Summary
Uttryck av malaria proteiner i cellbaserade system är fortsatt utmanande. Vi visar två steg och ett steg IVT (in vitro-translation) cellfritt expressionssystem för att uttrycka malaria rekombinanta rhoptry proteiner från HeLa-celler. Vi använder ett Ni-hartsaffinitetsbaserade reningssystem för att rena rhoptry proteiner.
Abstract
Malaria orsakar betydande global sjuklighet och dödlighet. Ingen rutin vaccin finns för närvarande. En av de stora anledningarna till bristen på vaccin är utmaningen att identifiera lämpliga vaccinkandidater. Malaria proteiner uttryckas med prokaryota och eukaryota cellbaserade uttryckssystem är dåligt glykosylerade, allmänt olöslig och genomgår felaktig vikning som leder till minskad immunogenicitet. De vetegroddar, kaninretikulocytlysat och Escherichia coli lysat cellfria expressionssystem används idag för uttryck av malaria proteiner. Emellertid förblir längden av expressionstiden och felaktig glykosylering av proteiner fortfarande en utmaning. Vi visar uttryck av Plasmodium proteiner in vitro med hjälp av HeLa baserad cellfria expressionssystem, benämnda "in vitro cellfria expressionssystem mänskliga". De 2 HeLa baserad cellfria expressionssystem transkribera mRNA i 75 minuter och 3 pl transcribEd-mRNA är tillräckligt för att översätta proteiner i 90 minuter. Den 1-steg uttryckssystem är en transkription och translation kopplad expressionssystem; transkriptionen och co-översättning sker i tre timmar. Processen kan också förlängas med 6 h genom att tillhandahålla ytterligare energi. I två-stegsexpressionssystem, är mRNA transkriberas först och sattes därefter till blandningen översättning av proteinuttryck. Vi beskriver hur man uttrycker malariaproteiner; en hydrofob PF3D7_0114100 Maurer är kluven - 2 trans (PfMC-2TM) protein, en hydrofil PF3D7_0925900 protein och ett bältdjur upprepningar som innehåller protein PF3D7_1361800, med hjälp av HeLa baserade cellfria expressionssystem. Proteinerna uttrycks i mikro volymer som använder två-stegs och en-stegs-expressionsstrategier. En affinitetsreningsmetod för att rena 25 pl av proteiner som uttrycks med användning av in vitro-humana cellfritt expressionssystem beskrivs också. Protein avkastning bestäms av Bradford analysen och den uttrycktaoch renade proteiner kan bekräftas genom western blotting-analys. Uttryckta rekombinanta proteiner kan användas för vaccinationer, immunanalyser och proteinsekvensering.
Introduction
I malariaforskning, förblir uttryck av immunogena proteiner med användning av prokaryota eller eukaryota cellbaserade system en utmaning. AT rikedom av Plasmodium genomet och okända posttranslationella mekanismer 14,7, bidra till svårigheter som är förknippade med att få korrekt vikta och immunogena proteiner för produktion och vaccinantikroppsstudier. Prokaryota system såsom Escherichia coli har använts för rekombinant proteinexpression. Prokaryota system är låg kostnad, effektiv, ger höga utbyten av rekombinant protein och ha flera kloningsvektorer. Värd E. coli-celler är lätta att omvandla och celler växer snabbt. Emellertid prokaryota system har begränsningar såsom brist på aminosyrasubstitution, posttranslationell modifiering, risk för förorening, heterogena produkter och ackumulering av rekombinanta proteiner inom inklusionskroppar 24.
I enstudie av Mehlin et al. (2006), var 1000 öppna läsramar (ORF) uttryckt. Ungefär 7% av de uttryckta proteinerna var lösliga 14. Olöslig observerade beror på den förspända naturen av generna och den höga frekvensen av kodoner som används idealt av Plasmodium AT-rik genomet 14. En alternativ strategi för att lösa detta problem har utvecklats med hjälp av plasmider eller värdceller innehållande tRNA som känner igen sällsynta kodoner eller kodoner som motsvarar frekvenserna 3. Även efter att ha utfört dessa optimeringar, är mycket små portioner av proteiner uttryckt som löslig, aktiv och immunogena 14. De cellfria expressionssystem innehåller alla de komponenter som krävs för transkription och translation, såsom ribosomer, initieringsfaktorer, elongeringsfaktorer (översättningar faktorer), tRNA och aminoacyl-tRNA-synte. Både transkriptions- och translationsreaktioner är kopplade i ett-steg 11,29. Den transcription Reaktionen utförs i ett rör innan lämplig mängd av mRNA inkuberas med översättningsmaskiner i ett annat rör 11,29. Även om dessa metoder är framgångsrika i Plasmodium sp. Proteinuttryck, är en stor nackdel tidslängden för proteinuttryck, vilket är omkring 22 h 29. Dessutom de höga kostnaderna för leveranser som skall ingå i protokollen 29, arbetsintensiva beredningar av cellysatet och inkonsekvenser i beredningar komponent göra dessa system ouppnåelig. Tyngdpunkten för forskare för utveckling av ett cellfritt expressionssystem beror på faktorer såsom snabb genetisk modifiering, snabba utbyten med höga koncentrationer och rakt framåt lysat preparat 1.
Eukaryota system såsom jäst, däggdjurscellinjer, baculovirus medierad expressionssystem, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum och parasituttryckssystem sulm såsom Leishmania har använts för rekombinant proteinuttryck 7. Eukaryota system delar fylogenetiska relation och därmed också dela egenskaper såsom glykosylering, acylering, disulfidbindning bildning, chaperone interaktion, proteolys och sub-cellulär uppdelning. Proteinutsöndring händelser i eukaryoter förhindra ackumulering och minskar toxicitet för expressionssystem 13. Användningen av jästsystem föredras eftersom de är lämpliga för proteinuttryck i stor skala och för att erhålla höga utbyten 4. Två P. falciparum-proteiner PfCP-29 och Pvs25 producerades med användning av jästsystemet 4. Men en stor nackdel i syntesen av de flesta av proteinerna var oregelbundna N och O-glykosyleringsmönster, felaktig vikning och trunkering av proteiner från deras nativa form 4.
Användningen av däggdjursceller för syntes av rekombinanta proteiner är arbetsintensivt och det är Expentande att bibehålla stabila rekombinanta cellinjer 4. Därför har däggdjursceller varit begränsade för analys av proteinsignalering, proteininteraktioner och parasit-värd interaktioner och även för att testa DNA-vacciner 4. Human DNA och mRNA in vitro proteinuttryck cellfritt system som beskrivs häri är en HeLa-cellhärledda däggdjursbaserat system som uttrycker proteiner i 3 timmar. Proteiner uttryckta med hjälp av pT7CFE1-Chis uttrycksvektor har en C-terminal tag lätta identifiering och rening. HeLa baserat system kompletteras med translationsinitierings- faktorer och en översättning regulator och därigenom förbättra effektiviteten i översättningssystemet. Proteiner kan snabbt översättas, skärmad verifierade och bearbetas för användning i olika immunologiska och strukturella applikationer 15.
Eukaryota cellfria expressionssystem såsom vetegroddar och kaninretikulocyt används för närvarande för uttryck av various eukaryota proteiner inklusive Plasmodium proteiner 11,29. Dessutom, E. coli baserade cellfria system används också för eukaryot proteinuttryck 11. Tabell 1 sammanfattar olika cellfria expressionssystem genom att jämföra egenskaperna hos de system samt hur lätt att använda systemen för proteinuttryck. Den humana cellfritt system i jämförelse med de andra har förmågan att utföra post och co-translationella modifieringar och är billigare. Kodon optimering är möjlig och alla reaktionerna kan utföras i tre timmar. HeLa-systemet är ett idealiskt system för proteinsyntes i laboratoriemiljö översättning.
En stor fördel med cellfria expressionssystem humana över andra cellfria system är tillgången av flera olika cellinjer härledda från olika organ och vävnader. Flera varianter av cellfria system kan utformas beroende på cellinjen. Extraktets härrör från däggdjursceller har högre effektivitet för att syntetisera stora proteiner än andra cellfria expressionssystem. Dessa cellfria expressionssystem kan också användas i diagnostiska och proteinkarakterisering tillämpningar såsom mikro arrayer 30. De populära HeLa cellinjer är de mest allmänt används för att utföra uttryckningen av proteiner 33. Det endoplasmatiska retiklet i cellinjerna HeLa är underutvecklad, vilket leder till frånvaro av posttranslationell glykosylering modifiering aktivitet 33. Emellertid är detta system tros vara fördelaktigt för Plasmodium proteinsyntes som Plasmodium saknar också glykosylering översättnings- modifiering 29. Den HeLa cellfria transkriptions translation protokoll är lätt att utföra, billigt och proteiner kan uttryckas i 90 minuter, redo för rening och ytterligare tillämpningar i efterföljande led.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Parasitcellkulturer, Insamling av Parasite Pellets
- Förbered RPMI-1640-HEPES media genom att tillsätta 10 g RPMI-1640 pulver, 66 mg gentamycin sulfat, 2 g natriumbikarbonat, 5,9 g HEPES-buffert, 50 mg hypoxantin och 3,8 g dextros i 1 L steril dH 2 O. Blanda med hjälp av tabellen magnetomrörare tills allt pulver har löst i 1 liter destillerat vatten. Utför mikrofiltrering av media som använder 0,22 um filter. Förvara media i sterila flaskor.
- Tvätta oinfekterade (färska) typ A + erytrocyter använder RPMI. Bered 5% hematokrit av erytrocyter (0,5 ml tvättade färska erytrocyter i 9,5 ml 10% RPMI + humant serum).
- Gör 15% humant serum + RPMI (15 ml humanserum och 85 ml RPMI) att inleda odling av parasiter. Gör 10% humant serum och RPMI (10 ml humanserum och 90 ml RPMI) för att fortsätta odlingen av parasiter i röda blodkroppar.
- Kultur P. falciparum (3D7 och FCR-3 stammar) i typA + humana erytrocyter vid 5% hematokrit och 20% parasitemi i petriskål eller en 75 cm 3 odlingskolv. Upprätthålla kulturen in vitro enligt metoden enligt Trager och Jensen ljuslyktor 26. Alternativt, bibehålla kulturer är i inkubator vid 37 ° C bibehållande 9,5% CO2 och 3,4% N 2-gas. Kultur P. falciparum i RPMI 1640-HEPES-medium kompletterat med 10% humant serum.
- Synkronisera P. falciparum kultur genom att tillsätta 65% percoll (65 ml Percoll + 35 ml av RPMI-1640 utan humant serum) och kulturen koncentrerar 27.
- Centrifugera kulturkoncentrat med percoll vid 2500 xg under 5 minuter, vilket resulterar i 3 lager. Försiktigt, med hjälp av en överföringspipett isolera schizonter från mellanskiktet överföring till ett separat rör under aseptiska förhållanden 27.
- Tvätta de isolerade kulturer med 10% humant serum + RPMI-1640 två gånger för att avlägsna överskott av percoll genom centrifugering vid 7500 xg under 5 minuter. Discard supernatanten varje gång under aseptiska förhållanden 27.
- Fortsätt odling av den synkroniserade P. falciparum schizonter i 10% humant serum + RPMI-1640 27.
- Samla schizonter genom behandling Plasmodium infekterade erytrocyter med 10 mM Tris pH 8,8 och centrifugering vid 15000 x g under 15 min 23. Butiksparasit pellets vid -70 ° C efter tillsats av 5 | il proteasinhibitor (aprotinin) till pellets. Använd parasit pellets för proteinextraktion, genomisk DNA-isolering och RNA isolering.
2. Förberedelse Plasmiden vektor
- Isolera genomiskt DNA från P. falciparum schizont pellets framställda från kulturer av ca 20% parasitemi.
- Lägg 600 pl av 10 mM Tris-HCl med pH 7,6, 50 mM EDTA, pH 8,0, 0,1% SDS och 1 mg / ml proteinas K, till pelletar i ett mikrocentrifugrör, homogenisera pelleten med användning av en 1 ml spruta fäst till en 26 G-nål. Alternate fylla sprutanmed pelletsblandningen och tömning till ett mikrocentrifugrör 20 gånger. Inkubera röret innehållande homogenatet O / N i en 50 ° C vattenbad.
- Utför fenol - kloroform (P + C) utvinning genom att tillsätta 600 pl P + C (300 pl fenol och 300 pl kloroform) och homogeniserade pellets. Cap röret ordentligt och skaka blandningen kraftigt genom att vända röret end-to-end. Centrifugrör vid 14.000 xg under 2 min och samla övre vattenlösning med användning av en mikropipett till ett nytt mikrocentrifugrör. Upprepa detta steg två gånger.
- Lägg 600 | il kloroform till det vattenhaltiga skiktet i den nya röret från steg 2.1.2. Vortexa röret i 10 sek och centrifugera vid 14.000 xg under 2 minuter. Mät det övre vattenskiktet med en mikropipett och överföra den i ett annat mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 0,1 vol av 5 M natriumacetat pH 5,5 och 1 volym isopropanol (om vattenskiktet är 300 ul till 30 pl 5 M natriumacetat pH 5,5 + 330 il isopropanol) till vatten layer från steg 2.1.3. Inkubera röret vid RT under 15 minuter.
- Centrifugera röret vid 14.000 xg under 10 minuter för utfällning av DNA-pelleten. Kasta bort supernatanten och tvätta pelleten med 100 | il av 70% etanol (70 fil etanol och 30 pl av dH 2 O) för att avlägsna överskottssalt från DNA. Butiks DNA i 50 pl dH 2 O vid -20 ° C.
- Designa framåt och bakåt primers med hjälp av programvara eller manuellt för förstärkning av P. falciparum-gener PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 och PF3D7_0114100 tidigare identifierats i proteomet studier 16,18 med lämpliga restriktionsställen för att medge kloning av gensekvenser in i det multipla kloningsställena av expressionsplasmid pT7CFE1-Chis såsom visas i tabell 2.
- Gör en 50 | il reaktionsblandning genom att tillsätta; 5 pl isolerade P. falciparum genomiskt DNA, 5 pl 10x buffert, 5 pl MgCl2, 1,5 pl framåtriktad primer, 1,5 | ilomvänd primer, 0,5 | il av T7-DNA-polymeras och 31,5 pl av dH 2 O och utföra polymeraskedjereaktion (PCR) vid 94 ° C under 8 min för denaturering, 50 ° C under 1 min 30 sek för förlängning och 72 ° C under 9 min för glödgning och renaturering för att förstärka gener som visas i tabell 1.
- Separata PCR-produkter på en% agarosgel (1 g agaros och 100 ml Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert) 32.
- Skär den PCR-amplifierade DNA-banden från agarosgelen, placera gelskivorna innehållande DNA i en DNA gelextraktion spinnkolonn och frys vid -20 ° C under 5 minuter. Lägg 100 | il isopropanol för de frysta gelskivorna och centrifugera vid 14.000 xg under 5 minuter.
- Mät den vattenhaltiga genomströmnings filtreras i uppsamlingsröret från steg 2,5, med användning av en mikropipett och överföra till ett nytt rör. Lägg 0,1 vol av 5 M natriumacetat och centrifugera vid 14.000 xg under 5 minuter. Kasta supernatanten och tillsätt 10 pl dH 2 O till the DNA-pelleten.
- Smälta pT7CFE1-Chis expressionsvektor och renat DNA-fragment (från 2,6) i två separata rör genom tillsats av 3 pl av plasmiden och 5 | il av PCR-genprodukter till varje rör. Lägg till varje rör, en pl av specifika restriktionsenzymer, 2 | il av reaktionsbuffert och 14 pl av dH2O
- Lägg 3 pl av klippta plasmid, 5 | il av spjälkade DNA-fragment, 2 ^ il 10 x ligasbuffert, 1 | al av ligas och 9 pl dH 2 O i ett mikrocentrifugrör. Inkubera vid 12 ° CO / N.
- Lägg 0,1 vol 3 M natriumacetat vid pH 5,5 och 2 volymer etanol (om din ligerings rören volymen är 20 | il till 2 il 3 M natriumacetat + 44 | il etanol) till röret från steg 2,14. Blanda väl och inkubera vid -20 ° C under 15 minuter.
- Centrifugera röret vid 14.000 xg under 15 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en mikro pipett utan att störa pelleten.
- Tillsätt 100 pl 70% etanol to pelleten från steg 2,10. Centrifugera röret vid 14.000 xg under 5 minuter. Avlägsna och kassera supernatanten. Lägg 10 pl av nukleasfritt vatten till DNA-pelleten.
3. Protein Expression användning av in vitro Human Cell Free Expression System
- Bered 20 pl av transkriptionsblandningen genom att mäta 2 pl av det rekombinanta pT7CFE1-Chis-plasmid-DNA, 4 | il av 5x transkriptionsbuffert, 4 pl NTP-blandning, 2 | il av T7-RNA-polymeras och 8 ul av nukleasfritt vatten för 2-steg Människan i Vitro Protein Expression användning av DNA-mallar. Blanda komponenterna i ett mikrocentrifugrör och inkubera i 75 minuter vid 30 ° C i ett vattenbad.
- Ta 2 pl av transkriptionsblandningen och lägga till 23 pl översättningsblandning innehållande 12,5 il HeLa-cellysat, 2,5 pl proteiner, 1 pl saltlösning A, 0,5 pl av aminosyror Met, 0,5 pl av aminosyror Leu, 181, l RNas-inhibitor, 1,25 pl energimix och 3,75 pl nukleasfritt vatten.
- Inkubera översättningen blandningen från steg 3,2 vid 30 ° C under 90 minuter. Butiks översatta produkter vid -20 ° C.
- Bered 25 pl av transkription och translation blandningen genom tillsats av 3 pl av det rekombinanta pT7CFE1-Chis-plasmid-DNA, 2 | al av nukleasfritt vatten, 5 | il av reaktionsblandning, 12,5 | il HeLa-lysat och 2,5 | il av hjälpproteiner för en-stegs Humant Coupled IVT Protein Expression för DNA-mallar.
- Inkubera reaktionsblandningen från steg 3,4 för 90 min till 6 h vid 30 ° C. Förvara translationsprodukterna vid -20 ° C.
4. Rening av uttryckta rekombinanta proteiner
- Lägg 75 pl 1x reningsbuffert till 25 pl translationsprodukt för att göra 100 pl reningsblandning.
- Tillsätt 100 pl av nickel kelatbildande harts till 100 pl renings MixtURE. Tvätta Ni-hartset två gånger genom tillsats av 300 pl av dH 2 O och 300 ul av bindningsbuffert. Återsuspendera hartset och centrifugera vid 14.000 xg under 1 min för att avlägsna överskott av etanol.
- Lägg 100 pl av renings blandningen från steg 4,2-100 il nickel kelatbildande harts och inkubera blandningen under 60 min vid RT.
- Centrifugera blandningen vid 14.000 xg i 1 min och supernatanten till ett nytt rör märkt som "flöde genom".
- Tvätta hartset med 100 pl 1x tvättbuffert (20 mM imidazol, 250 mM NaH 2 PO 4 vid pH 8, 2,5 M NaCl och dH 2 O). Centrifugera vid 14.000 xg under 1 minut och samla supernatanten i nytt rör märkt "tvätta". Upprepa steg 4,5 gånger.
- Tillsätt 100 ni 1x elueringsbuffert (100 mM imidazol, 250 mM Na 2 PO 4 vid pH 8,0, 2,5 M NaCl och dH 2 O) till hartset och inkubera i 15 minuter. Centrifugera vid 14.000 xg i 1 min. Gör elueringssteget två gånger. Varjetid supernatanten till nya mikrocentrifugrör och etikett som "eluat".
- Efter eluering, tvätta hartset två gånger såsom beskrivits i steg 4,5. Store flöda genom, tvättar och eluering prover vid -20 ° C eller lägre. Resin skall lagras vid 4 ° C. Använd 30 pl av varje prov för SDS-PAGE och immunoblotting-analys.
5. Coomassie (Bradford) Protein Assay 34
- Förbered standard bovint serumalbumin (BSA) lösningar med koncentrationen 20 | ig / ml (blanda 10 ^ il BSA (2 mg / ml) och 90 pl av dH 2 O), 40 | ig / ml (blanda 20 ^ il BSA (2 mg / ml) och 80 pl av dH 2 O), 60 | ig / ml (blanda 30 ^ il BSA (2 mg / ml) och 70 pl av dH 2 O), 80 | ig / ml (blanda 40 ^ il BSA (2 mg / ml) och 60 pl av dH 2 O), 100 | ig / ml (blanda 50 ^ il BSA (2 mg / ml) och 50 pl av dH 2 O), 160 | ig / ml (blanda 80 ^ il BSA (2 mg / ml) och 20 pl av dH2 O) och 200 | ig / ml (100 jil BSA (2 mg / ml).
- Åtgärd 5 il flödet genom, tvättar och eluatet prover från steg 4.7. Lägg 95 pl dH 2 O.
- Tillsätt 5 ml Coomassie-blått reagens till blandningarna från stegen 5.1 och 5.2. Täck rören med parafilm och vortexblanda i 10 sek inkubera sedan under 20 min vid RT.
- Användning av en spektrofotometer, mäta optisk densitet (OD) vid våglängden 650 nm för de protein rör från steg 5.3. Tomt koncentration mot OD läsning för att bestämma proteinkoncentrationer 34.
6. Western Blotting
- Tillsätt 5 pl schizont utdrag ur P. falciparum, 2 pl Escherichia coli uttryckta rekombinanta rhOP-3-proteiner 31, 5 pl av rekombinanta proteiner uttryckta med hjälp av 2-steg och 1 steg in vitro humana uttryckssystem och 10 il proteinprodukter renas med användning av affinitets metod för att separera rör. Lägg elektroforesprovbuffert innehållande merkaptoetanol till varje rör för en slutlig volym av 20 | j, l för att göra solubiliserade proteinprover. Koka rören i 2 min.
- Load solubiliserade proteinprover på 10% SDS-PAGE-geler för att separera proteinerna.
- Överför separerade proteiner från SDS-PAGE-geler till nitrocellulosapapper (NCP) genom elektrofores vid 35 mA per gel i ett halvtorrt western blotting kammare för 2 timmar.
- Block kontaktpunkter efter överföring med 2% fettfri mjölk.
- Inkubera blockerad kontaktställena med följande polyklonala antikroppar utspädda 1: 100 i 2% mjölk för att utföra western blotting; kanin-antikropp # 676 21 specifik för P. falciparum merozoite rhoptries, musantikroppar 20 specifika för P. yoelii och P. berghei merozoite rhoptries, sera # 685 specifika för P. falciparum parasitofor vacuole protein, SERA (serin rik antigen) 22 och antikroppar som är specifika för Maurer217; s kluven protein PfMC-2TM 28.
- Inkubera kontaktställena också i 1: 100 utspädning normala mus- och kaninserum och förbrukad odlingssupernatant (SCS) från SP2 myelomceller som negativa kontroller.
- Inkubera kontaktpunkter med antikroppar och kontroller vid 4 ºC O / N.
- Tvätta NCP 4x med Blöt buffert och inkubera kontaktställena med artspecifika sekundära antikroppar konjugerade med pepparrotsperoxidas (HRP), spädd 1: 1000 i 2% mjölk.
- Tvätta NCP 4x med Blot-buffert. Inkubera tvättades NCP med färgutvecklingen lösning A + B (lösning A: add 50 ml 1x Blöt-buffert och 30 | il H2O 2; Lösning B: tillsätt 10 ml metanol och 30 mg 3-kloro-naftol) för 30 min i mörker. Analysera Western blot resultat kolorimetriskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering av de uttryckta rekombinanta proteinerna genom reaktivitet med specifika antikroppar är ett viktigt första steg för att bekräfta korrekt veckning av de uttryckta proteinerna. Rekombinanta malaria proteiner uttrycktes med hjälp av ett steg och två steg in vitro mänsklig cellfria expressionssystem. De rekombinanta proteinerna renas Ni-kelaterande affinitetsmetoden. Vi använde sedan sera mot hela merozoite rhoptries i västra blotting av SDS-PAGE separerade rekombinanta proteiner.
Figur 1 visar PCR-amplifierad gen fragment av PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 och PF3D7_1436300 i en 1% agarosgel. DNA-banden skars ut och DNA renas genom frysning i DNA-extraktion Spin Column.
Malaria gener framgångsrikt amplifierade (visade i Tabell 2) från genomiskt DNA klonades in i pT7CFE-Chis expressionsvektor. Åter amplifiering av generna från recombinant plasmider visade närvaron av de klonade genfragmenten i vektorn. Flödesschemat i expressionssystem som användes för proteintranslation visas i figur 2. Figurerna 2A och 2B visar ett steg vist förfarande av det två-stegs in vitro cellfria expressionssystem människa och en-stegs IVT kopplad translationssystem. Framgångsrikt uttryck av Plasmodium proteiner med användning av in vitro mänsklig cellfria expressionssystem bekräftades genom rhoptry specifikt kaninantiserum. Såsom visas i figur 3A, var rekombinanta proteiner som känns igen av rhoptry specifikt kaninantiserum # 676. Som visats tidigare, uttryckta rekombinanta proteiner inte erkänns av antisera mot parasitofor vakuolen proteiner från P. falciparum och P. yoelii demonstrerar specificiteten av kaninantisera 676 mot de uttryckta proteinerna 32. Normalt kaninserum (NRS) reagerade inte med rekombinanta proteineromräknas 2-steg in vitro human cellfria expressionssystem och 1-steg IVT kopplad translationssystem (Figur 3B). Den framgångsrika uttryck av Plasmodium rekombinanta proteiner bekräftades av olika tekniker såsom I-gelfärgning histidin och nickel-HRP färgning 32. Uttryckta proteiner renades genom affinitetsrening systemet. Rening utförs i satsmetod (utan kolumner används). Tekniken är optimerad genom att ändra koncentrationen av imidazol från 60 mM till 100 mM. Den optimala koncentrationen för eluering är 250 mm. Figur 4 visar framgångsrik rening av översatta proteiner från 25 il översatta proteinprodukter. Figur 4A visar framgångsrik rening av Maurers kluven transmembranprotein 18. Figur 4B visar framgångsrik rening av PF3D7_0925900, P. falciparum ortolog från Plasmodium yoelii gen PY17X_0830000, enhypotetiskt protein 32. Figur 4C visar framgångsrik rening av bält upprepningar som innehåller protein PY17X_1139200, ett hypotetiskt protein med användning av Ni hartspärlor och 100 mM imidazol i 1x elueringsbuffert. Utbytet av protein efter rening är 3,5 mikrogram / 25 pl.
Figur 1. Amplifiering av P. falciparum och P. yoelii gener. 1% agarosgel som visar etidiumbromid färgade PCR-produkter av genfragment av PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 och PFA0680cw amplifierats från P. falciparum genomiskt DNA.
Figur 2. Flödesschema för HeLa bas ed cellfria expressionssystem. Schematisk bild av både 2-steg och 1 steg in vitro mänsklig cellfria expressionssystem. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Immunoblotting bekräftelse av proteinuttryck. Western blot-analys av uttryckta rekombinanta proteiner med användning av hela rhoptry specifikt kaninantisera # 676 och normalt kaninserum. (A) Reaktivitet av antisera 676 med uttryckta rekombinanta proteiner. (B) normalt kaninserum inte reagerade med de uttryckta rekombinanta proteiner. Parasitofor vakuol protein reagerade inte med rekombinanta proteiner 32.hres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Rening av proteiner från mikro volymer translationsprodukt. Rening av uttryckta rekombinanta proteiner med användning Nickel kelatbildande harts affinitetsmetoden. Uttryckta proteiner (översättning) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, och (C) PY17X_1139200 proteiner inkuberades med nickel - kelatbildande hartser renas med Nickel kelatbildande harts i frånvaro av imidazol i bindningsbuffert och rening buffert. Efter inkubering pärlorna centrifuger, obundna proteiner separerades och pärlorna tvättades två gånger i tvättbuffert. Bundna rekombinanta proteiner eluerades två gånger följt av tvättning av pärlorna. Översatta proteiner, tvättar, eluaten och pärlorsolubiliserades i elektroforesprovbuffert. Imidazol användes i tvätt (20 mM imidazol) och eluering (100 mM imidazol) buffertar. Antisera # 676 framgångsrikt erkänt uttryckte och renade rekombinanta proteiner. Normalt kaninserum reagerade inte med uttryckta proteiner som visar i figur 3B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Funktioner | Human cell Gratis uttryckssystem | Vetegroddar cellfria expressionssystem | Kaninretikulocyt expressionssystem | E. coli lysat proteinexpressionssystem |
| Tid | Klar transkription och translation i 3 h | Transkription för 6 timmar och översättning av 10 - 20 timmar | RNA måste isoleras översättning tar 90 min | Done i 1 timme |
| Lämplig vektor | T7-vektorn kan vara | SP6 vektor | T7 kan användas | T7 kan användas |
| Lämplig skala | Lämplig för laboratoriesyntes | Används för storskalig proteinsyntes | Lämplig för laboratorie- och immuniseringsstudier | Lämplig för laboratorie- och immuniseringsstudier |
| Extrakt | HeLa cellfria extrakt | Embryo av vete extrakt | Retikulocyt cellextrakt | E. coli cellysat extrakt |
| Modifiering | Co-translationell och post-translationell modifiering | Post-translationell modifiering | Co-translationell modifiering | Post-translationell modifiering |
| Storlek av protein translaterat | 8 kDa till 250 kDa | 220 KDa | 250 KDa | <td> 200 KDa|
| Kodon optimering | Snäv | Snäv | Lös | Snäv |
| Disulfidbindning bildning | Ja | Ja | Nej | Ja |
| Utbyte | Lågt utbyte | Högt utbyte | Lågt utbyte | Mycket högt utbyte |
| Kosta | $ 130,00 för 10 reaktioner | $ 173,00 för 10 reaktioner | $ 136,00 för 5 reaktioner | $ 159,00 för 8 reaktioner |
| Proteinkoncentration | 3 till 5 ug per reaktion | 100 ^ g / ml | 100 ^ g / ml | 500 | ig / ml |
| Referenser | 32, 30 | 7, 28, 29 | 7 | 7, 24, 25 |
Tabell 1. Cell gratis uttryckssystem i malariaforskning. Jämförelse av cellfria expressionssystem som för närvarande används i malariaforskning.
| Gene-ID | Ortolog ID | Protein | Primersekvensen för PCR |
| PF3D7_1436300 | Translocon komponent | CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG | |
| GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC | |||
| PF3D7_0114100 | PfMC-2TM Maurers kluven protein | GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA | |
| CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA | |||
| PY17X_0830000 | PF3D7_0925900 | Hypotetiskt protein | GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA |
| CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60; | |||
| PY17X_1139200 | PF3D7_1361800 | Hypotetiskt protein | GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA |
| CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT |
Tabell 2. Rhoptry gener i studien. Primrar av olika gener som uttrycks i denna studie 19.
| Namn Material | Företaget | Katalognummer | Beskrivning |
| 2-steg in vitro mänsklig cell gratis uttryckssystem 32 | Thermo Fisher | 88.856 | Avbrytas. Alltid lagra vid -80 ° C. Tina inte i varmt vatten. |
| 1 steg i översättning vitro kopplat system | Thermo Fisher | 88.860 | Alltid lagra vid -80 ° C. Inte thaw i varmt vatten. |
Tabell 3. Hela-baserad cellfria expressionssystem. Kits som används för uttryck av proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktiga stegen för framgångsrik expression av proteiner med användning av två steg in vitro humant cellfritt expressionssystem och rening är: 1) framgångsrik amplifiering och kloning av gener i pT7CFE-Chis plasmidvektor; 2) transkribera RNA vid 30 ° C; 3) översättning av protein vid 30 ° C i närvaro av RNAs-hämmare; 4) utveckla affinitetsbaserade reningsprotokoll med användning av hartspärlor belagda med Ni och 5) analysera resultat på western blot med hjälp av polyklonala och monoklonala antikroppar. De viktiga stegen för framgångsrik expression av proteiner med användning av ett steg IVT kopplad proteintranslationssystem är: 1) framgångsrik amplifiering och kloning av gener i pT7CFE-Chis plasmidvektor; 2) Transkription och translation av proteiner vid 30 ° C; 3) utveckla affinitetsbaserade reningsprotokoll med användning av hartspärlor belagda med Ni och 4) analysera resultat på western blöt med användning av polyklonala och monoklonala antikroppar.
Aktuellly, är cellfria expressionssystem som används för att uttrycka rekombinanta malaria proteiner. De kritiska funktioner i cellfritt expressionssystem för att uttrycka malariaproteiner är förmågan att avkoda AT rika gener, brist på lång translationell paus, framgångsrik uttryck för upprepade aminosyrasekvenser, brist på glykosylering mekanismer och förmåga plasmider att kontrollera gen trunkering. I denna studie visar vi användning av ett två-stegs in vitro mänsklig cell yttrandefriheten systemet 32 och ett steg IVT kopplade system för uttryck av P. översättning falciparum gen ortologer av P. yoelii merozoite rhoptry gener såsom visas i tabell 1. Ett reningsprotokoll har utvecklats och optimerats för rening mikro volymer av rekombinanta proteiner erhållna från en-stegs och två-stegs in vitro humana cellfria expressionssystem. 4 P. falciparum gener PF3D7_0114100 en trans hydrofobt protein, en förutsedd hypotetisk ARM upprepningprotein PF3D7_1361800 och en hydrofil protein PF3D7_0925900, uttrycktes med hjälp av en 2-steg och 1 steg in vitro human cellfria expressionssystem. Renade proteinutbyten bestämdes. Proteinet PfMC-2TM ingick i dessa studier, eftersom det är en integrerad membranprotein med två transmembrandomäner och vi var intresserade av att bestämma huruvida in vitro expressionssystemet korrekt kunde uttrycka transmembranprotein och tillåta för att underlätta rening.
Den huvudsakliga skillnaden i både ett steg och två steg uttryckssystem är att de två steg expressionssystemet är ett beroende systemet mRNA, där en stabil mRNA transkriberas och sattes till translationsreaktionen. Däremot ett steg in vitro kopplat transkriptions / translationssystem innebär en kontinuerlig transkription och tillförsel av mRNA, följt av samtidig translation av proteinet under reaktionen. Både 1-steg IVT transkription / translation kopplad eXpression systemet och 2-stegs in vitro humant cellfritt expressionssystem testades med avseende på expression av högmolekylära proteiner. Båda systemen var framgångsrika i att uttrycka lågmolekylära rekombinanta proteiner. I en-stegs-expressionssystem, var antikropps korsreaktivitet med proteiner i translationsreaktionsblandningen observerades. De specifika proteinerna korsreagerande med antikropparna är okända och behöver undersökas ytterligare. Expression av högmolekylära proteiner misslyckades med användning av både den en-stegs och två-stegs-system. En reningsprotokoll har utvecklats för rening microvolumes av rekombinanta proteiner av olika löslighetsegenskaper uttryckt med både 1-steg och 2 steg in vitro mänsklig cellfria expressionssystem. Proteiner var framgångsrikt renat och utbytet som erhölls var 3,5 mikrogram per 25 pl uttryckt med hjälp av 2-stegs protein översättning vitro-system och 1,5 mikrogram per 25 pl vid omräkning med 1-steg IVT proteinexpressionssystem. Expression av lågmolekylära proteiner varierar från 18 kDa till 37 kDa är reproducerbar och rakt fram. Resulterar emellertid hög molekylvikt uttryck i protein stympningar. På grund av de microvolumes erhållits för klonat DNA, PCR-förstärkning används för att verifiera klonade produkter. Potentiella hinder för att uttrycka högmolekylära proteiner med användning av cellfria expressionssystem kan vara konstant fosforylering av eIF2 alfa-subenhet på grund av hög koncentration av ATP i reaktionen. Detta försämrar translationsinitieringsstället i systemet som eventuellt påverkar förlängningen av proteinsyntes under syntes av stora proteiner i cellfria expressionssystem 10.
Protokollet som beskrivs här är opåverkad av optimeringsvillkor för expression av proteiner. Varken gense kodoner eller plasmiden optimerades för expression av proteiner, och proteinåterveckning var inte nödvändig. Detta system uttrycker proteins i 3 h och reningen av proteinet kan erhållas i två timmar, vilket möjliggör ytterligare tillämpningar nedströms såsom bearbetning av det rekombinanta proteinet för immuniseringar eller peptidsekvensering. Flera rekombinanta proteiner kan uttryckas med HeLa cellfritt system, med hjälp av microarray format för immunsera screening och identifiering av potentiella vaccinkandidatmolekyler. Dessutom kan potentiellt immunogena proteiner identifieras genom skärmar och utvalda proteiner erhållna genom att skala upp uttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-step in vitro human cell free expression system | Thermo Fisher | 88856 | Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water |
| 1-step in vitro coupled translation system | Thermo fischer | 88860 | Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water |
| ProBond Purification system | Invitrogen | K850-01 | Store at RT |
| Probond Nickel-Chelating Resin | Invitrogen | R801-01 | Store at 4oC. |
| A+ Human Blood | Interstate Blood Bank | Store at 4 °C. |
References
- Alexandrov, K., et al.
- Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
- Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
- Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
- Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
- Gowda, D. C., Davidson, E. A.
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
- Hinnebusch, A. Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).
- Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
- Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
- Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
- Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
- Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
- Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
- Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
- Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
- Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
- Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
- Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
- Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
- Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
- Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
- Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
- Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
- Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y.
- Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
- Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
