹脂ビーズを用いて、親和性に基づく精製プロトコルを開発します。
現在LYは、無細胞発現系は、組換えマラリアタンパク質を発現するために使用されます。マラリアタンパク質を発現する無細胞発現系の重要な特徴は、豊かな遺伝子AT復号化する能力、長い翻訳休止の欠如、反復アミノ酸配列の成功した発現、グリコシル化機構の欠如、および遺伝子の切り捨てを制御するプラスミドの能力です。本研究では、 インビトロでのヒト無細胞発現系32 における二段階及びP.の発現のためのワンステップIVT結合翻訳システムの使用を実証しますP.の熱帯熱マラリア原虫の遺伝子オルソログヨエリメロゾイトrhoptry遺伝子を表1に示すように、精製プロトコルは、1段階およびインビトロのヒト無細胞発現系における 2段階から得られた組換えタンパク質のマイクロボリュームを精製するために開発され、最適化されました。 4 P.熱帯熱マラリア原虫の遺伝子は、膜貫通疎水性タンパク質、予測仮想的なARMリピートをPF3D7_0114100タンパク質PF3D7_1361800と親水性タンパク質PF3D7_0925900、2段階インビトロのヒト無細胞発現系における 1ステップを使用して発現させました。精製されたタンパク質の収率を測定しました。それは、2つの膜貫通ドメインを有する内在性膜タンパク質であり、我々はin vitro発現システムが正常に貫通タンパク質を発現し、精製の 容易さを可能にすることができるかどうかを決定することに興味を持ったので、タンパク質PFMC-2TMは、これらの研究に含まれていました。
両方の一段階と二段階の発現系における主な違いは、2つのステップの発現系は、安定したmRNAは、転写および翻訳反応に添加されたmRNAに依存するシステムがあることである。これとは対照的に、インビトロ共役転写における一工程/翻訳システムは、反応中のタンパク質の同時翻訳が続く連続転写とmRNAの供給を必要とします。どちらも1段階IVTの転写/翻訳結合電子XPRESSIONシステムおよび in vitroのヒト無細胞発現系における 2段階は、高分子量のタンパク質の発現について試験しました。両方のシステムは、低分子量の組換えタンパク質を発現させることに成功しました。 1段階の発現系では、翻訳反応混合物中のタンパク質との抗体の交差反応性が観察されました。交差する抗体と反応する特定のタンパク質が不明であり、さらなる調査が必要です。高分子量タンパク質の発現は、1段階及び2段階のシステムの両方を使用して失敗しました。精製プロトコールは、異なる溶解度特性の組換えタンパク質の精製microvolumesのために開発された1段階およびインビトロのヒト無細胞発現系における 2段階の両方を使用して発現しました。タンパク質が正常に精製し、I 1段階で翻訳されたときインビトロでのタンパク質翻訳系および25μlのあたり1.5μgの2段階を用いて表現するとき得られた収率は25μLあたり3.5μgのでしたVTタンパク質発現系。 37キロダルトン、18キロダルトンで変化する低分子量タンパク質の発現は、再現性があり、簡単です。しかし、高分子量の発現は、タンパク質の切断をもたらします。によりクローニングされたDNAについて得られたmicrovolumesに、PCR増幅産物は、クローンを確認するために使用されました。無細胞発現系を用いて、高分子量タンパク質を発現させるための潜在的な障害は、反応におけるATPの高い濃度に起因EIF2のαサブユニットのリン酸化を一定とすることができます。これは、潜在的に無細胞発現系10における大きなタンパク質の合成の間にタンパク質合成の伸長に影響を与えるシステムで翻訳開始を阻害します。
ここで説明するプロトコルは、タンパク質の発現のための最適化条件によって影響を受けないれます。どちらの遺伝子コドンもプラスミドは、タンパク質の発現のために最適化されず、タンパク質リフォールディングが必要とされませんでした。このシステムは、pを表します3時間およびタンパク質の精製におけるroteinsは、予防接種またはペプチド配列決定のための組換えタンパク質の処理として、さらに下流の適用を可能にする、2時間で得ることができます。複数の組換えタンパク質は、潜在的なワクチン候補分子の免疫血清のスクリーニングおよび同定のためのマイクロアレイフォーマットを使用して、HeLa細胞を含まない系で表すことができます。また、潜在的に免疫原性タンパク質は、発現をスケールアップして得られた画面と選択されたタンパク質を介して同定することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-step in vitro human cell free expression system | Thermo Fisher | 88856 | Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water |
| 1-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at RT |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4 °C. |
References
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