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Biology

की अभिव्यक्ति के लिए HeLa आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

सेल आधारित प्रणालियों में मलेरिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति चुनौती बनी हुई है। हम HELA कोशिकाओं से मलेरिया पुनः संयोजक rhoptry प्रोटीन व्यक्त करने के लिए दो कदम और (इन विट्रो अनुवाद में) एक कदम IVT सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम प्रदर्शित करता है। हम rhoptry प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक नी राल आत्मीयता आधारित शोधन प्रणाली का उपयोग करें।

Abstract

मलेरिया महत्वपूर्ण वैश्विक रुग्णता और मृत्यु का कारण बनता है। कोई नियमित टीका वर्तमान में उपलब्ध है। एक वैक्सीन की कमी के लिए प्रमुख कारणों में से एक उपयुक्त वैक्सीन उम्मीदवारों की पहचान करने की चुनौती है। मलेरिया प्रोटीन प्रोकार्योटिक और यूकेरियोटिक सेल आधारित अभिव्यक्ति सिस्टम खराब कम प्रतिरक्षाजनकता के लिए अग्रणी अनुचित तह, आम तौर पर अघुलनशील ग्लाइकोसिलेटेड और गुजरना कर रहे हैं का उपयोग करते हुए व्यक्त किया। गेहूं के बीज, खरगोश reticulocyte lysate और Escherichia कोलाई lysate सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम वर्तमान में मलेरिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, अभिव्यक्ति समय और प्रोटीन के अनुचित ग्लाइकोसिलेशन की लंबाई अभी भी एक चुनौती बनी हुई है। हम "इन विट्रो में मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम" करार दिया HeLa आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली, का उपयोग करने के लिए इन विट्रो में प्लाज्मोडियम प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है। 2 HeLa आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणालियों 75 मिनट और transcrib के 3 μl में mRNA टाइपएड mRNA के 90 मिनट में प्रोटीन का अनुवाद करने के लिए पर्याप्त है। 1-कदम अभिव्यक्ति प्रणाली एक प्रतिलेखन और अनुवाद युग्मित अभिव्यक्ति प्रणाली है; प्रतिलेखन और सह अनुवाद 3 घंटा में होता है। प्रक्रिया भी अतिरिक्त ऊर्जा प्रदान करके 6 घंटे के लिए बढ़ाया जा सकता है। 2-चरण अभिव्यक्ति प्रणाली में, mRNA के पहले लिखित है और फिर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अनुवाद मिश्रण में जोड़ा। हम मलेरिया प्रोटीन व्यक्त करने के लिए कैसे का वर्णन; एक हाइड्रोफोबिक PF3D7_0114100 Maurer की फांक - 2 ट्रांसमेम्ब्रेन (PfMC-2TM) प्रोटीन, एक हाइड्रोफिलिक PF3D7_0925900 प्रोटीन और HeLa आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग प्रोटीन PF3D7_1361800 युक्त एक Armadillo दोहराता है। प्रोटीन 2-कदम और 1-कदम अभिव्यक्ति की रणनीतियों को रोजगार सूक्ष्म मात्रा में व्यक्त कर रहे हैं। एक आकर्षण शोधन विधि भी वर्णन किया गया है इन विट्रो में मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए व्यक्त प्रोटीन के 25 μl शुद्ध करने के लिए। प्रोटीन उपज ब्रैडफोर्ड परख द्वारा निर्धारित किया जाता है और व्यक्तऔर शुद्ध प्रोटीन पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण से इसकी पुष्टि की जा सकती है। अभिव्यक्त किए जाते हैं पुनः संयोजक प्रोटीन टीकाकरण, immunoassays और प्रोटीन अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

मलेरिया अनुसंधान में, प्रोकार्योटिक या यूकेरियोटिक सेल आधारित सिस्टम का उपयोग कर immunogenic प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक चुनौती बनी हुई है। प्लाज्मोडियम जीनोम और अज्ञात पद अनुवादकीय तंत्र 14,7, एटी समृद्धि एंटीबॉडी उत्पादन और टीका के अध्ययन के लिए ठीक से मुड़ा और immunogenic प्रोटीन प्राप्त करने के साथ जुड़े कठिनाइयों के लिए योगदान करते हैं। ऐसे Escherichia कोलाई के रूप में प्रोकार्योटिक सिस्टम पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रोकार्योटिक प्रणाली, प्रभावी, कम लागत पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च पैदावार का उत्पादन और कई क्लोनिंग वैक्टर है। ई मेजबान कोलाई कोशिकाओं को बदलने के लिए आसान कर रहे हैं और कोशिकाओं में तेजी से बढ़ता है। हालांकि, प्रोकार्योटिक सिस्टम ऐसे एमिनो एसिड प्रतिस्थापन, बाद translational संशोधन, शामिल किए जाने के शव 24 घंटे के अंदर संदूषण, विषम उत्पादों और पुनः संयोजक प्रोटीन का संचय के जोखिम की कमी के रूप सीमाएं हैं।

मेंMehlin एट अल द्वारा अध्ययन। (2006), 1000 खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) व्यक्त किया गया। व्यक्त प्रोटीन की लगभग 7% घुलनशील 14 थे। मनाया जटिलता जीनों के पक्षपाती प्रकृति और अमीर जीनोम 14 में प्लाज्मोडियम द्वारा आदर्श रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं कि codons के उच्च आवृत्ति की वजह से है। इस समस्या को दूर करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति plasmids या दुर्लभ codons या आवृत्तियों 3 से मेल खाने वाले codons समझते हैं कि tRNAs युक्त मेजबान कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित किया गया है। यहां तक कि इन अनुकूलन प्रदर्शन के बाद, प्रोटीन के बहुत छोटे हिस्से, घुलनशील सक्रिय और 14 immunogenic के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम ऐसे राइबोसोम, दीक्षा कारकों, बढ़ाव कारकों (अनुवाद कारकों), tRNA और अमीनोएसिल-टीआरएनए synthetases रूप प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए सभी आवश्यक घटक होते हैं। दोनों प्रतिलेखन और अनुवाद प्रतिक्रियाओं से एक कदम प्रक्रिया 11,29 में मिलकर कर रहे हैं। transcrimRNA की उचित मात्रा में एक अलग ट्यूब 11,29 में अनुवाद मशीनरी के साथ incubated है पहले ption प्रतिक्रिया एक ट्यूब में किया जाता है। इन तरीकों प्लाज्मोडियम सपा। प्रोटीन की अभिव्यक्ति करने में सफल रहे हैं, एक बड़ी खामी लगभग 22 घंटा 29 है, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए समय की लंबाई है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल 29 में शामिल करने के लिए आपूर्ति की उच्च लागत, घटक तैयारी में श्रम प्रधान सेल lysate की तैयारियाँ और विसंगतियों, इन पद्धतियों अप्राप्य बनाने के। एक सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली के विकास के लिए शोधकर्ताओं का मुख्य फोकस ऐसे तेजी से आनुवंशिक संशोधन, उच्च सांद्रता और सीधे आगे lysate तैयारियों 1 के साथ तेजी से पैदावार जैसे कारकों पर निर्भर करता है।

ऐसे खमीर, स्तनधारी सेल लाइनों, baculovirus मध्यस्थता अभिव्यक्ति प्रणाली, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum और परजीवी अभिव्यक्ति सिस्टम सु के रूप में यूकेरियोटिक सिस्टमलीशमैनिया के रूप में चर्चा पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति 7 के लिए इस्तेमाल किया गया है। यूकेरियोटिक सिस्टम वंशावली रिश्ते का हिस्सा है और इसलिए भी इस तरह के ग्लाइकोसिलेशन, acylation, डाइसल्फाइड बंधन गठन, निगरानी बातचीत, प्रोटियोलिसिस और उप सेलुलर compartmentalization के रूप में विशेषताओं का हिस्सा। यूकेरियोट्स में प्रोटीन का स्राव घटनाओं संचय को रोकने और अभिव्यक्ति सिस्टम 13 के लिए विषाक्तता कम हो जाती है। वे बड़े पैमाने में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए और उच्च पैदावार 4 प्राप्त करने के लिए उपयुक्त हैं के रूप में खमीर प्रणाली के उपयोग को प्राथमिकता दी जाती है। दो पी फाल्सीपेरम प्रोटीन PfCP-29 और Pvs25 खमीर प्रणाली 4 का उपयोग कर उत्पादन किया गया था। हालांकि, प्रोटीन के अधिकांश के संश्लेषण में एक बड़ी खामी अनियमित और एन ओ-ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न, अनुचित तह और उनके मूल रूप में 4 से प्रोटीन की काट-छांट था।

पुनः संयोजक प्रोटीन के संश्लेषण के लिए स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग के श्रम प्रधान है और यह खर्च कर रहा हैस्थिर पुनः संयोजक सेल लाइनों 4 बनाए रखने के लिए निर्णायक। इसलिए, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन संकेतन, प्रोटीन बातचीत और परजीवी मेजबान बातचीत के विश्लेषण के लिए सीमित किया गया है और यह भी डीएनए टीके 4 के परीक्षण के लिए। इस के साथ साथ वर्णित मानव डीएनए और mRNA में इन विट्रो प्रोटीन अभिव्यक्ति सेल मुक्त प्रणाली 3 घंटा में प्रोटीन व्यक्त करता है कि एक HeLa सेल व्युत्पन्न स्तनधारी आधारित प्रणाली है। प्रोटीन की पहचान और शुद्धि की सुविधा एक सी टर्मिनल टैग pT7CFE1-chis अभिव्यक्ति वेक्टर है का उपयोग करते हुए व्यक्त किया। HeLa आधारित प्रणाली है, जिससे अनुवाद प्रणाली की दक्षता बढ़ाने, अनुवाद दीक्षा कारकों और एक अनुवाद नियामक के साथ पूरक है। प्रोटीन तेजी से अनुवादित जांच की, और सत्यापित विभिन्न immunologic और संरचनात्मक अनुप्रयोगों के 15 में इस्तेमाल के लिए कार्रवाई की जा सकती।

ऐसे गेहूं के बीज और खरगोश reticulocyte के रूप में यूकेरियोटिक सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम वर्तमान में वर की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता हैप्लाज्मोडियम प्रोटीन 11,29 सहित ious यूकेरियोटिक प्रोटीन। इसके अलावा, ई कोलाई आधारित सेल मुक्त सिस्टम भी यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कार्यरत हैं 11। 1 टेबल सिस्टम की सुविधाओं के साथ ही प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सिस्टम का उपयोग की आसानी तुलना द्वारा अलग सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम का सार। दूसरों की तुलना में मानव कोशिका मुक्त प्रणाली पोस्ट और सह translational संशोधनों प्रदर्शन करने की क्षमता है और कम खर्चीला है। कोडोन अनुकूलन संभव है और सभी प्रतिक्रियाओं 3 घंटा में प्रदर्शन किया जा सकता है। HeLa प्रणाली प्रयोगशाला स्थापित करने में प्रोटीन संश्लेषण के लिए एक आदर्श अनुवाद प्रणाली है।

अन्य सेल मुक्त प्रणालियों पर मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों का एक प्रमुख लाभ विभिन्न अंगों और ऊतकों से निकाली गई कई अलग अलग सेल लाइनों की उपलब्धता है। सेल मुक्त सिस्टम की कई किस्में सेल लाइन के आधार पर बनाया जा सकता है। उद्धरणस्तनधारी कोशिकाओं से व्युत्पन्न किसी भी अन्य सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना में बड़े प्रोटीन के संश्लेषण के लिए उच्च क्षमता है। ये सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम भी इस तरह के सूक्ष्म सरणियों के रूप में 30 नैदानिक ​​और प्रोटीन लक्षण वर्णन अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है। लोकप्रिय HeLa सेल लाइनों के सबसे व्यापक रूप से प्रोटीन 33 की अभिव्यक्ति के लिए बाहर ले जाने के लिए उपयोग किया जाता है। HeLa सेल लाइनों में अंतःप्रद्रव्य जालिका बाद translational ग्लाइकोसिलेशन संशोधन गतिविधि 33 की अनुपस्थिति के लिए अग्रणी, अविकसित है। हालांकि, इस प्रणाली प्लाज्मोडियम भी ग्लाइकोसिलेशन पद अनुवाद संशोधन 29 का अभाव के रूप में प्लाज्मोडियम प्रोटीन संश्लेषण के लिए फायदेमंद माना जा रहा है। HeLa सेल मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद प्रोटोकॉल सस्ती, प्रदर्शन करने के लिए आसान है और प्रोटीन शुद्धि और आगे बहाव के अनुप्रयोगों के लिए तैयार है, 90 मिनट में व्यक्त किया जा सकता है।

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Protocol

परजीवी सेल संस्कृतियों के 1. तैयारी, परजीवी छर्रों का संग्रह

  1. 1 एल में RPMI-1640 पाउडर के 10 ग्राम, gentamycin सल्फेट के 66 मिलीग्राम, 2 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट, 5.9 जी HEPES बफर, 50 मिलीग्राम hypoxanthine और 3.8 जी डेक्सट्रोज जोड़कर RPMI-1640-HEPES के मीडिया तैयार बाँझ DH 2 ओ 1 एल आसुत जल में सभी पाउडर घुल जब तक तालिका चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर मिलाएं। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर मीडिया के सूक्ष्म छानने का काम पूरा करें। बाँझ बोतलों में मीडिया की दुकान।
  2. Uninfected (ताजा) धोने RPMI का उपयोग कर एक + एरिथ्रोसाइट्स टाइप करें। एरिथ्रोसाइट्स के 5% हेमाटोक्रिट (9.5 मिलीलीटर 10% RPMI + मानव सीरम में धोया ताजा एरिथ्रोसाइट्स के 0.5 मिलीलीटर) तैयार करें।
  3. 15% मानव सीरम + RPMI (मानव सीरम के 15 मिलीग्राम और RPMI के 85 मिलीलीटर) परजीवी की खेती आरंभ करने के लिए सुनिश्चित करें। 10% मानव सीरम और RPMI (मानव सीरम के 10 एमएल और RPMI के 90 मिलीलीटर) लाल रक्त कोशिकाओं में परजीवी के संवर्धन जारी रखने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. संस्कृति पी फाल्सीपेरम (3D7 और FCR -3 उपभेदों) टाइप में5% हेमाटोक्रिट और 20% पेरासाइटिमिया पेट्री डिश में या एक 75 सेमी 3 संस्कृति फ्लास्क में एक + मानव एरिथ्रोसाइट्स। Trager और जेन्सेन मोमबत्ती जार 26 की विधि के अनुसार इन विट्रो में संस्कृति को बनाए रखने। वैकल्पिक रूप से, संस्कृतियों 9.5% सीओ 2 और 3.4% एन 2 गैस को बनाए रखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हैं बनाए रखें। संस्कृति पी फाल्सीपेरम RPMI में 1640-HEPES के मीडिया में 10% मानव सीरम के साथ पूरक।
  5. पी सिंक्रनाइज़ 65% Percoll संस्कृति के लिए (Percoll + मानव सीरम के बिना RPMI-1640 के 35 मिलीलीटर की 65 मिलीलीटर) को जोड़कर फाल्सीपेरम संस्कृति 27 ध्यान केंद्रित।
  6. 3 परतों में जो परिणाम 5 मिनट के लिए 2500 XG पर Percoll के साथ संस्कृति ध्यान केंद्रित अपकेंद्रित्र। ध्यान से, एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग सड़न रोकनेवाला शर्तों 27 के तहत एक अलग ट्यूब में मध्यम स्तर के स्थानांतरण से schizonts अलग।
  7. 5 मिनट के लिए 7500 XG पर centrifuging द्वारा अतिरिक्त Percoll दूर करने के लिए दो बार 10% मानव सीरम + RPMI-1640 के साथ अलग संस्कृतियों धो लें। डिसतह पर तैरनेवाला सड़न रोकनेवाला शर्तों 27 के तहत हर बार scard।
  8. सिंक्रनाइज़ पी संवर्धन जारी रखें 10% मानव सीरम + 27 RPMI-1640 में फाल्सीपेरम schizonts।
  9. 10 मिमी Tris पीएच 8.8 से प्लाज्मोडियम -infected एरिथ्रोसाइट्स के इलाज और 15 मिनट 23 के लिए 15,000 XG पर centrifuging द्वारा schizonts लीजिए। छर्रों को प्रोटीज अवरोध करनेवाला (aprotinin) के 5 μl के अलावा निम्नलिखित -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर परजीवी छर्रों। प्रोटीन निकासी, जीनोमिक डीएनए अलगाव और आरएनए अलगाव के लिए परजीवी छर्रों का इस्तेमाल करें।

2. प्लास्मिड वेक्टर की तैयारी

  1. पी से जीनोमिक डीएनए को अलग लगभग 20% पेरासाइटिमिया की संस्कृतियों से तैयार फाल्सीपेरम schizont छर्रों।
  2. एक microcentrifuge ट्यूब में छर्रों पीएच 7.6 से 10mM Tris-एचसीएल, 50 मिमी EDTA पीएच 8.0, 0.1% एसडीएस और 1 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर के 600 μl जोड़ें एक 26 जी सुई से जुड़ी एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर गोली homogenize। सिरिंज भरने वैकल्पिकगोली मिश्रण और एक microcentrifuge ट्यूब में खाली 20 गुना के साथ। एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब युक्त homogenate हे / एन सेते हैं।
  3. पी सी के 600 μl (फिनोल के 300 μl और क्लोरोफॉर्म के 300 μl) homogenized गोली को जोड़कर क्लोरोफॉर्म (पी सी) - निकासी फिनोल प्रदर्शन करते हैं। कैप ट्यूब कसकर और ट्यूब अंत करने के लिए अंत inverting द्वारा सख्ती मिश्रण हिला। 2 मिनट के लिए 14,000 XG और अपकेंद्रित्र ट्यूब एक नया microcentrifuge ट्यूब में एक micropipette का उपयोग ऊपरी जलीय समाधान इकट्ठा। दो बार इस चरण को दोहराएँ।
  4. कदम 2.1.2 से नया ट्यूब में जलीय परत करने के लिए क्लोरोफॉर्म के 600 μl जोड़ें। 2 मिनट के लिए 14,000 XG पर 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए ट्यूब भंवर। एक micropipette के साथ ऊपरी जलीय परत उपाय और एक नया microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण।
  5. जलीय रखना करने के लिए (जलीय परत 300 μl 5 एम सोडियम एसीटेट पीएच isopropanol के 5.5 + 330 μl के 30 μl जोड़ रहा है) 5 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.5 से 0.1 वॉल्यूम और isopropanol के 1 वॉल्यूम जोड़ेंकदम 2.1.3 से एर। 15 मिनट के लिए आरटी पर ट्यूब सेते हैं।
  6. डीएनए गोली वेग को 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और डीएनए से अतिरिक्त नमक निकालने के लिए 70% इथेनॉल के 100 μl (इथेनॉल के 70 μl और DH 2 हे के 30 μl) के साथ गोली धोने। -20 डिग्री सेल्सियस पर DH 2 हे के 50 μl में स्टोर डीएनए।
  7. पी के प्रवर्धन के लिए मैन्युअल रूप से आगे डिजाइन और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राइमरों रिवर्स या तालिका 2 में दिखाया गया है फाल्सीपेरम जीन PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 और PF3D7_0114100 पहले से proteome पढ़ाई अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pT7CFE1-chis के कई क्लोनिंग साइटों में जीन दृश्यों की क्लोनिंग की अनुमति के लिए उपयुक्त प्रतिबंध साइटों के साथ 16,18 में पहचान की।
  8. जोड़कर एक 50 μl प्रतिक्रिया मिश्रण बनाओ; पृथक पी के 5 μl फाल्सीपेरम जीनोमिक डीएनए, 10x बफर के 5 μl, 2 MgCl की 5μl, आगे प्राइमर के 1.5 μl, 1.5 μlरिवर्स प्राइमर, T7 डीएनए पोलीमरेज़ 0.5 μl और DH 2 हे की 31.5 μl और विकृतीकरण के लिए 8 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रदर्शन, विस्तार के लिए 1 मिनट 30 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस और 9 के लिए 72 डिग्री सेल्सियस तालिका 1 में दिखाया गया है जीन amplifying के लिए annealing और renaturation के लिए न्यूनतम।
  9. 1% agarose जेल (agarose की 1 ग्राम और Tris एसीटेट EDTA के 100 मिलीलीटर (TAE) बफर) 32 पर अलग पीसीआर उत्पादों।
  10. , Agarose जेल से पीसीआर प्रवर्धित डीएनए बैंड कट एक डीएनए जेल निकालना स्पिन स्तंभ में डीएनए युक्त जेल स्लाइस जगह और 5 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर। 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर जमे हुए जेल स्लाइस और सेंट्रीफ्यूज को isopropanol के 100 μl जोड़ें।
  11. एक micropipette का उपयोग, जलीय प्रवाह के माध्यम से 2.5 कदम से संग्रह ट्यूब में फ़िल्टर्ड उपाय और एक नया ट्यूब को हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर 5 एम सोडियम एसीटेट और सेंट्रीफ्यूज का 0.1 वॉल्यूम जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और वें के लिए DH 2 हे 10 μl जोड़नेई डीएनए गोली।
  12. प्लाज्मिड के 3 μl और प्रत्येक ट्यूब पीसीआर जीन उत्पादों के 5 μl जोड़कर दो अलग नलियों में pT7CFE1-chis अभिव्यक्ति वेक्टर और (2.6) से शुद्ध डीएनए टुकड़े डाइजेस्ट। प्रत्येक ट्यूब के लिए विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइमों का 1 μl, प्रतिक्रिया बफर के 2 μl और DH 2 ओ के 14 μl जोड़ें
  13. पचा प्लाज्मिड के 3 μl पच डीएनए टुकड़े के 5 μl, 10x ligase बफर के 2 μl, ligase का 1 μl और एक microcentrifuge ट्यूब में DH 2 ओ के 9 μl जोड़ें। 12 डिग्री सीओ / एन सेते हैं।
  14. पीएच 5.5 और इथेनॉल के 2 संस्करणों में 3 एम सोडियम एसीटेट के 0.1 वॉल्यूम जोड़ें कदम 2.14 से ट्यूब को (अपने बंधाव ट्यूब मात्रा है कि अगर 20 μl 3 एम सोडियम एसीटेट इथेनॉल के 44 μl के 2 μl जोड़ें)। अच्छी तरह मिक्स और 15 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  15. 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। ध्यान से गोली परेशान बिना एक माइक्रो पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  16. 70% इथेनॉल के टी के 100 μl जोड़ें2.10 कदम से गोली ओ। 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। डीएनए गोली को nuclease मुक्त पानी के 10 μl जोड़ें।

इन विट्रो मानव सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली में उपयोग करते हुए 3. प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. पुनः संयोजक pT7CFE1-chis प्लास्मिड डीएनए के 2 μl, 5x प्रतिलेखन बफर के 4 μl, एनटीपी मिश्रण के 4 μl, T7 शाही सेना पोलीमरेज़ के 2 μl और nuclease मुफ्त पानी की 8 μl 2-चरण के लिए मापने के द्वारा प्रतिलेखन मिश्रण के 20 μl तैयार करें डीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर इन विट्रो प्रोटीन अभिव्यक्ति में मानव। एक microcentrifuge ट्यूब में घटकों का मिश्रण है और एक पानी के स्नान में 30 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. प्रतिलेखन मिश्रण के 2 μl ले लो और HeLa सेल lysate के 12.5 μl, गौण प्रोटीन के 2.5 μl, नमक समाधान के लिए एक के 1 μl, अमीनो एसिड के 0.5 μl -Met, अमीनो एसिड के 0.5 μl युक्त अनुवाद मिश्रण के 23 μl के लिए इसे जोड़ने -Leu, 181; RNase अवरोध करनेवाला के एल, ऊर्जा मिश्रण के 1.25 μl और nuclease मुफ्त पानी के 3.75 μl।
  3. 90 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 3.2 कदम से अनुवाद मिश्रण सेते हैं। स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर उत्पादों अनुवाद।
  4. 1-कदम के लिए पुनः संयोजक pT7CFE1-chis प्लास्मिड डीएनए के 3 μl, nuclease मुक्त पानी के 2 μl, प्रतिक्रिया मिश्रण के 5 μl, HeLa lysate के 12.5 μl और गौण प्रोटीन के 2.5 μl जोड़कर प्रतिलेखन और अनुवाद मिश्रण के 25 μl तैयार करें डीएनए टेम्पलेट्स के लिए मानव युग्मित IVT प्रोटीन अभिव्यक्ति।
  5. 30 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट घंटा 6 के लिए 3.4 कदम से प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं। अनुवाद उत्पादों पर स्टोर -20 सी।

अभिव्यक्त किए जाते हैं पुनः संयोजक प्रोटीन की 4. शुद्धीकरण

  1. शुद्धि मिश्रण के 100 μl बनाने के लिए अनुवाद उत्पाद के 25 μl के लिए 1x शुद्धि बफर के 75 μl जोड़ें।
  2. शुद्धि mixt के 100 μl के लिए निकल chelating राल के 100 μl जोड़ेंure। धो नी राल दो बार DH 2 ओ के 300 μl और बाध्यकारी बफर के 300 μl जोड़कर। अतिरिक्त इथेनॉल दूर करने के लिए 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर राल और अपकेंद्रित्र फिर से निलंबित।
  3. कदम से निकल chelating राल की 4.2-100 μl शुद्धि मिश्रण के 100 μl जोड़ें और आरटी पर 60 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  4. 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र मिश्रण और "के माध्यम से प्रवाह" के रूप में चिह्नित एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  5. 1x धो बफर के 100 μl (20 मिमी imidazole, 250 पीएच 8 मिमी नाह 2 पीओ 4, 2.5 एम NaCl और DH 2 ओ) के साथ धोने राल। 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र और "धोना" लेबल ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। दोहराएँ कदम 4.5 दो बार।
  6. 1x क्षालन बफर के 100 μl जोड़ें (पीएच 8.0 से कम 100 मिमी imidazole, 250 मिमी ना 2 पीओ 4, 2.5M NaCl और DH 2 ओ) राल के लिए और 15 मिनट के लिए सेते हैं। 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र। दो बार क्षालन कदम है। प्रत्येकसमय "eluate" के रूप में ताजा microcentrifuge ट्यूब और लेबल में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  7. कदम 4.5 में वर्णित के रूप में क्षालन के बाद, दो बार राल धो लें। स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस या कम से कम के माध्यम से, washes और क्षालन नमूने प्रवाह। राल 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting के विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूने के 30 μl का प्रयोग करें।

5. Coomassie (ब्रैडफोर्ड) प्रोटीन परख 34

  1. एकाग्रता के साथ मानक गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) समाधान तैयार 20 माइक्रोग्राम / एमएल, 40 माइक्रोग्राम / एमएल (बीएसए के 20 μl मिश्रण (बीएसए (2 मिलीग्राम / एमएल) और DH 2 हे के 90 μl के 10 μl मिक्स) (2 मिलीग्राम / एमएल) और DH 2 ओ) के 80 μl, 60 माइक्रोग्राम / एमएल ((2 मिलीग्राम बीएसए (2 मिलीग्राम / एमएल) और DH 2 ओ) के 70 μl, 80 माइक्रोग्राम / एमएल (बीएसए के 40 μl मिश्रण के 30 μl मिश्रण / एमएल) और DH 2 ओ), 60 μl 100 माइक्रोग्राम / एमएल (बीएसए (2 मिलीग्राम / एमएल) के 50 μl और DH 2 ओ) के 50 μl, 160 माइक्रोग्राम / एमएल (बीएसए के 80 μl मिश्रण मिश्रण (2 मिलीग्राम / एमएल) और dh के 20 μl2 ओ) और 200 माइक्रोग्राम / एमएल (बीएसए के 100 μl (2 मिलीग्राम / एमएल)।
  2. उपाय कदम 4.7 से के माध्यम से प्रवाह, washes और eluate नमूने के 5 μl। DH 2 ओ के 95 μl जोड़ें
  3. चरणों 5.1 और 5.2 से मिश्रण करने के लिए Coomassie नीले अभिकर्मक के 5 मिलीलीटर जोड़ें। सेक तो आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते 10 के लिए parafilm और भंवर के साथ ट्यूब कवर।
  4. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग, कदम 5.3 से प्रोटीन ट्यूबों के लिए 650 एनएम के तरंग दैर्ध्य में ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने। आयुध डिपो पढ़ने बनाम प्लॉट एकाग्रता प्रोटीन सांद्रता 34 निर्धारित करने के लिए।

6. पश्चिमी सोख्ता

  1. पी से schizont अर्क के 5 μl जोड़ें फाल्सीपेरम, Escherichia कोलाई के 2 μl पुनः संयोजक Rhop -3 प्रोटीन 31 व्यक्त की, पुनः संयोजक प्रोटीन के 5 μl ट्यूबों को अलग करने के संबंध विधि का उपयोग कर 2-कदम और इन विट्रो मानव अभिव्यक्ति प्रणालियों में 1 कदम और प्रोटीन उत्पादों के 10 μl शुद्ध का उपयोग कर व्यक्त किया। Solubilized प्रोटीन के नमूने बनाने के लिए 20 μl के अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक ट्यूब वैद्युतकणसंचलन नमूना बफर युक्त mercaptoethanol जोड़ें। 2 मिनट के लिए ट्यूब उबाल लें।
  2. प्रोटीन को अलग करने के लिए 10% एसडीएस पृष्ठ जैल पर solubilized प्रोटीन के नमूने लोड।
  3. 2 घंटे के लिए एक अर्ध-शुष्क पश्चिमी सोख्ता कक्ष में जेल प्रति 35 मा वर्तमान में electrophoresing द्वारा nitrocellulose पेपर (राकांपा) के लिए एसडीएस पृष्ठ जैल से अलग प्रोटीन स्थानांतरण।
  4. 2% नोनफेट दूध के साथ स्थानांतरण निम्नलिखित ब्लॉक NCPs।
  5. सेते 1 पतला निम्नलिखित पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ NCPs अवरुद्ध किया: पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करने के लिए 2% दूध में 100; खरगोश एंटीबॉडी पी के लिए विशिष्ट # 676 21 फाल्सीपेरम merozoite rhoptries, पी के लिए 20 विशिष्ट माउस एंटीबॉडी yoelii और पी पी के लिए विशिष्ट berghei merozoite rhoptries, antisera # 685 Maurer के लिए विशिष्ट फाल्सीपेरम parasitophorous रिक्तिका प्रोटीन, सीरा (सेरीन अमीर एंटीजन) 22 और एंटीबॉडी217 की फांक प्रोटीन PfMC-2TM 28।
  6. 1 में भी NCPs सेते: 100 पतला सामान्य माउस और खरगोश सीरम और SP2 मायलोमा कोशिकाओं से खर्च की संस्कृति सतह पर तैरनेवाला (अनुसूचित जाति) के रूप में नकारात्मक नियंत्रण।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस हे / एन पर एंटीबॉडी और नियंत्रण के साथ NCPs सेते हैं।
  8. ब्लाट से धो लें NCPs 4x बफर और हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित प्रजातियों विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ NCPs सेते 1 पतला: 2% दूध में 1000।
  9. ब्लाट बफर के साथ धोने NCPs 4x। सेते रंग विकास के समाधान के साथ NCPs धोया ए + बी (समाधान के लिए एक: बफर 1x दाग की 50ml जोड़ने और एच 2 ओ 2 के 30 μl, समाधान बी: मेथनॉल के 10 एमएल और 3-क्लोरो naphtol के 30 मिलीग्राम जोड़) 30 के लिए अंधेरे में मि। Colorimetrically पश्चिमी धब्बा परिणामों का विश्लेषण।

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Representative Results

विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जेट के माध्यम से व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन के मान्यकरण व्यक्त प्रोटीन की उचित तह की पुष्टि करने में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। संयोजक मलेरिया प्रोटीन एक कदम और इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों में दो कदम का उपयोग व्यक्त किया गया। पुनः संयोजक प्रोटीन शुद्ध नी chelating आत्मीयता तरीका है। हम तो एसडीएस पृष्ठ अलग कर पुनः संयोजक प्रोटीन के पश्चिमी सोख्ता में पूरे merozoite rhoptries के खिलाफ antisera इस्तेमाल किया।

चित्रा 1 एक 1% agarose जेल में PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 और PF3D7_1436300 की पीसीआर प्रवर्धित जीन टुकड़े से पता चलता है। डीएनए बैंड excised थे और डीएनए डीएनए निष्कर्षण स्पिन स्तंभ में ठंड से शुद्ध।

जीनोमिक डीएनए से (तालिका 2 में दिखाया गया है) को सफलतापूर्वक परिलक्षित मलेरिया जीनों pT7CFE-chis अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया गया। पुन: प्रवर्धन सिफारिश से जीन कीmbinant प्लास्मिड वेक्टर में क्लोन जीन टुकड़े की उपस्थिति का प्रदर्शन किया। प्रोटीन अनुवाद के लिए कार्यरत अभिव्यक्ति सिस्टम के प्रवाह चार्ट। चित्रा 2 में दिखाया गया आंकड़े 2A और 2B इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में 2-कदम और 1-कदम IVT युग्मित अनुवाद प्रणाली के एक कदम बुद्धिमान प्रक्रिया से पता चलता है। इन विट्रो में मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर प्लाज्मोडियम प्रोटीन की सफल अभिव्यक्ति rhoptry विशिष्ट खरगोश antisera द्वारा पुष्टि की गई। चित्रा 3 में सचित्र के रूप में, पुनः संयोजक प्रोटीन rhoptry विशिष्ट खरगोश antisera # 676 द्वारा मान्यता प्राप्त किया गया। पहले से दिखाया गया है, व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन पी से parasitophorous रिक्तिका प्रोटीन के खिलाफ antisera द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं कर रहे थे फाल्सीपेरम और पी yoelii व्यक्त प्रोटीन 32 के खिलाफ खरगोश antisera 676 की विशिष्टता का प्रदर्शन है। सामान्य खरगोश सीरम (एनआरएस) पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया नहींइन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली और 1-कदम IVT युग्मित अनुवाद प्रणाली (3B चित्रा) में 2-कदम का उपयोग अनुवाद। प्लाज्मोडियम पुनः संयोजक प्रोटीन की सफल अभिव्यक्ति ऐसे में जेल हिस्टडीन धुंधला और निकल एचआरपी 32 धुंधला के रूप में विभिन्न तकनीकों के द्वारा पुष्टि की गई। व्यक्त प्रोटीन आत्मीयता शोधन प्रणाली द्वारा शुद्ध किया गया। शोधन (कोई कॉलम इस्तेमाल किया) बैच विधि में किया जाता है। तकनीक 100 मिमी से 60 मिमी से Imidazole की एकाग्रता बदलकर अनुकूलित है। क्षालन के लिए अधिकतम एकाग्रता 250 मिमी है। चित्रा 4 अनुवादित प्रोटीन उत्पादों के 25 μl से अनुवादित प्रोटीन का सफल शुद्धि से पता चलता है। चित्रा -4 ए Maurer की फांक transmembrane प्रोटीन 18 के सफल शुद्धि से पता चलता है। 4B चित्रा PF3D7_0925900, पी के सफल शुद्धि से पता चलता है प्लाज्मोडियम yoelii जीन PY17X_0830000, एक की फाल्सीपेरम orthologकाल्पनिक प्रोटीन 32। चित्रा 4C प्रोटीन PY17X_1139200, नी राल मोती और 1x क्षालन बफर में 100 मिमी imidazole का उपयोग कर एक काल्पनिक प्रोटीन युक्त Armadillo दोहराता की सफल शुद्धि से पता चलता है। शुद्धिकरण के बाद प्रोटीन की उपज 3.5 माइक्रोग्राम / 25 μl है।

चित्र 1
पी चित्रा 1. प्रवर्धन फाल्सीपेरम और पी yoelii जीन पी। से परिलक्षित PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 और PFA0680cw के जीन टुकड़े का 1% agarose जेल दिखा ethidium ब्रोमाइड दाग पीसीआर उत्पादों फाल्सीपेरम जीनोमिक डीएनए।

चित्र 2
HeLa बस चित्रा 2. फ्लो चार्ट एड सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली। 2-कदम और इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों में 1-कदम दोनों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
प्रोटीन अभिव्यक्ति की चित्रा 3. immunoblotting पुष्टि। # 676 विरोधी सीरा और सामान्य खरगोश सीरम पूरे rhoptry विशिष्ट खरगोश का उपयोग करते हुए व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ antisera 676 (ए) जेट। (बी) सामान्य खरगोश सीरम व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया नहीं की। Parasitophorous रिक्तिका प्रोटीन पुनः संयोजक प्रोटीन 32 के साथ प्रतिक्रिया नहीं की।hres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा अनुवाद उत्पाद की सूक्ष्म मात्रा से प्रोटीन की 4. शोधन। निकल राल आत्मीयता विधि chelating का उपयोग करते हुए व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि। व्यक्त प्रोटीन (अनुवाद) (ए) PF3D7_0114100, (बी) PY17X_0830000, और (सी) PY17X_1139200 प्रोटीन निकल के साथ incubated रहे थे - chelating रेजिन बफर और शुद्धि बफर बंधन में Imidazole की अनुपस्थिति में निकल chelating राल के साथ शुद्ध कर रहे हैं। ऊष्मायन के बाद, मोती, centrifuged थे अनबाउंड प्रोटीन अलग हो गए थे और मोती धो बफर में दो बार धोया। बाध्य पुनः संयोजक प्रोटीन दो बार मोतियों की धुलाई के द्वारा पीछा eluted थे। अनूदित प्रोटीन, washes, eluates और मोतीवैद्युतकणसंचलन नमूना बफर में solubilized गया। Imidazole धोने (Imidazole की 20 मिमी) और क्षालन बफ़र्स (Imidazole की 100 मिमी) में इस्तेमाल किया गया था। Antisera # सफलतापूर्वक मान्यता प्राप्त 676 व्यक्त की और शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन। सामान्य खरगोश सीरम 3B चित्रा में इस शो के रूप में व्यक्त प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया नहीं की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> 200 केडीए
विशेषताएं मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली गेहूं के बीज का सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली खरगोश reticulocyte अभिव्यक्ति प्रणाली कोलाई lysate प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली
समय 3 घंटे में प्रतिलेखन और अनुवाद डन 20 घंटा - 10 के लिए 6 घंटा और अनुवाद के लिए ट्रांसक्रिप्शन शाही सेना है अलग होने की अनुवाद 90 मिनट लगते हैं डॉन1 घंटे में ई
उपयुक्त वेक्टर T7 वेक्टर किया जा सकता है SP6 वेक्टर T7 इस्तेमाल किया जा सकता है T7 इस्तेमाल किया जा सकता है
उपयुक्त पैमाने प्रयोगशाला संश्लेषण के लिए उपयुक्त बड़े पैमाने पर प्रोटीन संश्लेषण के लिए प्रयुक्त प्रयोगशाला और टीकाकरण अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रयोगशाला और टीकाकरण अध्ययन के लिए उपयुक्त
उद्धरण HeLa सेल मुक्त अर्क गेहूं के अर्क का भ्रूण Reticulocyte सेल के अर्क ई सेल lysate अर्क कोलाई
संशोधन सह translational और बाद translational संशोधन अनुवाद के बाद का संशोधन सह translational संशोधन अनुवाद के बाद का संशोधन
प्रोटीन का आकार अनुवादित 250 केडीए के लिए 8 केडीए 220 केडीए 250 केडीए
कोडोन अनुकूलन तंग तंग ढीला तंग
Disulphide बंधन गठन हाँ हाँ नहीं हाँ
प्राप्ति कम प्राप्ति उच्च उपज कम प्राप्ति बहुत ही उच्च उपज
लागत 10 प्रतिक्रियाओं के लिए $ 130.00 10 प्रतिक्रियाओं के लिए $ 173.00 5 प्रतिक्रियाओं के लिए $ 136.00 8 प्रतिक्रियाओं के लिए $ 159.00
प्रोटीन एकाग्रता प्रतिक्रिया प्रति 3 से 5 माइक्रोग्राम 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर 500 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर
सन्दर्भ 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

मलेरिया अनुसंधान में तालिका 1. सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम। सेल की तुलनास्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम वर्तमान में मलेरिया अनुसंधान में इस्तेमाल किया।

जीन आईडी Ortholog आईडी प्रोटीन पीसीआर के लिए प्राइमर अनुक्रम
PF3D7_1436300 Translocon घटक CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 PfMC-2TM Maurer की फांक प्रोटीन GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 काल्पनिक प्रोटीन GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 काल्पनिक प्रोटीन GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

अध्ययन में तालिका 2 Rhoptry जीनों। इस अध्ययन में 19 में व्यक्त विभिन्न जीनों की प्राइमरों।

सामग्री के नाम कंपनी सूची की संख्या विवरण
इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली 32 में 2-कदम थर्मो फिशर 88,856 बंद। हमेशा -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। गर्म पानी में गल न करें।
इन विट्रो युग्मित अनुवाद प्रणाली में 1-कदम थर्मो फिशर 88,860 हमेशा -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। वें मत करोगर्म पानी में ओ।

तालिका 3. हेला आधारित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम। प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया किट।

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Discussion

इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली और शुद्धि में दो कदम का उपयोग प्रोटीन की सफल अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) सफल प्रवर्धन और pT7CFE-chis प्लाज्मिड वेक्टर में जीन की क्लोनिंग; 2) 30 ओ सी पर शाही सेना transcribing; RNase अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन की 3) अनुवाद; 4) पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग राल नी और 5 के साथ लेपित मोती) पश्चिमी धब्बा पर विश्लेषण करने के परिणामों का उपयोग आत्मीयता आधारित शुद्धि प्रोटोकॉल का विकास। एक कदम IVT युग्मित प्रोटीन अनुवाद प्रणाली का उपयोग प्रोटीन की सफल अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) सफल प्रवर्धन और pT7CFE-chis प्लाज्मिड वेक्टर में जीन की क्लोनिंग; 2) 30 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसक्रिप्शन और प्रोटीन का अनुवाद; 3) पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग राल नी और 4 के साथ लिपटे मोतियों) पश्चिमी धब्बा पर विश्लेषण करने के परिणामों का उपयोग आत्मीयता आधारित शुद्धि प्रोटोकॉल का विकास।

वर्तमानly, सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम पुनः संयोजक मलेरिया प्रोटीन व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जाता है। मलेरिया प्रोटीन व्यक्त करने के लिए सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम की महत्वपूर्ण सुविधाओं समृद्ध जीन एटी डिकोड करने की क्षमता है, लंबे समय से translational को रोकते हैं, दोहराया एमिनो एसिड दृश्यों के सफल अभिव्यक्ति, ग्लाइकोसिलेशन तंत्र के अभाव और जीन ट्रंकेशन नियंत्रित करने के लिए प्लास्मिड की क्षमता की कमी है। इस अध्ययन में, हम इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली 32 में एक दो कदम और पी की अभिव्यक्ति के लिए एक एक कदम IVT युग्मित अनुवाद प्रणाली के उपयोग का प्रदर्शन पी के फाल्सीपेरम जीन orthologs । तालिका 1 में दिखाया गया एक शुद्धि प्रोटोकॉल विकसित की है और 1-कदम और इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों में 2-कदम से प्राप्त पुनः संयोजक प्रोटीन की सूक्ष्म संस्करणों शुद्ध के लिए अनुकूलित किया गया था के रूप में yoelii merozoite rhoptry जीनों। 4 पी फाल्सीपेरम जीन, एक transmembrane हाइड्रोफोबिक प्रोटीन, एक भविष्यवाणी की काल्पनिक एआरएम दोहराने PF3D7_0114100प्रोटीन PF3D7_1361800 और एक हाइड्रोफिलिक प्रोटीन PF3D7_0925900, 2-कदम और इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में 1-कदम का उपयोग व्यक्त किया गया। शुद्ध प्रोटीन की पैदावार निर्धारित किया गया है। यह दो ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के साथ एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन होता है और हम इन विट्रो अभिव्यक्ति प्रणाली सही ढंग से transmembrane प्रोटीन व्यक्त करते हैं और शुद्धि की आसानी के लिए अनुमति दे सकता है कि क्या निर्धारित करने में रुचि रखते थे क्योंकि प्रोटीन PfMC-2TM इन अध्ययनों में शामिल किया गया था।

दोनों एक कदम और दो ​​कदम अभिव्यक्ति प्रणालियों में प्रमुख अंतर यह है कि दो कदम अभिव्यक्ति प्रणाली एक स्थिर mRNA के लिखित और अनुवाद प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा गया है, जहां एक mRNA निर्भर प्रणाली है, कि है। इसके विपरीत, इन विट्रो युग्मित प्रतिलेखन में एक कदम / अनुवाद प्रणाली प्रतिक्रिया के दौरान प्रोटीन के सह-अनुवाद के बाद निरंतर प्रतिलेखन और mRNA की आपूर्ति शामिल है। दोनों 1-कदम IVT प्रतिलेखन / अनुवाद युग्मित ईहै xpression प्रणाली और इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में 2-कदम उच्च आणविक भार प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण किया गया। दोनों प्रणालियों कम आणविक भार पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त करने में सफल रहे थे। 1-कदम अभिव्यक्ति प्रणाली में, अनुवाद प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रोटीन के साथ एंटीबॉडी पार जेट मनाया गया। पार एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया विशिष्ट प्रोटीन अज्ञात कर रहे हैं और आगे की जांच की जरूरत है। उच्च आणविक भार प्रोटीन की अभिव्यक्ति 1-कदम और 2-कदम सिस्टम का उपयोग कर दोनों असफल रहा था। एक शुद्धि प्रोटोकॉल 1-कदम और इन विट्रो मानव कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों में 2-कदम दोनों का उपयोग कर व्यक्त अलग घुलनशीलता संपत्तियों की पुनः संयोजक प्रोटीन की सफ़ाई microvolumes के लिए विकसित किया गया था। प्रोटीन सफलतापूर्वक शुद्ध थे और 1-कदम के साथ अनुवाद जब इन विट्रो प्रोटीन अनुवाद प्रणाली में 2-चरण और 25 μl प्रति 1.5 माइक्रोग्राम का उपयोग करते हुए व्यक्त प्राप्त जब उपज 25 μl प्रति 3.5 माइक्रोग्राम था मैंवीटी प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली। 18 केडीए से 37 केडीए को बदलती कम आणविक भार प्रोटीन की अभिव्यक्ति सीधे आगे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और है। बहरहाल, उच्च आणविक भार अभिव्यक्ति प्रोटीन truncations में यह परिणाम है। कारण क्लोन डीएनए के लिए प्राप्त microvolumes करने के लिए, पीसीआर प्रवर्धन क्लोन उत्पादों को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कारण प्रतिक्रिया में एटीपी के उच्च एकाग्रता के लिए eIF2 अल्फा सबयूनिट की लगातार फास्फारिलीकरण हो सकता है सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर उच्च आणविक भार प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संभावित बाधाओं। इस संभावित सेल स्वतंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम 10 में बड़े प्रोटीन के संश्लेषण के दौरान प्रोटीन संश्लेषण के बढ़ाव को प्रभावित करता है जो सिस्टम में अनुवाद दीक्षा impairs।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलन शर्तों से uninfluenced है। न तो जीन codons और न ही प्लाज्मिड प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया है, और प्रोटीन refolding की आवश्यकता नहीं थी। इस प्रणाली के पी व्यक्त करता है3 घंटा और प्रोटीन की शुद्धि में roteins इस तरह के टीकाकरण या पेप्टाइड अनुक्रमण के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन के प्रसंस्करण के रूप में आगे बहाव के अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है, 2 घंटे में प्राप्त किया जा सकता है। एकाधिक पुनः संयोजक प्रोटीन प्रतिरक्षा सीरा स्क्रीनिंग और संभावित वैक्सीन उम्मीदवार अणुओं की पहचान के लिए माइक्रोएरे स्वरूपों का उपयोग, HeLa सेल मुक्त प्रणाली के साथ व्यक्त किया जा सकता है। इसके अलावा, संभावित immunogenic प्रोटीन अभिव्यक्ति स्केलिंग द्वारा प्राप्त प्रोटीन स्क्रीन के माध्यम से पहचान की है और चयनित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

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Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

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