Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

ביטוי של חלבוני מלריה במערכות תא מבוסס נותר מאתגר. אנו מדגימים שתי מערכות ביטוי תא חופשי צעד וIVT צעד אחד (בתרגום חוץ גופית) לביטוי חלבוני rhoptry רקומביננטי מלריה מתאי הלה. אנו משתמשים במערכת לטיהור מבוססת זיקת Ni-שרף לטהר את חלבוני rhoptry.

Abstract

המלריה גורמת לתחלואה ותמותה משמעותיות גלובליות. אין חיסון שגרתי זמין כעת. אחת הסיבות העיקריות לחוסר חיסון הוא האתגר של זיהוי מועמדי חיסון מתאימים. חלבוני מלריה הביעו באמצעות מערכות ביטוי תא מבוססות פרוקריוטים ואוקריוטים גרועים הם glycosylated, בדרך כלל לא מסיסות ולעבור קיפול לא נכון המובילים לחיסוני מופחתים. מערכות הביטוי חופשיות תא lysate נבט חיטה, lysate reticulocyte הארנב וcoli Escherichia כיום משמשות לביטוי של חלבוני מלריה. עם זאת, משך זמן ביטוי וglycosylation לא תקינה של חלבונים עדיין אתגר. אנו מדגימים ביטוי של חלבוני Plasmodium במבחנה באמצעות מערכות ביטוי חופשי תא מבוסס הלה, המכונות "מערכות במבחנה אנושיות תא חופשי ביטוי". מערכות ביטוי 2 הלה התא מבוסס חופשיות לתמלל mRNA ב -75 דקות ו -3 μl של transcribאד mRNA מספיק כדי לתרגם חלבונים ב -90 דק '. מערכת הביטוי 1-הצעד היא מערכת ביטוי בשילוב תרגום שעתוק ו; השעתוק ותרגום שיתוף מתרחש בשעה 3. התהליך גם יכול להתארך למשך 6 שעות על ידי אספקת אנרגיה נוספת. במערכת הביטוי 2-הצעד, mRNA הוא עיבד ראשון ולאחר מכן הוסיף לתערובת התרגום לביטוי חלבון. אנו מתארים איך לבטא את חלבוני מלריה; השסוע של PF3D7_0114100 מאוורר הידרופובי - חלבון 2 הטרנסממברני (PfMC-2TM), חלבון PF3D7_0925900 הידרופילי וחוזר ארמדיל המכיל חלבון PF3D7_1361800, באמצעות מערכת הביטוי חופשי תא מבוסס הלה. החלבונים באים לידי ביטוי בכמויות מייקר העסקת אסטרטגיות ביטוי 2-צעד והצעד 1. שיטת טיהור זיקה לטהר 25 μl של חלבונים הביעו באמצעות מערכת חופש הביטוי במבחנה התא אנושי גם מתוארת. תשואת חלבון נקבעה על ידי assay של רדפורד והביעוניתן לאשר חלבונים מטוהרים על ידי ניתוח מערבי סופג. חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי יכולים לשמש לחיסונים, immunoassays ורצף חלבון.

Introduction

במחקר מלריה, ביטוי של חלבונים חיסוניים באמצעות מערכות תא פרוקריוטים או אוקריוטים מבוססים עדיין מהווה אתגר. עושר AT של הגנום Plasmodium ומנגנונים שלאחר translational ידועים 14,7, תורם לקשיים הקשורים בקבלת חלבונים מקופלים וחיסוניים כראוי ללימודי ייצור נוגדנים וחיסון. מערכות פרוקריוטים כגון coli Escherichia שימשו לביטוי חלבון רקומביננטי. מערכות פרוקריוטים הן בעלות נמוכה, יעילות, לייצר תשואות גבוהות של חלבון רקומביננטי ויש לי וקטורי שיבוט מרובים. לארח E. תאי coli הם קל להפוך ותאים לצמוח במהירות. עם זאת, יש לי מערכות פרוקריוטים מגבלות כגון חוסר תחלופה אמינו חומצה, שינוי שלאחר translational, סיכון לזיהום, מוצרים הטרוגניים והצטברות של חלבונים רקומביננטי בתוך גוף הכללה 24.

במחקר על ידי אל Mehlin et. (2006), 1000 מסגרות פתוחות קריאה (ORF) באו לידי ביטוי. כ -7% מהחלבונים הביעו היו 14 מסיסים. Insolubility נצפה הוא בשל האופי המגמתי של גנים והתדירות הגבוהה של קודונים המשמשות באופן אידיאלי על ידי Plasmodium AT הגנום עשיר 14. אסטרטגיה חלופית להתגבר על בעיה זו פותחה על ידי שימוש בפלסמידים או תאי מארח מכילים tRNAs שיכיר קודונים או קודונים התואמים את התדרים 3 נדירים. גם לאחר ביצוע אופטימיזציות אלה, מנות קטנות מאוד של החלבונים באות לידי ביטוי כמסיס, פעיל וחיסוני 14. מערכות ביטוי התא ללא מכילות את כל הרכיבים דרושים לשעתוק ותרגום כגון ריבוזומים, גורמי ייזום, גורמי התארכות (גורמי תרגומים), tRNA וsynthetases aminoacyl-tRNA. שני תגובות השעתוק ותרגום הם מצמידים ב11,29 הליך צעד אחד. Transcriתגובת ption מתבצעת בצינור לפני הכמות המתאימה של mRNA היא מודגרות עם מכונות תרגום ב11,29 צינור שונה. למרות ששיטות אלה בהצלחה בPlasmodium sp. ביטוי חלבון, חסרון עיקרי הוא משך זמן לביטוי חלבונים, שהם כ -22 שעות 29. בנוסף, העלות הגבוהה של ציוד להכללה בפרוטוקולים 29, הכנות עתירות העבודה של lysate התא וחוסר עקביות בהכנות רכיב, להפוך את המערכות אלה אינן ניתנות להשגה. המוקד העיקרי של חוקרים לפיתוחה של מערכת ביטוי חופשית תא תלוי בגורמים כגון הנדסה גנטית מהירה, תשואות מהירות עם ריכוזים גבוהים והכנות lysate ישר קדימה 1.

מערכות אוקריוטים כגון שמרים, שורות תאי יונקים, מערכת ביטוי בתיווך baculovirus, thermophilia Tetrahymena, discoideum Dictyostelium ומערכות ביטוי טפילים suפרק כשושנת יריחו שימש לביטוי חלבון רקומביננטי 7. מערכות אוקריוטים לשתף יחסי פילוגנטי ולכן גם חולקות מאפיינים כגון glycosylation, acylation, אג"ח disulphide היווצרות, אינטראקציה מלווה, proteolysis ומידור תת-תאי. אירועי הפרשת חלבון באאוקריוטים למנוע הצטברות ומקטין רעילות למערכות ביטוי 13. השימוש בשמרי מערכות עדיפים כפי שהם מתאימים לביטוי חלבון בקנה מידה גדולה ולהשגת תשואות גבוהות 4. שני פ חלבוני falciparum PfCP-29 וPvs25 הופקו באמצעות מערכת השמרים 4. עם זאת, חסרון עיקרי בסינתזה של רוב החלבונים היה דפוסי N ו- O-glycosylation לא סדירים, קיפול וחיתוך של חלבונים מהצורה הטבעית שלהם 4 לא תקינים.

השימוש בתאי יונקים לסינתזה של חלבונים רקומביננטי הוא עתיר עבודה והוא expensive לשמור שורות תאי רקומביננטי יציבים 4. לכן, תאי יונקים היו מוגבלים לניתוח איתות חלבון, אינטראקציות חלבון ואינטראקציות טפילות-מארח וגם לבדיקה חיסוני DNA 4. ה- DNA האנושי ומערכת ה- mRNA במבחנה ביטוי חלבון תא ללא מתואר במסמך זה מערכת תאים שמקורם הלה מבוסס יונקים המבטאת חלבונים ב 3 שעות. חלבונים הביעו באמצעות וקטור ביטוי pT7CFE1-cHis יש תג C-המסוף מאפשר זיהוי וטיהור. המערכת מבוססת הלה הוא השלים עם גורמי חניכת תרגום ותרגום רגולטור, ובכך משפרת את היעילות של מערכת התרגום. חלבונים יכולים להיות מתורגמים במהירות, הוקרנו, מאומת ומעובד לשימוש ביישומים חיסוניים ומבניים שונים 15.

מערכות ביטוי אוקריוטים תא ללא כגון נבט חיטה וreticulocyte הארנב משמשות כיום לביטוי של varחלבוני אוקריוטים ious כוללים חלבוני Plasmodium 11,29. בנוסף, ה מערכות תא ללא מבוססות coli גם מועסקות לביטוי חלבון אוקריוטים 11. טבלת 1 מסכמת מערכות ביטוי תא חופשי שונות על ידי השוואת תכונות של המערכות, כמו גם את קלות שימוש במערכות לביטוי חלבונים. יש מערכת התא ללא אדם בהשוואה לאחרים את היכולת לבצע שינויי פוסט ושיתוף translational ופחות יקר. אופטימיזציה קודון היא אפשרית וניתן לבצע את כל התגובות בשעה 3. מערכת הלה היא מערכת תרגום אידיאלית לסינתזת חלבון במעבדת ההגדרה.

יתרון עיקרי של מערכות ביטוי אנושיות תא חופשי על פני מערכות אחרות תא ללא הוא הזמינות של כמה שורות תאים שונות הנגזרות מאיברים ורקמות שונים. כמה סוגים של מערכות תא ללא יכולים להיות מתוכננים בהתאם לקו התא. התמציתיש לי של מקורם בתאי יונקים יעילות גבוהה יותר לסנתז חלבונים גדולים יותר מכל מערכות ביטוי תא חופשי אחרות. גם מערכות ביטוי תא חופשי אלה יכולים לשמש ביישומי אפיון אבחון וחלבון כגון מערכי מיקרו 30. שורות תאי הלה הפופולריות הן בשימוש נרחב ביותר לבצע את הביטוי של חלבונים 33. Reticulum endoplasmic בשורות תאי הלה אינו מפותח, שהוביל להיעדרות של פעילות שינוי glycosylation לאחר translational 33. עם זאת, הוא האמין במערכת זו כדי להיות יתרון עבור סינתזת חלבון Plasmodium כPlasmodium גם חסר שינוי תרגום ההודעה glycosylation 29. פרוטוקול תמלול בתרגום החופשי תא הלה הוא קל לביצוע, לא יקר ויכולים לבוא לידי ביטוי חלבונים בדקות 90, מוכן לטיהור ויישומים נוספים במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של תרביות תאים טפיל, אוסף של טפיל פלטות

  1. הכן תקשורת RPMI-1640-HEPES על ידי הוספת 10 גרם של האבקה RPMI-1640, 66 מ"ג של סולפט gentamycin, סודיום ביקרבונט 2 גרם, חיץ HEPES 5.9 גר ', 50 hypoxanthine מ"ג ו -3.8 G דקסטרוז בL 1 סטרילי DH 2 O. מערבבים בעזרת בוחש מגנטי שולחן עד שכל האבקה מתמוססת במים מזוקקים 1 ליטר. בצע סינון מיקרו של תקשורת באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. אחסן את התקשורת בבקבוקים סטריליים.
  2. לשטוף נגוע (טרי) הקלד + אריתרוציטים באמצעות RPMI. הכן 5 המטוקריט% מאריתרוציטים (0.5 מיליליטר של אריתרוציטים טריים שטפו ב9.5 מיליליטר 10% + סרום אנושי RPMI).
  3. הפוך 15% בסרום אנושי + RPMI (15 מיליליטר של סרום אדם ו -85 מיליליטר של RPMI) ליזום הטיפוח של טפילים. הפוך 10% בסרום אנושי וRPMI (10 מיליליטר של סרום אדם ו -90 מיליליטר של RPMI) להמשיך culturing של טפילים בתאי דם אדומים.
  4. תרבות פ falciparum (3D7 וFCR-3 זנים) בסוג+ אדם אריתרוציטים בשעה 5 המטוקריט% וparasitemia 20% בצלחת פטרי או בקבוק תרבות 75 סנטימטר 3. לשמור על התרבות במבחנה על פי השיטה של טרגר וג'נסן צנצנת נר 26. לחלופין, לשמור על תרבויות בחממה על 37 מעלות צלזיוס שמירת גז CO 2 ו -3.4% -9.5% N 2. תרבות פ falciparum בRPMI 1640-HEPES תקשורת בתוספת 10% בסרום אנושי.
  5. לסנכרן פ תרבות falciparum ידי הוספת Percoll 65% (65 מיליליטר של Percoll + 35 מיליליטר של RPMI-1640 ללא סרום אנושי) לתרבות להתרכז 27.
  6. צנטריפוגה להתרכז התרבות עם Percoll ב 2500 XG דקות 5 שתוצאת 3 שכבות. בזהירות, בעזרת פיפטה העברה לבודד schizonts מהעברת השכבה האמצעית לתוך צינור נפרד בתנאים אספטיים 27.
  7. שטוף את התרבויות המבודדות עם 10% בסרום אנושי + RPMI-1640 פעמיים כדי להסיר Percoll העודף על ידי צנטריפוגה ב 7500 XG במשך 5 דקות. דיscard supernatant כל זמן בתנאים אספטיים 27.
  8. המשך culturing פ המסונכרן schizonts falciparum בסרום 10% אדם + 27 RPMI-1640.
  9. לאסוף schizonts ידי טיפול Plasmodium אריתרוציטים -infected עם 10 מ"מ טריס pH 8.8 וצנטריפוגה ב15000 XG במשך 15 דקות 23. כדורי טפיל חנות ב -70 ° C הבאים תוספת של 5 μl של מעכב פרוטאז (aprotinin) לכדורים. השתמש כדורי טפיל להפקת חלבון, בידוד הדנ"א הגנומי ובידוד RNA.

2. הכנת פלסמיד וקטור

  1. לבודד הדנ"א הגנומי מפ כדורי schizont falciparum מוכנים מתרבויות של parasitemia כ -20%.
  2. להוסיף 600 μl של 10mm טריס- HCl של pH 7.6, 50 מ"מ EDTA pH 8.0, SDS 0.1% ו1 מ"ג / מיליליטר proteinase K, לכדורים בצינור microcentrifuge, homogenize גלולה באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצורף מחט 26 G. חלופי מילוי המזרקעם תערובת גלולה ופי 20 לרוקן לתוך צינור microcentrifuge. דגירה O homogenate צינור המכיל / N באמבט המים C ° 50.
  3. בצע פנול - כלורופורם חילוץ (P + C) על ידי הוספת 600 μl של P + C (300 μl של פנול וμl 300 של כלורופורם) לגלולה הומוגני. צינור כובע בחוזקה ולנער את התערובת במרץ על ידי היפוך קצה לקצה צינור. צינור צנטריפוגה ב 14,000 XG למשך 2 דקות ולאסוף פתרון ימי עליון באמצעות micropipette לתוך צינור microcentrifuge חדש. חזור על פעולה זו פעמיים.
  4. להוסיף 600 μl של כלורופורם לשכבה המימית בצינור החדש מצעד 2.1.2. מערבולת הצינור במשך 10 שניות ו צנטריפוגות ב 14,000 XG למשך 2 דקות. מדוד את השכבה המימית העליונה עם micropipette ולהעביר אותו לצינור microcentrifuge חדש.
  5. להוסיף 0.1 כרך של pH אצטט 5 M נתרן 5.5 וכרך 1 של isopropanol (אם שכבה מימית היא 300 μl להוסיף 30 μl של pH אצטט 5 M נתרן 5.5 330 + μl של isopropanol) להניח מימייםאה מצעד 2.1.3. דגירה הצינור ב RT במשך 15 דקות.
  6. צנטריפוגה צינור על 14,000 XG במשך 10 דקות כדי לזרז גלולה DNA. בטל supernatant ולשטוף גלולה עם 70% אתנול 100 μl (70 μl של אתנול ו -30 μl של DH 2 O) כדי להסיר עודף מלח מה- DNA. DNA החנות ב -50 μl של DH 2 O ב -20 ° C.
  7. עיצוב קדימה ולהפוך פריימרים באמצעות תוכנה או באופן ידני להגברה של פ גני falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 וPF3D7_0114100 זוהו בעבר במחקרי proteome 16,18 עם אתרי הגבלה מתאימים להתיר שיבוט של רצפי גנים לאתרי שיבוט המרובים של פלסמיד ביטוי pT7CFE1-CHis כפי שמוצגים בטבלה 2.
  8. הפוך תערובת תגובת 50 μl על ידי הוספה; 5 μl של פ המבודד הדנ"א הגנומי falciparum, 5 μl של 10x חיץ, 5μl של MgCl 2, 1.5 μl של פריימר קדימה, 1.5 μl שלפריימר ההפוך, 0.5 μl של פולימראז T7 DNA ו31.5 μl של DH 2 O ולבצע תגובת השרשרת של פולימראז (PCR) בשעה 94 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות לdenaturation, 50 מעלות צלזיוס במשך דקות שניות 30 1 להארכה ו -72 מעלות צלזיוס במשך 9 דקות לחישול וrenaturation להגברת גנים שמוצגים בטבלה 1.
  9. מוצרי ה- PCR נפרדים על 1% agarose ג'ל (1 גרם של agarose ושל EDTA אצטט טריס 100 מיליליטר (טה) חיץ) 32.
  10. חותך את להקות ה- DNA PCR מוגברות מagarose ג'ל, מניח את פרוסות ג'ל המכילות DNA בטור ספין חילוץ ג'ל DNA ולהקפיא ב -20 ° C במשך 5 דקות. הוסף לisopropanol 100 μl לפרוסות ג'ל הקפואות וצנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות.
  11. למדוד מסוננת בצינור האיסוף מהשלב 2.5 הזרימה דרך מימית, באמצעות micropipette ולהעביר לצינור חדש. להוסיף 0.1 כרך של נתרן אצטט 5 M וצנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ולהוסיף 10 μl של DH 2 O הגלולה DNA דואר.
  12. לעכל את וקטור pT7CFE1-CHis ביטוי ושברי DNA המטוהר (מ -2.6) בשני צינורות נפרדים על ידי הוספת 3 μl של פלסמיד ו -5 μl של מוצרי גן PCR לכל צינור. הוסף לכל צינור, 1 μl של אנזימי הגבלה ספציפיים, 2 μl של חיץ תגובה ו -14 μl של DH 2 O.
  13. הוסף 3 μl של פלסמיד מתעכל, 5 μl של קטעי DNA מתעכלים, 2 μl של 10x חיץ האנזים, μl 1 של האנזים ו -9 μl של DH 2 O בצינור microcentrifuge. לדגור על 12 מעלות CO / N.
  14. להוסיף 0.1 כרך של 3 אצטט M נתרן ב- pH 5.5 ו -2 כרכים של אתנול (אם צינורות קשירת הנפח שלך הוא 20 μl להוסיף 2 μl של 3 אצטט M נתרן + 44 μl של אתנול) לצינור מצעד 2.14. מערבבים היטב דגירה ב -20 ° C במשך 15 דקות.
  15. צנטריפוגה צינור על 14,000 XG במשך 15 דקות. מוציא בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה מיקרו מבלי להפריע גלולה.
  16. להוסיף 70% אתנול לא 100 μlo גלולה מצעד 2.10. צנטריפוגה צינור על 14,000 XG במשך 5 דקות. להסיר ולסלק supernatant. הוסף 10 μl מים nuclease חינם לגלולת DNA.

3. ביטוי חלבון שימוש במערכת ביטוי חינם תאים אנושיים חוץ גופית

  1. הכן 20 μl של תערובת שעתוק על ידי מדידת 2 μl של pT7CFE1-CHis פלסמיד דנ"א רקומביננטי, 4 μl של חיץ שעתוק 5x, 4 μl של תערובת NTP, 2 μl של T7 RNA פולימראז ו -8 μl מים nuclease חינם עבור 2-צעד אדם בביטוי חלבון חוץ גופית באמצעות תבניות DNA. מערבבים את המרכיבים בצינור microcentrifuge ו דגירה של 75 דקות ב 30 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  2. קח 2 μl של תערובת השעתוק ולהוסיף אותו לתערובת של 23 μl תרגום המכילה 12.5 μl של lysate תא הלה, 2.5 μl של חלבוני אבזר, 1 μl של תמיסת מלח, 0.5 μl של חומצות אמינו -Met, 0.5 μl של חומצות אמינו -Leu, 181; L של מעכב RNAse, 1.25 μl של תמהיל אנרגיה ו3.75 μl מים nuclease חינם.
  3. דגירה את תערובת התרגום מהשלב 3.2 על 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. חנות מתורגמת מוצרים ב -20 ° C.
  4. הכן 25 μl של שעתוק ותרגום תערובת על ידי הוספת 3 μl של pT7CFE1-CHis פלסמיד דנ"א רקומביננטי, 2 μl מים nuclease חינם, 5 μl של תערובת תגובה, 12.5 μl של lysate הלה ו -2.5 μl של חלבוני אבזר ל1-צעד ביטוי אנושי יחד חלבון IVT לתבניות DNA.
  5. דגירה תערובת התגובה מצעד 3.4 למשך 90 דקות עד 6 שעות על 30 מעלות צלזיוס. אחסן את מוצרי התרגום ב -20 מעלות צלזיוס.

4. טיהור של חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי

  1. להוסיף 75 μl של חיץ טיהור 1x 25 μl של מוצר תרגום לעשות תערובת טיהור 100 μl.
  2. להוסיף שרף chelating ניקל 100 μl לטיהור של mixt 100 μlיור. לשטוף Ni-שרף פעמיים על ידי הוספת 300 μl של DH 2 O ו -300 μl של החיץ המחייב. מחדש להשעות שרף וצנטריפוגות ב 14,000 XG דקות 1 כדי להסיר אתנול עודף.
  3. להוסיף תערובת של טיהור 100 μl מצעד 4.2-100 μl של שרף chelating ניקל ודגירה את התערובת למשך 60 דקות ב RT.
  4. צנטריפוגה את התערובת על 14,000 XG דקות 1 ולאסוף supernatant לתוך צינור טרי שכותרתו "לזרום דרך".
  5. שרף לשטוף עם של חיץ לשטוף 1x 100 μl (imidazole 20 מ"מ, O מ"מ לאא 2 PO 4 ב- pH 8, 2.5 M NaCl וDH 2 250). צנטריפוגה ב 14,000 XG דקות 1 ולאסוף supernatant בצינור הטרי שכותרתו "לשטוף". חזור על שלב 4.5 פעמיים.
  6. להוסיף למאגר elution 1x 100 μl (100 מ"מ Imidazole, 250 מ"מ Na 2 PO 4 ב- pH 8.0, 2.5M NaCl וDH 2 O) לשרף והדגירה במשך 15 דקות. צנטריפוגה ב 14,000 XG דקות 1. האם צעד elution פעמיים. כלזמן לאסוף supernatant לתוך צינורות טריים microcentrifuge ותווית כ" eluate ".
  7. לאחר elution, לשטוף שרף פעמיים כמתואר בשלב 4.5. חנות לזרום דרך, מתרחץ ודגימות elution ב -20 ° C או נמוך יותר. שרף חייב להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס. השתמש 30 μl של כל דגימה לSDS-PAGE וניתוח immunoblotting.

Coomassie חלבון 5. (רדפורד) Assay 34

  1. הכן את פתרונות אלבומין בסרום שור הסטנדרטי (BSA) עם הריכוז 20 מיקרוגרם / מיליליטר (10 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -90 μl של DH 2 O), 40 מיקרוגרם / מיליליטר (20 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -80 μl של DH 2 O), 60 מיקרוגרם / מיליליטר (30 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -70 μl של DH 2 O), 80 מיקרוגרם / מיליליטר (40 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -60 μl של DH 2 O), 100 מיליליטר / ק"ג (לערבב 50 μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -50 μl של DH 2 O), 160 מיקרוגרם / מיליליטר (80 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -20 μl של DH2 O) ו -200 מיקרוגרם / מיליליטר (של BSA 100 μl (2 מ"ג / מיליליטר).
  2. מדד 5 μl של זרימה דרך, מתרחץ ודגימות eluate מצעד 4.7. להוסיף 95 μl של DH 2 O.
  3. הוסף 5 מיליליטר של מגיב הכחול Coomassie לתערובות מצעדים 5.1 ו -5.2. לכסות את הצינורות עם parafilm ומערבולת למשך 10 שניות ואז דגירה של 20 דקות ב RT.
  4. באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד צפיפות אופטית (OD) באורך הגל של 650 ננומטר לצינורות חלבון מצעד 5.3. ריכוז עלילה לעומת קריאת OD כדי לקבוע את ריכוז החלבון 34.

6. מערבי סופג

  1. הוסף 5 μl של תמציות schizont מפ falciparum, 2 μl של Escherichia coli הביע Rhop-3 חלבונים רקומביננטי 31, 5 μl של חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי באמצעות 2-צעד וצעד 1 במערכות ביטוי אנושיות מבחנה 10 μl של מוצרי חלבון מטוהרים בשיטת זיקה להפריד צינורות. להוסיף mercaptoethanol מכיל מאגר מדגם אלקטרופורזה על צינור אחד עבור נפח סופי של 20 μl לעשות דגימות חלבון solubilized. מרתיחים צינורות במשך 2 דקות.
  2. לטעון דגימות חלבון solubilized על ג'לי SDS-PAGE 10% להפריד חלבונים.
  3. העבר את החלבונים הופרדו מג'לי SDS-עמוד לנייר nitrocellulose (NCP) על ידי electrophoresing ב 35 mA הנוכחי לג'ל בתא מערבי סופג חצי יבש לשעה 2.
  4. בלוק NCPs בעקבות העברה עם 2% חלב ללא שומן.
  5. דגירה חסומה NCPs עם נוגדני polyclonal הבאים בדילול 1: 100 ב 2% חלב לבצע מערבי סופג; נוגדן ארנב # 676 21 ספציפי לפ rhoptries merozoite falciparum, נוגדנים ספציפיים לעכבר 20 פ yoelii ופ rhoptries berghei merozoite, antisera # 685 ספציפי לפ חלבון vacuole parasitophorous falciparum, סרה (אנטיגן סרין העשיר) 22 ונוגדנים ספציפיים למאוורר217; s חלבון שסוע PfMC-2TM 28.
  6. גם דגירה NCPs ב 1: 100 פקדי עכבר וסרום הארנבת וsupernatant התרבות בילתה (SCS) מתאי מיאלומה SP2 רגילים מדוללים שליליים.
  7. דגירה NCPs עם נוגדנים ובקרות על 4 המעלות צלזיוס O / N.
  8. לשטוף NCPs 4x עם כתם חיץ דגירה NCPs עם נוגדנים ספציפיים משניים מינים מצומדת לperoxidase חזרת (HRP) בדילול 1: 1000 ב 2% חלב.
  9. לשטוף NCPs 4x עם חיץ כתם. דגירה שטפה NCPs עם פתרון פיתוח הצבע + B (פתרון: להוסיף 50 מ"ל של 1x כתם חיץ ו -30 μl של H 2 O 2; פתרון B: להוסיף 10 מיליליטר של מתנול ו -30 מ"ג של 3-כלורו-naphtol) במשך 30 דקות בחושך. לנתח את תוצאות כתם מערביות colorimetrically.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימות של החלבונים רקומביננטי לידי ביטוי בתגובתיות עם נוגדנים ספציפיים היא צעד ראשון חשוב במאשר את הקיפול הנכון של החלבונים הביעו. חלבוני מלריה רקומביננטי באו לידי ביטוי באמצעות צעד אחד ושני צעד במערכות ביטוי מבחנה תא אנושי חופשיות. החלבונים רקומביננטי הם שיטת זיקת Ni-chelating מטוהרת. לאחר מכן, אנו משמשים antisera נגד rhoptries merozoite השלם בסופג המערבית של חלבונים רקומביננטי מופרדים SDS-עמוד.

איור 1 מציג ברי גן PCR מוגברים של PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 וPF3D7_1436300 ב1% agarose ג'ל. להקות ה- DNA היו נכרת וDNA מטוהר על ידי הקפאה בטור הפקת DNA ספין.

גני מלריה מוגברים בהצלחה (שמוצגים בטבלה 2) מהדנ"א הגנומי היו משובטים לתוך וקטור ביטוי pT7CFE-CHis. Re-ההגברה של גנים מRecoפלסמידים mbinant הפגינו הנוכחות של שברי הגן המשובטים בווקטור. תרשים הזרימה של מערכות ביטוי מועסקות לתרגום חלבון מוצג באיור 2. 2A דמויות ו2B מראה הליך חכם צעד של מערכת תרגום IVT מצמידים 1-צעד-הצעד 2 במערכת המבחנה אנושית תא חופשית ביטוי ו. ביטוי מוצלח של חלבוני Plasmodium באמצעות מערכות ביטוי חופשי תא אנושי במבחנה אושר על ידי antisera ארנב הספציפי rhoptry. כפי שמודגם באיור 3 א, חלבונים רקומביננטי הוכרו על ידי antisera # ארנב הספציפי rhoptry 676. חלבונים רקומביננטי כפי שהוצג קודם, הביע לא הוכרו על ידי antisera נגד חלבוני vacuole parasitophorous מפ falciparum ופ yoelii מדגים את הספציפיות של antisera ארנב 676 נגד החלבונים הביעו 32. סרום ארנבת רגיל (NRS) לא הגיב עם חלבונים רקומביננטימתורגם באמצעות 2-צעד במערכת 1-צעד IVT שילוב תרגום (איור 3) מערכת מבחנה אנושית תא חופשית ביטוי ו. הביטוי המוצלח של חלבונים רקומביננטי Plasmodium אושר על ידי טכניקות שונות כגון צביעת היסטידין בג'ל וניקל-HRP מכתים 32. חלבונים הביעו היו מטוהרים על ידי מערכת טיהור זיקה. טיהור מתבצעת בשיטה אצווה (ללא עמודים בשימוש). הטכניקה היא מותאמת על ידי שינוי הריכוז של Imidazole מ- 60 מ"מ עד 100 מ"מ. הריכוז האופטימלי עבור elution הוא 250 מ"מ. איור 4 מראה טיהור מוצלחת של חלבונים מתורגמים מ -25 μl של מוצרי חלבון מתורגמים. איור 4 א תערוכות טיהור מוצלחת החלבון הטרנסממברני השסוע של מאוורר 18 של. איור 4 מציג טיהור מוצלחת של PF3D7_0925900, פ ortholog falciparum של PY17X_0830000 Plasmodium yoelii הגן,חלבון היפותטי 32. איור 4C תערוכות טיהור מוצלחת של חזרות ארמדיל המכילות חלבון PY17X_1139200, חלבון היפותטי באמצעות חרוזים שרף ניקל ו- 100 מ"מ imidazole במאגר elution 1x. התשואה של חלבון לאחר הטיהור היא 3.5 מיקרוגרם / 25 μl.

איור 1
איור 1. הגברה של פ falciparum ופ גני yoelii. מוצרי ה- PCR 1% ברומיד ethidium מראה agarose ג'ל מוכתם של שברי גן של PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 וPFA0680cw המוגבר מפ הדנ"א הגנומי falciparum.

איור 2
תרשים זרימה של איור 2. bas הלה מערכת תא חינם אד ביטוי. ייצוג סכמטי של שני 2-צעד וצעד 1 במערכות ביטוי חופשי תא אנושי מבחנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. אישור immunoblotting של ביטוי חלבון. ניתוח כתם מערבי של חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי באמצעות ארנב ספציפי כל rhoptry אנטי-סרום # 676 וסרום ארנבת רגיל. Reactivity () של antisera 676 עם חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי. סרום ארנבת (ב) רגיל לא הגיב עם החלבונים רקומביננטי לידי ביטוי. חלבון vacuole Parasitophorous לא הגיב עם חלבונים רקומביננטי 32."Target =" _ hres.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. טיהור של חלבונים מכרכי מיקרו של מוצר תרגום. טיהור של חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי באמצעות ניקל chelating שיטת זיקת שרף. חלבוני PY17X_1139200 חלבונים הביעו (תרגום) (א) PF3D7_0114100, (ב) PY17X_0830000, ו- (ג) הודגרו עם ניקל - שרפים chelating הם מטוהרים עם שרף chelating ניקל בהעדר imidazole במחייבים חיץ חיץ וטיהור. לאחר דגירה, חרוזי centrifuged, חלבונים מאוגד הופרדו והחרוזים נשטפו פעמיים בחיץ לשטוף. חלבונים רקומביננטי Bound היו eluted פעמיים ואחרי שטיפה של חרוזים. תורגם חלבונים, מתרחץ, eluates וחרוזיםהיו solubilized במאגר מדגם אלקטרופורזה. Imidazole שימש בכביסה (20 מ"מ של Imidazole) וelution מאגרים (של Imidazole 100 מ"מ). Antisera # 676 המוכרים בהצלחה הביע וחלבונים רקומביננטיים מטוהרים. סרום ארנבת רגיל לא הגיב עם חלבונים הביעו כמופע באיור 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

<td> 200 kDa
תכונות מערכת ביטוי תא-חינם אנושית תא נבט חיטה מערכת ביטוי חופשית מערכת ביטוי reticulocyte ארנב מערכת ביטוי חלבון lysate E.coli
זמן עשה שעתוק ותרגום בשעה 3 תמלול לשעה 6 ותרגום עבור 10 - 20 שעות תרגום יש RNA להיות מבודד לוקח 90 דקות דוןדואר בשעה 1
וקטור מתאים וקטור T7 יכול להיות וקטור SP6 ניתן להשתמש T7 ניתן להשתמש T7
בקנה מידה מתאימה מתאים לסינתזת מעבדה המשמש לסינתזת החלבון בקנה מידה הגדולה מתאים למחקרי מעבדה וחיסונים מתאים למחקרי מעבדה וחיסונים
תמצית תמציות תא ללא הלה עובר של תמציות חיטה תמציות תא reticulocyte E. coli תמציות lysate התא
שינוי שיתוף translational ושינוי שלאחר translational שינוי translational הודעה שיתוף translational שינוי שינוי שלאחר translational
גודל של חלבון מתורגם 8 kDa 250 kDa 220 kDa 250 kDa
אופטימיזציה קודון הדוק הדוק רופף הדוק
Disulphide היווצרות קשר כן כן לא כן
תשואה תשואה נמוכה תשואה גבוהה תשואה נמוכה מאוד תשואה גבוהה
עלות $ 130.00 עבור 10 תגובות $ 173.00 עבור 10 תגובות $ 136.00 עבור 5 תגובות $ 159.00 עבור 8 תגובות
ריכוז חלבון 3 עד 5 מיקרוגרם לכל תגובה 100 מיקרוגרם / מיליליטר 100 מיקרוגרם / מיליליטר 500 מיקרוגרם / מיליליטר
אזכור 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

מערכות טבלה 1. תא חופש ביטוי במחקר מלריה. השוואה של תאמערכות חופש ביטוי המשמשת כיום במחקר מלריה.

הגן מזהה Ortholog זיהוי חלבון רצף פריימר לPCR
PF3D7_1436300 רכיב Translocon CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 החלבון השסוע של PfMC-2TM מאוורר GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 חלבון היפותטי GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 חלבון היפותטי GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

טבלת 2. גני Rhoptry במחקר. Primers של גנים שונים באו לידי ביטוי במחקר זה 19.

שם חומר חברה מספר קטלוגי תיאור
2-צעד במערכת ביטוי חופשי תא אנושי מבחנה 32 תרמו פישר 88,856 הופסק. תמיד לאחסן ב -80 ° C. לא להפשיר במים חמים.
1-צעד במערכת תרגום מבחנה בשילוב תרמו פישר 88,860 תמיד לאחסן ב -80 ° C. אל thaw במים חמים.

מערכות טבלה 3. הלה תא מבוסס חופשיות ביטוי. ערכות המשמשות לביטוי של חלבונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הצעדים החשובים לביטוי מוצלח של חלבונים באמצעות שני צעד במערכת המבחנה תא אנושי חופשית ביטוי וטיהור הם: 1) הגברה ושיבוט של גנים לתוך וקטור פלסמיד pT7CFE-CHis מוצלחות; 2) לתעתוק RNA ליום 30 בC o; 3) תרגום של חלבון על 30 מעלות צלזיוס בנוכחות מעכב RNAse; 4) פיתוח פרוטוקול טיהור הזיקה מבוססת באמצעות חרוזים שרף מצופים ניקל ו -5) תוצאות ניתוח על כתם מערבי באמצעות נוגדנים חד שבטיים polyclonal ו. הצעדים החשובים לביטוי מוצלח של חלבונים באמצעות מערכת תרגום חלבון בשילוב IVT צעד אחד הם: 1) הגברה ושיבוט של גנים לתוך וקטור פלסמיד pT7CFE-CHis מוצלחות; 2) תמלול ותרגום של חלבונים על 30 מעלות צלזיוס; 3) פיתוח פרוטוקול טיהור הזיקה מבוססת באמצעות חרוזים שרף מצופים ניקל ו -4) תוצאות ניתוח על כתם מערבי באמצעות נוגדנים חד שבטיים polyclonal ו.

נוכחיly, מערכות ביטוי חופשיות תא משמשים לביטוי חלבונים רקומביננטיים מלריה. התכונות הקריטיות של מערכות ביטוי התא חופשי לבטא את חלבוני מלריה היא היכולת לפענח את גנים עשירים, חוסר הפסקה ארוכה translational, ביטוי מוצלח של רצפי חומצות אמינו חוזרים ונשנים, חוסר מנגנוני glycosylation והיכולת של פלסמידים לשלוט חיתוך גן. במחקר זה, אנחנו מדגימים שימוש בשני שלבים במערכת המבחנה תא אנושי חופשית ביטוי 32 ומערכות תרגום IVT בשילוב צעד אחד לביטוי של פ orthologs גן falciparum של פ גני rhoptry merozoite yoelii כפי שמוצג בטבלה 1. פרוטוקול טיהור פותח ומותאם במיוחד לטיהור-כרכי מיקרו של חלבונים רקומביננטי המתקבלים מ1-צעד וצעד 2 במערכות ביטוי מבחנה תא אנושי חופשיות. 4 פ גני falciparum, PF3D7_0114100 חלבון הידרופובי הטרנסממברני, חזור על ARM היפותטי חזהחלבון PF3D7_1361800 וחלבון הידרופילי PF3D7_0925900, באו לידי ביטוי באמצעות צעד 2 ו1-צעד במערכת ביטוי חופשי תא אנושי מבחנה. תשואות חלבון מטוהרים נקבעו. חלבון PfMC-2TM נכלל במחקרים אלה כי זה חלבון קרום נפרד עם שני תחומים הטרנסממברני והיינו מעוניינים בקביעה אם במבחנה מערכת הביטוי בצורה נכונה יכולה לבטא את החלבון הטרנסממברני ולאפשר להקל על טיהור.

ההבדל העיקרי הן במערכות ביטוי צעד אחד ושני צעד הוא שמערכת הביטוי שני הצעד היא מערכת תלויה mRNA, שבו mRNA יציב הוא עיבד והוסיף לתגובת התרגום. לעומת זאת, הצעד אחד בתעתיק חוץ גופית בשילוב / מערכת תרגום כרוכה שעתוק רציף ואספקה ​​של mRNA ואחרי שיתוף התרגום של חלבון במהלך התגובה. שני שעתוק IVT / ה התרגום מצמידים 1-הצעדמערכת Xpression ו2-צעד במערכת ביטוי התא חופשי אנושית מבחנה נבדקו לביטוי של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים. שני המערכות היו מוצלחות בביטוי חלבונים רקומביננטי משקל מולקולרי נמוכים. במערכת הביטוי 1-הצעד, תגובתיות צולבת נוגדן עם חלבונים בתערובת תגובת התרגום נצפתה. החלבונים הספציפיים לחצות מגיבים עם הנוגדנים אינם ידועים וצריכים חקירה נוספת. הביטוי של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים לא הצליח בשתי 1-הצעד ומערכות 2-צעד. פרוטוקול טיהור פותח עבור microvolumes טיהור של חלבונים רקומביננטי של נכסי מסיסות שונים הביע בשתי 1-צעד וצעד 2 במערכות ביטוי מבחנה תא אנושי חופשיות. חלבונים מטוהרים היו בהצלחה והתשואה המתקבלת הייתה 3.5 מיקרוגרם לכל 25 μl כאשר הביע באמצעות 2-צעד במערכת תרגום חלבון במבחנה ו1.5 מיקרוגרם לכל 25 μl כאשר מתורגם עם 1-הצעד שמערכת ביטוי חלבון VT. ביטוי של חלבוני משקל מולקולריים נמוכים השונים מ -18 kDa 37 kDa הוא שחזור וישר קדימה. עם זאת, ביטוי משקל מולקולרי גבוה גורם לtruncations חלבון. בשל microvolumes שהתקבל ל- DNA המשובט, הגברה PCR שימשה כדי לאמת את המוצרים משובטים. מכשולים פוטנציאליים לביטוי חלבוני משקל מולקולריים גבוהים באמצעות מערכות ביטוי חופשיות תא יכול להיות זירחון המתמיד של מקטע אלפא eIF2 בשל ריכוז גבוה של ATP בתגובה. זה פוגע בייזום התרגום במערכת אשר באופן פוטנציאלי משפיעה על התארכות של סינתזת החלבון במהלך הסינתזה של חלבונים גדולים במערכות ביטוי התא חופשי 10.

הפרוטוקול המתואר כאן אינו מושפע על ידי תנאי אופטימיזציה לביטוי של חלבונים. לא קודונים הגן ולא פלסמיד היו מותאמים לביטוי של חלבונים, וrefolding חלבון לא נדרש. מערכת זו מבטאת עמ 'ניתן להשיג בroteins 3 שעות והטיהור של החלבון בשעה 2, המאפשר ליישומים במורד הזרם נוספים כגון עיבוד של חלבון רקומביננטי לחיסונים או רצף הפפטיד. ניתן לבטא חלבונים רקומביננטי מרובים עם מערכת התא ללא הלה, באמצעות פורמטי microarray להקרנה סרה חיסונית וזיהוי של מולקולות מועמד חיסון פוטנציאליות. יתר על כן, ניתן לזהות חלבוני פוטנציאל חיסוניים באמצעות מסכי ונבחרו חלבונים מתקבלים על ידי דרוג את הביטוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
  2. Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
  3. Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  4. Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
  5. Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
  6. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
  7. Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
  8. Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
  9. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
  10. Hinnebusch, A. Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).
  11. Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
  12. Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
  13. Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
  14. Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
  15. Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
  16. Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
  17. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
  18. Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
  19. Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
  20. Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
  21. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
  22. Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
  23. Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
  24. Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
  25. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  26. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  27. Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
  28. Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
  29. Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
  30. Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
  31. Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
  32. Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
  33. Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Tags

ביוכימיה גיליון 100 במבחנה תמלול בתרגום חופשי נייד ביטוי הלה תא חופשי חלבוני rhoptry מערכת ביטוי החופשי של תאי יונקים, טיהור זיקת ונד Pro
מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry חלבונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa… More

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter