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Biology

의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템 Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

셀 기반 시스템에서 말라리아 단백질의 발현은 도전 남아있다. 우리는 HeLa 세포에서 말라리아 재조합 rhoptry 단백질을 표현하는 두 단계 및 (체외 번역) 한 단계 IVT 세포 무료 발현 시스템을 보여줍니다. 우리 rhoptry 단백질을 정제하는 니켈 계 수지 친화 정제 시스템을 사용한다.

Abstract

말라리아는 중요한 글로벌 이환율과 사망률을 발생합니다. 어떤 일상적인 백신은 현재 사용할 수 없습니다. 백신의 부족에 대한 주요한 이유 중 하나는 적합한 백신 후보를 식별하는 도전이다. 말라리아 단백질은 원핵 생물과 진핵 세포 기반 발현 시스템이 제대로 감소 면역 원성에 이르는 부적절한 폴딩, 일반적으로 불용성 당화 및 겪게된다 사용하여 표현. 밀 배아, 토끼 망상 적혈구 용 해물 및 대장균 파쇄 무 세포 발현 시스템은 현재 말라리아 단백질의 발현을 위해 사용된다. 그러나, 발현 시간과 단백질의 부적절한 당화의 길이는 여전히 과제로 남아. 우리는 "시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템"이라 헬라 계 무 세포 발현 시스템을 이용하여 시험 관내에서 변형체 단백질의 발현을 보여준다. 2 헬라 세포 기반 표현의 자유 시스템은 75 분, transcrib의 3 μL에서의 mRNA를 전사ED의 mRNA는 90 분에 단백질을 변환하기에 충분하다. 1 단계의 발현 시스템은 전사 및 번역에 결합 발현 시스템이고; 전사 및 공동 번역은 3 시간에 발생합니다. 프로세스는 추가적인 에너지를 제공하여 6 시간 동안 연장 될 수있다. 2 단계 발현 시스템에서 mRNA를 먼저 전사 된 후 단백질 발현을위한 번역, 혼합 하였다. 우리는 말라리아 단백질을 표현하는 방법에 대해 설명합니다; 소수성 PF3D7_0114100 마우어의 갈라진 - 2 트랜스 (PfMC-2TM) 단백질, 친수성 ​​PF3D7_0925900 단백질 및 헬라 계 무 세포 발현 시스템을 이용하여 단백질을 함유 PF3D7_1361800 딜 반복. 단백질은 2 단계 및 1 단계 식 전략을 이용한 마이크로 부피로 표현된다. 친 화성 정제 방법이 또한 기재되어있는 시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템을 이용하여 발현 된 단백질의 25 μL를 정화한다. 단백질의 수율은 브래드 포드 분석에 의해 결정되고 표현정제 된 단백질은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 표현 재조합 단백질은 면역, 면역 분석 및 단백질 서열 분석에 사용될 수있다.

Introduction

말라리아 연구에서 원핵 또는 진핵 세포 기반 시스템을 사용하여 면역 원성 단백질의 발현 도전 남아있다. 변형체 게놈과 알 수없는 포스트 번역 메커니즘 14,7의 AT의 풍요 로움은 항체 생산 및 백신 연구에 적절하게 접어 면역 원성 단백질을 획득과 관련된 어려움에 기여한다. 대장균 등의 원핵 시스템은 재조합 단백질 발현을 위해 사용되어왔다. 원핵 생물 시스템은, 효과적인 저렴한 비용으로 재조합 단백질의 높은 수율을 생산 여러 클로닝 벡터를 가지고있다. E. 호스트 대장균 세포는 변형이 용이하고 신속하게 세포 성장. 그러나, 이러한 시스템은 원핵 아미노산 치환, 번역 후 변형, 봉입체 (24) 내의 오염, 제품 및 이종 재조합 단백질의 축적의 위험 부족 등 한계가있다.

안에Mehlin 등의 알에 의해 연구. (2006) 1000 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 표현 하였다. 발현 된 단백질의 약 7 %가 용해 (14)이었다. 관찰 불용성 유전자의 바이어스 특성 및 풍부한 게놈 14의 변형체로 이상적으로 사용되는 코돈 고주파 때문이다. 이 문제를 극복하기위한 대안적인 전략은 플라스미드 또는 희귀 코돈 또는 3 주파수 일치 코돈 인식의 tRNA를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 개발되었다. 비록 이러한 최적화를 수행 한 후, 단백질의 매우 작은 부분, 수용성 활성 면역 원성 및 14로 표현된다. 무 세포 발현 시스템은 리보솜, 개시 요인, 신장 요인 (번역 인자)의 tRNA 및 아미노 아실 tRNA의 합성 효소 등의 전사 및 번역에 필요한 모든 구성 요소가 포함되어 있습니다. 두 전사 및 번역 반응은 한 단계 절차 11,29에 결합된다. transcrimRNA의 적당량은 상이한 튜브 11,29 병진 기계와 함께 배양하기 전에 ption 반응 관에서 수행된다. 이러한 방법 변형체 SP. 단백질 발현에 성공하지만, 주요 단점은 약 22 시간이며 29 단백질 발현을위한 시간의 길이이다. 또한, 프로토콜들 (29)에 포함 용품의 고가 성분 제제에서 노동 집약적 파쇄의 제제와의 불일치는, 이러한 시스템은 얻기 어려운 만든다. 무 세포 발현 시스템의 개발을위한 연구의 주요 초점은 빠른 유전자 변형, 높은 농도 및 정직 해물 준비 1 빠른 수율 등의 요인에 따라 달라집니다.

효모, 포유 동물 세포주, 배큘로 바이러스 매개 된 발현 시스템, 테트라 하이 메나의 thermophilia, Dictyostelium의 discoideum 기생 발현 시스템 SU 진핵 시스템리 슈만 편모충 같은 CH 재조합 단백질 발현 7에 사용되어왔다. 진핵 시스템 계통 관계를 공유하고, 따라서 또한 글리코 실화, 아 실화, 이황화 결합 형성, 샤페론 상호 작용, 단백질 분해 및 서브 셀룰러 구획화 등의 특성을 공유한다. 진핵 생물의 단백질 분비 이벤트는 축적을 방지하고 발현 시스템 (13)에 대한 독성을 감소시킨다. 그들은 대규모 단백질 발현 및 높은 수율을 얻는 4에 적합한 효모 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 두 P. 원충의 단백질 PfCP-29과 Pvs25는 효모 시스템 (4)를 사용하여 제작되었다. 그러나, 대부분의 단백질의 합성에 중요한 결점이 불규칙 N과 O 글리코 실화 패턴, 부적절한 폴딩과 그 나라의 형태 4에서 단백질을 절단했다.

재조합 단백질의 합성을위한 포유 동물 세포의 사용은 노동 집약적이며 expen되고안정적인 재조합 세포주 4 유지 시브. 따라서, 포유 동물 세포는 단백질 시그널링 단백질 상호 작용 및 기생충 호스트 상호 작용 분석을 위해 한정되고, 또한 DNA 백신 4를 테스트. 본원에 기술 된 인간 DNA와 mRNA의 생체 외 단백질 발현 무 세포계는 3 시간에 단백질을 발현하는 헬라 세포 유래 포유류 기반 시스템이다. 단백질 식별 및 정화를 촉진 C- 말단 태그를 pT7CFE1-cHis 발현 벡터를 사용하여 표현했다. 헬라 기반 시스템함으로써 번역 시스템의 효율 향상, 번역 개시 인자 및 번역 조절로 보충된다. 단백질은 빠르게 번역 스크리닝 검증 및 다양한 면역 및 구조 (15) 애플리케이션에서 사용하기 위해 처리 될 수있다.

밀 배아와 토끼 망상과 같은 진핵 세포 - 표현의 자유 시스템은 현재 VAR의 표현에 사용되는변형체 단백질 11,29 포함 빚을내는 진핵 세포 단백질. 또한, E. 대장균 계 무 세포 시스템은 또한 진핵 단백질 발현을 위해 사용된다 (11). 표 1은 시스템의 기능뿐만 아니라 단백질 발현 시스템을 사용의 용이성을 비교함으로써 다른 무 세포 발현 시스템을 요약 한 것이다. 다른 사람들에 비해 인간의 무 세포계 포스트 공동 번역 후 변형을 수행 할 수있는 능력을 보유하고 덜 비싸다. 코돈 최적화가 가능하며, 모든 반응은 3 시간으로 수행 될 수있다. 헬라 시스템은 실험실 설정에서 단백질 합성을위한 번역 시스템에 이상적이다.

다른 무 세포 시스템에 비해 인간의 무 세포 발현 시스템의 큰 장점은 다른 기관 및 조직에서 유래 된 여러 세포주의 이용이다. 셀 무료 시스템의 여러 종류는 셀 라인에 따라 설계 할 수있다. 추출물포유 동물 세포 유래의 S는 다른 무 세포 발현 시스템보다 많은 단백질을 합성하기 위해 더 높은 효율을 갖는다. 이 무 세포 발현 시스템은 또한 마이크로 어레이 (30)로 진단 및 단백질 특성 애플리케이션에 사용될 수있다. 인기 인 HeLa 세포주는 가장 널리 단백질 33의 발현을 수행하기 위해 사용된다. 된 HeLa 세포주에서 소포체는 번역 후 변형 글리코 실화 활성 (33)의 부재를 초래 낙후이다. 그러나,이 시스템은 또한 글리코 실화 변형체 포스트 번역 변형 29 부족으로 변형체 단백질 합성에 유리할 것으로 생각된다. 헬라 세포 자유로운 전사 번역 프로토콜 저렴 수행하기 쉬운 단백질 정제 및 하류 어플리케이션을위한 준비, 90 분으로 표현 될 수있다.

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Protocol

기생충 세포 배양 1. 준비, 기생충 펠렛의 컬렉션

  1. 1 L에 RPMI-1640 분말 10g, 겐타 마이신 황산염 66 ㎎, 2g 중탄산 나트륨, 5.9 g의 HEPES 완충액, 50 mg을 하이포크 산틴 3.8 g의 덱 스트로스를 추가하여 RPMI-1640-HEPES 매체를 준비 멸균 DH 2 O. 1 L의 증류수 모든 분말이 용해 될 때까지 테이블 마그네틱 교반기를 사용하여 혼합. 0.22 μm의 필터를 사용하여 미디어의 미세 여과를 수행합니다. 멸균 병에 미디어를 보관합니다.
  2. 감염되지 않은 (신선한) 워시 RPMI를 사용하여 A + 적혈구를 입력합니다. 적혈구 용적률 5 % (9.5 ㎖의 RPMI + 10 % 인간 혈청 세척 신선한 적혈구 0.5 ml)로 준비한다.
  3. 15 % 인간 혈청 + RPMI (인간 혈청 15 ㎖의 RPMI의 85 ml)을 기생충의 재배를 시작합니다. 10 % 인간 혈청 및 RPMI (인간 혈청 10 ㎖와 RPMI 90 ml)을 적혈구에서 기생충의 배양을 계속합니다.
  4. 문화 P. 원충 (3D7 및 FCR-3 균주) 유형5 % 적혈구 용적률 20 %의 기생충 배양 접시에서 또는 75cm 3 문화 플라스크에서 A + 인간의 적혈구. 트레와 젠슨 촛불 항아리 (26)의 방법에 따라 체외에서 배양을 유지한다. 또는, 문화가 9.5 %의 CO 2 및 3.4 % N2 가스 유지 37 ° C에서 인큐베이터에 유지한다. 문화 P. 원충은 RPMI-1640 배지 HEPES 10 % 인간 혈청.
  5. P. 동기화 65 % 퍼콜 문화 (퍼콜 + 인간 혈청이없는 RPMI-1640의 35 ㎖를 65 ㎖)에 추가하여 원충 문화 (27)을 집중한다.
  6. 3 층 결과 5 분 2500 XG에서 퍼콜와 문화 농축 원심 분리기. 조심스럽게, 전송 피펫을 사용하여 무균 조건 (27)에서 별도의 튜브에 중간 계층 전송에서 schizonts을 격리 할 것.
  7. 5 분 7500 XG에서 원심 분리하여 초과 퍼콜을 제거하기 위해 두 번 10 % 인간 혈청 + RPMI-1640와 고립 된 문화를 씻으십시오. 디상층 액을 무균 조건 (27)에서 각각의 시간을 scard.
  8. 동기화 된 피를 배양 계속 10 % 인간 혈청 + 27 RPMI-1640 열대열 schizonts.
  9. 10 mM 트리스 pH를 8.8로 변형체에게 -infected 적혈구를 치료하고 15 분 23 15000 XG에 원심 분리하여 schizonts를 수집합니다. 펠릿에 단백질 분해 효소 억제제 (아프로 티닌) 5 ㎕를 첨가 한 다음 -70 ℃에서 저장 기생충 펠렛. 단백질 추출, 게놈 DNA를 분리하고 RNA 분리에 대한 기생충 펠렛을 사용합니다.

2. 플라스미드 벡터를 준비

  1. P.에서 게놈 DNA를 분리 약 20 %의 기생충의 문화에서 준비 원충 schizont 펠렛.
  2. , microcentrifuge 관에서 펠렛하여 pH 7.6의 10 mM이 트리스 - 염산, 50 mM의 EDTA의 pH 8.0, 0.1 % SDS 1 ㎎ / ㎖ 프로 테 K, 600 μl를 추가 26 G 바늘에 부착 된 1 ML의 주사기를 사용하여 펠렛을 균질화. 주사기 충전 대체펠릿 혼합물 microcentrifuge 관으로 20 배와 비우기. 50 ° C의 물을 욕조에 튜브를 포함하는 균질의 O / N을 품어.
  3. P + C 600 μL (페놀의 300 μL 클로로포름 300 μL) 균질 펠릿에 추가하여 클로로포름 (P + C) 추출 - 페놀을 수행합니다. 캡 튜브는 단단하고 튜브 종단을 반전시킴으로써, 혼합물을 격렬하게 흔들어. 2 분 동안 14,000 XG 및 원심 분리기 튜브 새로운 microcentrifuge 관에 마이크로 피펫을 이용하여 상부 수용액을 모은다. 두 번이 단계를 반복합니다.
  4. 단계 2.1.2에서 새 튜브에 수성층에 클로로포름 600 μl를 추가합니다. 2 분 동안 14,000 XG에 10 초 원심 분리 용 튜브를 소용돌이. 마이크로 피펫으로 상부 수층을 측정 새로운 마이크로 원심 튜브로 옮긴다.
  5. 수성 누워 (수층 300 μL를 5 M 아세트산 나트륨 pH를 이소프로판올 5.5 + 330 μL의 30 μL를 추가하는 경우) 5 M 아세트산 나트륨 pH가 5.5, 0.1 부피의 이소프로판올을 추가 한 권단계 2.1.3에서 어. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션 튜브.
  6. DNA 펠렛을 침전을 10 분 동안 14,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 DNA로부터 과도한 소금을 제거하기 위해 70 % 에탄올 100 ㎕ (에탄올 70 μL와 DH 2 O 30 μL)와 펠렛을 씻는다. -20 ° C에서 DH 2 O 50 μL에 보관 된 DNA.
  7. P.의 증폭을 위해 수동으로 앞으로 디자인과 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 역 또는 표 2에 나타낸 바와 같이 원충 유전자 PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 및 PF3D7_0114100 이전 프로테옴 연구 발현 플라스미드 pT7CFE1-CHis의 다중 클로닝 사이트 내로 유전자 서열의 복제를 허용하기 위해 적절한 제한 부위를 가진 (16, 18)에서 식별.
  8. 추가하여 50 ㎕의 반응 혼합물을 만들기; 고립 P. 5 μL 원충 게놈 DNA, 10 배 버퍼의 5 μL,의 MgCl 2의 5μL, 정방향 프라이머의 1.5 μL, 1.5 μL역방향 프라이머, T7 DNA 중합 효소 0.5 μL와 DH 2 O 31.5 μL 및 변성 8 분 동안 94 ° C에서 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는, 연장 된 1 분 30 초 동안 50 ° C 및도 9를 72 ° C 표 1에 기재된 유전자를 증폭하기위한 어닐링과 탈 변성 분.
  9. 1 % 아가 로스 겔 (1 g의 아가 및 트리스 아세테이트 100 ml의 EDTA (TAE) 버퍼) (32)에 별도의 PCR 제품.
  10. , 아가 로스 겔로부터 PCR 증폭 된 DNA 밴드를 잘라 DNA 겔 추출 스핀 컬럼에서 DNA를 함유하는 겔 슬라이스를 넣고 5 분 동안 -20 ℃에서 동결. 5 분 동안 14,000 XG에서 냉동 젤 슬라이스와 원심 분리기에 이소프로판올 100 μl를 추가합니다.
  11. 마이크로 피펫을 사용하여, 수성 관류 단계 2.5에서 포집 관에서 필터링을 측정하고 새로운 튜브로 옮긴다. 5 분 동안 14,000 XG에서 5 M 아세트산 나트륨과 원심 분리기의 0.1 권을 추가합니다. 뜨는을 취소하고 토륨하는 DH 2의 O를 10 μl를 추가전자 DNA 펠릿.
  12. 플라스미드 3 μL 각 튜브 PCR 유전자 제품의 5 μl를 첨가하여 두 가지 별개의 튜브 pT7CFE1-CHis 발현 벡터 및 (2.6)로 정제하여 DNA 단편 다이제스트. 각 튜브에 특정 제한 효소 1 μL, 반응 버퍼의 2 μL와 DH 2 O 14 μl를 추가
  13. 소화 플라스미드의 3 μL, 소화 DNA 단편의 5 μL, 10 배 리가 버퍼의 2 μL, 리가의 1 μL 및 microcentrifuge 관에서 DH 2 O 9 μl를 추가합니다. 12 ° CO / N에 품어.
  14. pH가 5.5 에탄올 2 부피에서 3 M 아세트산 나트륨 0.1 부피 추가 단계 2.14에서 튜브 (검색 결찰 튜브 부피 인 경우 20 ㎕의 3 M 아세트산 나트륨 에탄올 + 44 μL의 2 μL를 추가). 잘 혼합하고 15 분 동안 -20 ° C에서 품어.
  15. 15 분 동안 14,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 마이크로 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다.
  16. 70 % 에탄올 (T)의 100 μl를 추가단계 2.10에서 펠렛 오. 5 분 동안 14,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다. DNA 펠릿에 뉴 클레아없는 물 10 μl를 추가합니다.

시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템에서 사용하기 3. 단백질 발현

  1. 재조합 pT7CFE1-CHis 플라스미드 DNA의 2 μL, 5 배의 전사 버퍼 4 μL, NTP 믹스의 4 μL, T7 RNA 중합 효소의 2 μL 및 뉴 클레아없는 물 8 μL 2 단계를 측정하여 전사 혼합물의 20 μl를 준비 DNA 템플릿을 사용하여 체외 단백질 발현에 인간. 마이크로 원심 튜브에 구성 요소를 혼합하고 수조에서 30 ° C에서 75 분 동안 배양한다.
  2. 전사 액 2 μL를 취하여 헬라 세포 용 해물 12.5 μL, 부속 단백질 2.5 μL, 염 용액 1 ㎕를, 아미노산의 0.5 μL -Met, 아미노산의 0.5 μl를 함유 번역 액 23 μL에 추가 -Leu, 181]의 RNAse 억제제 (L), 에너지 믹스 1.25 μL 및 클레아없는 물 3.75 μL.
  3. 90 분 동안 30 ° C에서 3.2 단계에서 번역 된 혼합물을 인큐베이션. 스토어 -20 ° C에서 제품을 번역했다.
  4. 1 단계 재조합 pT7CFE1-CHis 플라스미드 DNA의 3 μL, 클레아없는 물 2 μL, 반응 혼합물의 5 μL, 헬라 해물 12.5 μL 소품 단백질, 2.5 μl를 첨가하여 전사 및 번역 혼합물 25 μl를 준비 DNA 템플릿에 대한 인간의 결합 IVT 단백질 발현.
  5. 30 ° C에서 90 분 내지 6에 대한 3.4 단계에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 번역 제품에서 보관 -20 ° C.

표현 (4) 재조합 단백질의 정제

  1. 정화 혼합물 100 ㎕를 만들기 위해 번역 제품의 25 μL에 1X 정화 버퍼의 75 μl를 추가합니다.
  2. 정화 mixt 100 ㎕에 니켈 킬레이트 수지 100 μl를 추가URE. 워시 니켈 수지를 두 번 DH 2 O의 300 μL와 결합 버퍼의 300 μl를 추가하여. 과량의 에탄올을 제거하기 위해 1 분 동안 14,000 XG에서 수지와 원심 분리기를 다시 일시 중지합니다.
  3. 단계에서 니켈 킬레이트 수지의 4.2-100 μl를 정화 혼합물의 100 μL를 추가하고 실온에서 60 분 동안 혼합물을 품어.
  4. 1 분 14,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기와 "를 통해 흐름"으로 표시 신선한 튜브에 뜨는를 수집합니다.
  5. 1X 세척 버퍼 100 ㎕ (20 mM의 이미 다졸, 250의 pH 8에 mM의의 NaH 2 PO 4, 2.5 M의 NaCl과 DH 2 O)와 세척 수지. 1 분 14,000 XG에 원심 분리기와 "세탁"이라는 신선한 튜브에 뜨는를 수집합니다. 단계를 반복 4.5 배.
  6. 1X 용출 완충액 100 μL 추가 (PH 8.0, 100 mM의 이미 다졸, 250 mM의 나트륨 2 PO 4, 2.5M 염화나트륨 및 DH 2 O)를 수지와 ​​15 분 동안 배양한다. 1 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. 두 번 용출 단계를 수행합니다. 각각의시간은 "용출액"신선한의 microcentrifuge 튜브 및 레이블에 상층 액을 수집합니다.
  7. 4.5 단계에 설명 된대로 용출 후, 두 번 수지를 씻는다. 스토어는 -20 ° C 이하에서를 통해, 세척 및 용출 샘플 흐름. 수지는 4 ° C에서 저장해야합니다. SDS-PAGE 및 면역 분석을위한 각 샘플의 30 μl를 사용합니다.

5. 쿠마 (브래드 포드) 단백질 분석 (34)

  1. 농도 표준 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 준비 20 ㎍ / ㎖를 40 ㎍ / ㎖ (BSA 20 μL를 혼합 (BSA (2 ㎎ / ㎖) 및 DH 2 O 90 μL의 10 μL를 혼합) (2 mg의 / ml) 및 DH 2 O) 80 μL, 60 ㎍ / ㎖ ((2 mg의 BSA (2 ㎎ / ㎖) 및 DH 2 O) 70 μL, 80 ㎍ / ㎖ (BSA 40 μL를 혼합하여 30 μL를 혼합 / ml) 및 DH 2 O) 60 μL를 100 μg의 / ㎖ (BSA (2 ㎎ / ㎖) 50 μL 및 DH 2 O) 50 μL, 160 ㎍ / ㎖ (BSA의 80 μL를 혼합하여 혼합 (2 mg의 / ml) 및 DH 20 μL2 O), 200 μg의 / ㎖ (100 ㎕ BSA (2 ㎎ / ㎖).
  2. 측정 단계 4.7에서 흐르는, 세척 및 용출 샘플의 5 μL. DH 2 O의 95 μl를 추가
  3. 단계 5.1 및 5.2의 혼합물에 쿠마 푸른 시약의 5​​ ML을 추가합니다. 초 후 실온에서 20 분 동안 품어 10 파라 필름과 소용돌이 튜브를 커버.
  4. 분광 광도계를 사용하여, 단계 5.3에서 단백질 튜브 650 nm의 파장에서의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. OD 판독 대 플롯 농도는 단백질 농도를 결정한다 (34).

6. 웨스턴 블로 팅

  1. P.에서 schizont 추출물의 5 μl를 추가 원충은 대장균 2㎕의 재조합 Rhop-3 단백질 (31)을 발현하는 재조합 단백질의 5 μL 튜브를 분리하는 친화 법을 이용 2 단계 및 시험 관내 인간 발현 시스템에서 1 단계와 단백질 제품의 10 μL로 정제하여 표현. 용해 된 단백질 시료를 만들기 위해 20 μL의 최종 볼륨에 대한 각각의 튜브에 전기 영동 샘플 버퍼 포함 머 캅토 에탄올을 추가합니다. 2 분 동안 튜브를 끓인다.
  2. 단백질을 분리하기 위해 10 % SDS-PAGE 젤 상에 가용화 된 단백질 시료를 적재.
  3. 2 시간 반 건조 웨스턴 블로 팅 챔버에서 젤 당 35mA 전류에서 전기 영동에 의해 니트로 셀룰로오스 종이 (NCP)에 대한 SDS-PAGE 젤에서 분리 된 단백질을 전송합니다.
  4. 2 % 무 지방 우유와 함께 전송 다음 블록의 NCP.
  5. 품어 1 희석 한 다음 클론 항체와의 NCP를 차단 : 웨스턴 블롯을 수행하기 위해 2 % 우유 (100); 토끼 항체 (P)에 대한 특정 # 676 (21) 원충 merozoite rhoptries, P. 20 특정 마우스 항체 yoelii 및 P. 피에 대한 특정 berghei의 merozoite의 rhoptries, 항혈청의 # 685 마우어 특정 원충 parasitophorous 공포 단백질, 세라 (세린 풍부한 항원) (22)와 항체217;의 갈라진 단백질 PfMC-2TM (28).
  6. 1도의 NCP을 품어 : 100 희석 정상 마우스와 토끼의 혈청 및 SP2 골수종 세포에서 소비 배양 상청 (SCS)와 같은 부정적인 컨트롤을.
  7. 4 ºC O / N에서 항체와 컨트롤의 NCP를 품어.
  8. 오 씻을의 NCP 배는 버퍼와 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 결합 종 특정 차 항체와의 NCP를 품어 1 희석 : 2 % 우유 (1000).
  9. 오 버퍼와 세척의 NCP 4 배. 인큐베이션은 발색 용액의 NCP 세정 + B (용액 A : 버퍼 1X 블롯 50ml를 추가하고 H 2 O (2)의 30 μL; 용액 B는 메탄올 10 ㎖ 및 3- 클로로 나프톨 30mg을 추가) 30 어둠 속에서 분. 비색 웨스턴 블롯 결과를 분석합니다.

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Representative Results

특정 항체와의 반응성을 통해 발현 된 재조합 단백질의 유효성이 발현 된 단백질의 적당한 폴딩을 확인하는 중요한 첫 단계이다. 재조합 말라리아 단백질은 하나의 단계 및 시험 관내 인간 세포 무료 발현 시스템의 두 단계를 사용하여 표현 하였다. 재조합 단백질 정제 니켈 킬레이트 친 화성 방법입니다. 우리는 다음 SDS-PAGE 분리 된 재조합 단백질의 서쪽 블로 팅에서 전체 merozoite의 rhoptries에 대한 항혈청을 사용했다.

그림 1은 1 % 아가 로스 젤에서 PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 및 PF3D7_1436300의 PCR 증폭 된 유전자 단편을 보여줍니다. DNA 밴드 절제하고, DNA는 DNA 추출 스핀 열에서 동결로 정제.

게놈 DNA에서 (표 2) 성공적으로 증폭 된 유전자는 말라리아 pT7CFE-CHis 발현 벡터에 클로닝 하였다. 다시 증폭 RECO에서 유전자의mbinant 플라스미드 벡터에 클로닝 된 유전자 단편의 존재를 입증 하였다. 단백질 번역을 위해 사용되는 발현 시스템의 흐름도.도 2에 도시 된도 2a 및도 2b는 체외 인간 무 세포 발현 시스템에서 2 단계 및 1 단계 IVT 결합 번역 시스템의 단계 현명한 절차를 도시한다. 시험 관내에서 인간의 무 세포 발현 시스템을 이용하여 변형체 단백질의 성공적인 발현 rhoptry 특정 토끼 항혈청에 의해 확인 하였다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 재조합 단백질 rhoptry 특정 토끼 항혈청 번호 (676)에 의해 인식되었다. 이전과 같이 표현 재조합 단백질은 경찰에서 parasitophorous 공포 단백질에 대한 항혈청에 의해 인식되지 않았다 열대열 및 P. yoelii 발현 된 단백질 (32)에 대한 토끼 항혈청 676의 특이성을 보여주는. 정상 토끼 혈청 (NRS)의 재조합 단백질과 반응하지 않았다체외 인간 세포 무료 발현 시스템 1 단계 IVT 결합 번역 시스템 (그림 3B)에서 2 단계를 사용하여 번역. 변형체 재조합 단백질의 성공적인 발현은 인 - 겔 히스티딘 염색 및 니켈 HRP 32 염색 같은 다른 기술들에 의해 확인되었다. 발현 된 단백질은 친 화성 정제 시스템으로 정제 하였다. 정제 (에 열을 사용하지 않는) 배치법으로 수행된다. 기술은 100 mm로 60 mM 내지 이미 다졸 농도를 변경하여 최적화된다. 용출을위한 최적의 농도는 250 mm입니다. 그림 4는 번역 된 단백질 제품의 25 μL에서 번역 된 단백질의 성공적인 정화를 보여줍니다. 그림 4a는 마우어의 갈라진 틈 횡단 단백질 (18)의 성공적인 정화 보여줍니다.도 4b는 PF3D7_0925900, 경찰의 성공적인 정화를 보여줍니다 변형체 yoelii 유전자 PY17X_0830000,의 원충의 ortholog가설 단백질 32.도 4c는 단백질 PY17X_1139200, 니켈 수지 비즈 및 1X 용출 완충액 100mM의 이미 다졸을 사용하여 가상의 단백질을 함유 딜 반복 성공적인 정제를 나타낸다. 정화 후 단백질의 수율은 3.5 μg의 / 25 μL이다.

그림 1
P. 그림 1. 증폭 열대열 및 P. yoelii 유전자. P.에서 증폭 PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 및 PFA0680cw의 유전자 단편을 1 % 아가 로스 겔 도시 티듐 브로마이드 염색 PCR 제품 원충 게놈 DNA.

그림 2
헬라 BAS의 그림 2. 플로우 차트 에드 셀 무료 발현 시스템. 2 단계 및 시험 관내 인간 세포 무료 발현 시스템 1 단계 모두의 도식 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
단백질 발현의 그림 3. 면역 블 롯팅 확인. # 676 항 혈청과 정상 토끼 혈청 전체 rhoptry 특정 토끼를 사용하여 표현 재조합 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 발현 된 재조합 단백질과 항혈청 676의 (A) 반응성. (나) 정상 토끼 혈청 발현 재조합 단백질과 반응하지 않았다. Parasitophorous 액포 단백질은 재조합 단백질 (32)과 반응하지 않았다.hres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 번역 산물의 마이크로 볼륨에서 단백질의 정제 4.. 니켈 수지 친화 법을 사용하는 킬레이트 발현 된 재조합 단백질의 정제. 발현 된 단백질 (번역) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, 및 (C) PY17X_1139200 단백질은 니켈 배양 - 킬레이트 수지는 버퍼 및 정제 결합 완충액에서 이미 다졸의 부재 니켈 킬레이트 수지로 정제된다. 인큐베이션 후, 비드는 원심 분리하여 결합되지 않은 단백질을 분리하고, 비드를 세척 완충액으로 두 번 세척 하였다. 바운드 재조합 단백질 회 비드 세척 한 다음 용리. 번역 단백질, 세척, 용출액 비즈전기 영동 용 샘플 완충액에 용해 하였다. 이미 다졸은 세정 (20 mM의 이미 다졸) 및 용출 완충액 (100 mM의 이미 다졸)에서 사용 하였다. 항혈청 번호를 성공적으로 인식 676 표현과 정제 된 재조합 단백질. 정상 토끼 혈청 그림 3b에 쇼로 발현 된 단백질과 반응하지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<TD> 200 KDa의
특징 인간의 세포 무료 발현 시스템 밀 배아 세포 무료 발현 시스템 토끼 망상 발현 시스템 대장균 파쇄 액의 단백질 발현 시스템
시간 3 시간에 전사 및 번역 완료 20 시간 - 10 6 시간 및 번역을위한 전사 RNA는이 고립되는 번역은 90 분 소요 님1 시간에 전자
적합한 벡터 T7 벡터 일 수있다 SP6 벡터 T7이 사용될 수있다 T7이 사용될 수있다
적당한 규모 실험실 합성에 적합 대규모 단백질 합성에 사용 실험실 및 예방 접종 연구에 적합 실험실 및 예방 접종 연구에 적합
추출물 헬라 세포 무료 추출물 밀 배아 추출물 망상 적혈구 세포 추출물 E. 세포 용 해물 추출물 대장균
수정 공동 번역과 포스트 번역 수정 포스트 번역 수정 공동 번역 수정 번역 후 변형
단백질의 크기 번역 250 KDa의 8 KDa의 220 KDa의 250 KDa의
코돈 최적화 단단한 단단한 느슨하게 단단한
이황화 결합 형성 예 예 아니 예
수율 낮은 수율 높은 수율 낮은 수율 매우 높은 수율
비용 (10) 반응에 $ 130.00 (10) 반응에 $ 173.00 5 반응에 $ 136.00 8 반응에 $ 159.00
단백질 농도 반응에 따라 3 ~ 5 μg의 100 μg의 / ㎖ 100 μg의 / ㎖ 500 μg의 / ㎖
참조 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

말라리아 연구 표 1. 셀 무료 발현 시스템. 셀의 비교표현의 자유 시스템은 현재 말라리아 연구에서 사용.

유전자 ID Ortholog ID 단백질 PCR 용 프라이머 순서
PF3D7_1436300 Translocon 구성 요소 CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 PfMC-2TM 마우어의 갈라진 단백질 GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 가설 단백질 GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT(60);
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 가설 단백질 GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

연구 표 2. Rhoptry 유전자.이 연구 (19)로 표현 서로 다른 유전자의 프라이머.

재료의 이름 회사 카탈로그 번호 기술
시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템 (32)에서 2 단계 써모 피셔 88856 단종. 항상 -80 ° C에서 저장합니다. 따뜻한 물에서 해동하지 마십시오.
시험관 결합 번역 시스템 1 단계 써모 피셔 88860 항상 -80 ° C에서 저장합니다. 토륨하지 마십시오따뜻한 물에 아.

표 3. 헬라 계 무 세포 발현 시스템. 단백질의 발현에 사용되는 키트.

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Discussion

체외 인간 세포 무료 발현 시스템 및 정제에 두 단계를 사용하여 단백질을 성공적으로 표현 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 성공적으로 증폭 및 pT7CFE-CHis 플라스미드 벡터로 유전자의 복제; 2) 30 ℃로 RNA를 전사; 의 RNAse 억제제의 존재하에 30 ℃에서 단백질 3) 번역; 4) 폴리 클로 날 및 모노클로 날 항체를 사용하여 수지 Ni 및 5로 코팅 된 비드)에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 이용하여 친 화성 정제 기반 프로토콜을 개발. 한 단계 IVT 결합 단백질 번역 시스템을 이용하여 단백질의 성공적인 표현을위한 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 성공적으로 증폭 및 pT7CFE-CHis 플라스미드 벡터로 유전자의 복제; 2) 30 ° C에서 전사 및 단백질의 번역; 3) 폴리 클로 날 및 모노클로 날 항체를 사용하여 수지 Ni 및 4로 코팅 된 비드)에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 이용하여 친 화성 정제 기반 프로토콜을 개발.

현재LY는 무 세포 발현 시스템은 재조합 단백질을 발현하는 말라리아에 사용된다. 말라리아 단백질을 표현하는 무 세포 발현 시스템의 중요한 특징은 다양한 유전자 AT 디코딩 할 수있는 능력이며, 긴 병진 일시 반복 아미노산 서열의 성공적인 발현, 글리코 실화 메카니즘의 결여 및 유전자 절단을 제어하는​​ 플라스미드의 능력의 부족. 본 연구는 체외 인간 무 세포 발현 시스템 (32)에서 두 단계 및 P.의 발현을위한 하나의 단계 IVT 결합 번역 시스템의 사용을 설명 P.의 원충 유전자 orthologs . 표 1에 나타낸 정화 프로토콜이 개발 및 1 단계 및 시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템에서 2 단계에서 얻은 재조합 단백질의 마이크로 볼륨 정화 최적화되었을 yoelii merozoite의 rhoptry 유전자. 4 P. 원충의 유전자는, 횡단 소수성 단백질, 예측 가상의 ARM 반복 PF3D7_0114100단백질 PF3D7_1361800 및 친수성 단백질 PF3D7_0925900, 2 단계 및 시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템에서 한 단계를 사용하여 표현 하였다. 정제 된 단백질의 수율을 측정 하였다. 그것은 두 개의 경막 도메인과 세포막 단백질이고 우리는 시험 관내 발현 시스템이 제대로 횡단 단백질을 발현 및 정제의 용이성을 위해 허용 될 수 있는지 여부를 결정하는데 관심을 가졌다 때문에 단백질 PfMC-2TM는 이들 연구에 포함시켰다.

모두 한 단계 및 두 단계 발현 시스템에서 중요한 차이는 두 단계 발현 시스템은 안정 mRNA를 전사 및 번역 반응에 첨가되는 mRNA에 의존하는 시스템이라고한다. 대조적으로, 시험 관내 결합 된 전사 한 단계 / 번역 시스템은 반응 중에 단백질의 동시 번역 뒤에 연속 전사 및 mRNA의 공급을 포함한다. 모두 1 단계 IVT 전사 / 번역 결합 전자xpression 시스템 및 시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템에서 2 단계는 고 분자량 단백질의 발현에 대해 시험 하였다. 두 시스템 모두 저 분자량의 재조합 단백질을 발현에 성공했다. 1 단계의 발현 시스템에서, 번역 반응 혼합물 중의 단백질과 항체 교차 반응이 관찰되었다. 교차 항체와 반응하는 특정 단백질은 알 수없는 자세한 조사가 필요합니다. 고 분자량 단백질의 발현은 1 단계 및 2 단계 시스템을 모두 사용하여 실패했다. 정화 프로토콜은 1 단계 및 시험 관내 인간 세포 무료 발현 시스템에서 2 단계를 모두 사용하여 표현 서로 다른 용해도 특성의 재조합 단백질의 정화 microvolumes 위해 개발되었습니다. 단백질은 성공적으로 정제하고 1 단계로 번역 할 때 체외 단백질 번역 시스템에서 2 단계 25 μL 당 1.5 μg의를 사용하여 표현하는 경우 얻어진 수율은 25 μL 당 3.5 μg의했다 나는VT 단백질 발현 시스템. 18 kDa 내지 37 kDa의 변화에​​ 저 분자량의 단백질의 발현은 정직 재현하고있다. 그러나, 고 분자량의 단백질 발현은 잘림 초래한다. 인해 DNA 클로닝 얻어 microvolumes로 PCR 증폭은 복제 된 제품을 확인하는 데 사용 하였다. 인해 반응에서 ATP의 고농도 eIF2 알파 서브 유닛의 상수 인산화 될 수 무 세포 발현 시스템을 이용하여 고 분자량의 단백질을 발현의 잠재적 장애물. 이것은 잠재적으로 무 세포 발현 시스템 (10)에서 큰 단백질의 합성 동안 단백질 합성의 신장에 영향을 미치는 시스템 내의 번역 개시를 저해.

여기에 설명 된 프로토콜은 단백질의 발현을위한 최적화 조건에 의해 uninfluenced된다. 나도 유전자 코돈이나 플라스미드 단백질의 발현을 위해 최적화되지 않았다, 단백질 폴딩은 필요하지 않았다. 이 시스템은 P를 표현3 시간 및 단백질의 정제에 roteins은 면역 또는 펩티드 서열에 대한 재조합 단백질의 처리와 같은 하류 어플리케이션을 허용 2 시간에 얻을 수있다. 다양한 재조합 단백질은 면역 혈청 검사 및 잠재적 백신 후보 분자의 식별을 위해 마이크로 어레이 형식을 사용하여, 헬라 세포 가능한 시스템으로 표현 될 수있다. 또한, 잠재적 인 면역 원성 단백질 발현을 스케일링하여 얻어지는 단백질을 스크린을 통해 식별하고 선택할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

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Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

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