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Biology

Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

Expression des Malaria-Proteinen in zellbasierten Systemen bleibt eine Herausforderung. Wir zeigen zwei Schritt und einen Schritt IVT (in vitro-Translation) zellfreie Expressionssysteme zur Expression von rekombinanten Malaria-rhoptry Proteine ​​aus HeLa-Zellen. Wir verwenden eine Ni-Harz Affinität Kläranlage, die rhoptry Proteine ​​zu reinigen.

Abstract

Malaria verursacht erhebliche globale Morbidität und Mortalität. Keine Routine-Impfstoff ist derzeit verfügbar. Einer der wichtigsten Gründe für die mangelnde eines Impfstoffes ist die Herausforderung der Identifizierung geeigneter Impfstoffkandidaten. Malariaproteine ​​exprimiert mit prokaryotischen und eukaryotischen Zellen basierenden Expressionssystemen schlecht glycosyliert allgemeinen unlöslich und unterliegen falsche Faltung führt zu verringerten Immunogenizität. Die Weizenkeime, Kaninchenretikulocytlysat und Escherichia coli Lysat zellfreie Expressionssysteme sind derzeit für die Expression des Malaria-Proteine ​​verwendet. Jedoch ist die Länge des Expressionszeit und unsachgemäße Glykosylierung von Proteinen immer noch eine Herausforderung. Wir zeigen die Expression von Plasmodium Proteinen in vitro unter Verwendung von HeLa-Zelle basierend freie Expressionssysteme, die als "in vitro menschliche Zelle freie Expressionssysteme". Die 2 HeLa anhand zellfreie Expressionssysteme transkribieren mRNA in 75 min und 3 ul transcribed mRNA reicht aus, um Proteine ​​in 90 min zu übersetzen. Die 1-Schritt-Expressionssystem ist eine Transkription und Translation gekoppelt Expressionssystem; die Transkription und Co-Übersetzung erfolgt in 3 Stunden. Das Verfahren kann auch für 6 Stunden, indem zusätzliche Energie erweitert werden. In der 2-Schritt-Expressionssystem wird mRNA transkribiert erste und dann in die Übersetzung Mischung für die Proteinexpression zugegeben. Wir beschreiben, wie die Malaria-Proteine ​​zu exprimieren; eine hydrophobe PF3D7_0114100 Maurers Cleft - 2 Transmembran (PFMC-2TM) Protein, ein hydrophiles PF3D7_0925900 Protein und ein Gürteltier wiederholt mit Protein PF3D7_1361800, mit der HeLa anhand zellfreien Expressionssystem. Die Proteine ​​werden in Mikrovolumina unter Verwendung 2-Schritt und 1-step-Ausdruck Strategien ausgedrückt. Ein Affinitätsreinigungsverfahren zur Reinigung von 25 ul exprimierten Proteine ​​unter Verwendung des in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystem wird ebenfalls beschrieben. Proteinausbeute durch Bradford-Assay bestimmt und die zum Ausdruckund gereinigte Proteine ​​durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden. Exprimierten rekombinanten Proteine ​​können für Impfungen, Immunoassays und Proteinsequenzierung verwendet werden.

Introduction

Malariaforschung, Expression von immunogenen Proteinen unter Verwendung von prokaryotischen oder eukaryotischen Systemen auf Zellbasis bleibt eine Herausforderung. Die AT Reichtum des Plasmodium Genom und unbekannte posttranslationale Mechanismen 14,7, auf die Schwierigkeiten bei der Beschaffung richtig gefaltet und immunogene Proteine ​​zur Antikörperproduktion und Impfstoffstudien assoziiert beitragen. Prokaryontischen Systemen wie Escherichia coli für die rekombinante Proteinexpression verwendet. Prokaryotische Systeme sind kostengünstig, effektiv, erzeugen hohe Ausbeuten an rekombinantem Protein und mehrere Klonierungsvektoren. Host E. coli-Zellen sind leicht zu transformieren und Zellen schnell wachsen. Jedoch haben prokaryotischen Systemen Einschränkungen wie der Mangel an Aminosäure-Substitution, eine posttranslationale Modifikation, Verschmutzungsgefahr heterogene Produkte und Akkumulation von rekombinanten Proteinen in Einschlusskörpern 24.

In einemStudie Mehlin et al. (2006) wurden 1000 offenen Leserahmen (ORF) ausgedrückt. Etwa 7% der exprimierten Proteine ​​waren löslich 14. Die beobachtete Unlöslichkeit ist aufgrund der vorgespannten Natur der Gene und der hohen Frequenz von Codons, die idealerweise durch die AT-reiche Plasmodium Genom 14 verwendet. Eine alternative Strategie zur Überwindung dieses Problems wurde durch die Verwendung von Plasmiden oder Wirtszellen, tRNAs, die seltenen Codons oder Codons, die Frequenzen 3 entsprechen erkennen entwickelt. Selbst nach der Durchführung dieser Optimierungen werden sehr kleine Teile von Proteinen als lösliche, aktive und immunogenen 14 ausgedrückt. Die zellfreie Expressionssysteme enthalten sämtliche zur Transkription und Translation notwendigen Komponenten wie Ribosomen, Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren (Übersetzungen Faktoren), tRNA und Aminoacyl-tRNA-Synthetasen. Beide Transkription und Translation Reaktionen werden in einem einstufigen Verfahren 11,29 gekoppelt. Die transcription Reaktion in einem Röhrchen durchgeführt werden, bevor entsprechende Menge an mRNA mit Translationsmaschinerie in einem anderen Rohr 11,29 inkubiert. Obwohl diese Verfahren in Plasmodium sp. Protein Expression erfolgreich sind, ein großer Nachteil ist die Länge der Zeit für die Proteinexpression, die etwa 22 Stunden 29 ist. Darüber hinaus ist die hohen Kosten der Versorgung für die Aufnahme in den Protokollen 29, die arbeitsintensiven Vorbereitungen des Zelllysats und Inkonsistenzen in der Komponente Zubereitungen, stellen diese Systeme unerreichbar. Das Hauptaugenmerk der Forscher für die Entwicklung einer zellfreien Expressionssystem ist abhängig von Faktoren wie schnelle genetische Veränderung, schnelle Erträge mit hohen Konzentrationen und geradlinig Lysat Vorbereitungen 1.

Eukaryontischen Systemen wie Hefe, Säugerzelllinien, Baculovirus-Expressionssystem vermittelt, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum und parasitären Expressionssysteme such wie Leishmania wurden für die rekombinante Proteinexpression 7 verwendet. Eukaryotische Systeme teilen phylogenetische Verwandtschaft und damit Eigenschaften wie Glykosylierung, Acylierung, Disulfid-Bindungsbildung, Chaperon-Wechselwirkung, Proteolyse und subzellulären Kompartimentierung teilen auch. Proteinsekretion Veranstaltungen in Eukaryoten zu verhindern Anhäufung und verringert die Toxizität für Expressionssysteme 13. Die Verwendung von Hefe-Systemen wird bevorzugt, da sie für die Proteinexpression in großem Maßstab und zur Erzielung hoher Ausbeuten 4 sind. Zwei P. falciparum Proteine ​​PFCP-29 und Pvs25 wurden unter Verwendung des Hefe-System 4 erzeugt. , Ein großer Nachteil bei der Synthese der meisten der Proteine ​​wurde jedoch unregelmäßige N und O-Glykosylierungsmuster, unsachgemäße Falten und Abschneiden von Proteinen aus ihrer nativen Form 4.

Die Verwendung von Säugetierzellen für die Synthese von rekombinanten Proteinen ist arbeitsintensiv und es ist Expensive zu stabilen rekombinanten Zelllinien 4 aufrecht zu erhalten. Daher wurden Säugerzellen für die Analyse von Protein-Signalisierung, Protein-Interaktionen und Parasit-Wirt-Wechselwirkungen beschränkt und auch für das Testen von DNA-Impfstoffen 4. Die menschliche DNA und mRNA in vitro-Proteinexpression zellfreies System ist hierin ein HeLa-Zell-abgeleitete Säugetier-basiertes System, das Proteine ​​in 3 h ausdrückt. Proteine ​​exprimiert Verwendung pT7CFE1-ChiS Expressionsvektor haben einen C-terminalen Tag erleichtert Identifizierung und Reinigung. Die HeLa basiertes System mit Translationsinitiationsfaktoren und einem Übersetzungsregler ergänzt, wodurch die Effizienz des Übersetzungssystems zu verbessern. Proteine ​​können schnell umgesetzt werden, abgeschirmt, überprüft und für den Einsatz in verschiedenen immunologischen und Strukturanwendungen 15 verarbeitet.

Eukaryotischen zellfreie Expressionssysteme wie Weizenkeime und Kaninchen-Retikulozyten sind zur Zeit für die Expression von var verwendetious eukaryotischen Proteinen einschließlich Plasmodium Proteine ​​11,29. Zusätzlich E. coli basiert zellfreie Systeme sind auch für eukaryotische Proteinexpression. 11 verwendeten Tabelle 1 fasst verschiedene zellfreie Expressionssysteme durch Vergleichen von Merkmalen der Systeme sowie die Leichtigkeit der Verwendung der Systeme für die Proteinexpression. Der menschliche zellfreien System im Vergleich zu den anderen hat die Fähigkeit, Pfosten und co-translationale Modifikationen durchzuführen und ist weniger teuer. Codon-Optimierung ist möglich, und alle Reaktionen in 3 Stunden durchgeführt werden. Die HeLa-System ist eine ideale Übersetzungssystem für die Proteinsynthese in der Laborumgebung.

Ein Hauptvorteil der menschlichen Zelle freie Expressionssysteme gegenüber anderen zellfreien Systemen ist die Verfügbarkeit von mehreren verschiedenen Zelllinien aus verschiedenen Organen und Geweben abgeleitet ist. Mehrere Sorten von zellfreien Systemen können in Abhängigkeit von der Zelllinie ausgebildet sein. Der Extrakts aus Säugerzellen haben einen höheren Wirkungsgrad, große Proteine ​​zu synthetisieren als andere zellfreie Expressionssysteme. Diese zellfreie Expressionssysteme können auch in diagnostischen und Proteincharakterisierung Anwendungen wie Mikro-Arrays 30 verwendet werden. Die beliebten HeLa-Zelllinien werden am häufigsten verwendet, um die Durchführung der Expression von Proteinen, 33. Das endoplasmatische Retikulum in den HeLa-Zelllinien unterentwickelt, was zu einer Abwesenheit von posttranslationalen Glykosylierung Modifikation Aktivität 33. Allerdings ist dieses System glaubten für Plasmodium Proteinsynthese als vorteilhaft, als Plasmodium fehlt auch Glykosylierung Übersetzungs- Änderung 29. Der HeLa-Zell-freien Transkriptions-Translations-Protokoll ist einfach auszuführen, preisgünstig und Proteine ​​können in 90 min ausgedrückt werden, bereit für die Reinigung und Downstream Applikationen.

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Protocol

1. Herstellung von Parasite Zellkulturen, Sammlung von Parasite Pellets

  1. Vorbereitung RPMI-1640-HEPES Medien durch Zugabe von 10 g RPMI-1640-Pulver, 66 mg Gentamicinsulfat, 2 g Natriumbicarbonat, 5,9 g HEPES-Puffer, 50 mg Hypoxanthin und 3,8 g Dextrose in 1 l sterilem dH 2 O. Mischen Sie mit Hilfe der Tabelle Magnetrührer, bis das Pulver löst sich in 1 L destilliertem Wasser. Zuführen Mikrofiltration von Medien unter Verwendung von 0,22 um Filter. Lagern Sie das Material in sterile Flaschen.
  2. Waschen Sie nicht infiziert (frisch) Typ A + Erythrozyten mit RPMI. Bereiten Sie 5% Hämatokrit von Erythrozyten (0,5 ml frisch gewaschenen Erythrozyten in 9,5 ml 10% RPMI + Humanserum).
  3. Machen Sie 15% Humanserum + RPMI (15 ml Humanserum und 85 ml RPMI), den Anbau von Parasiten zu initiieren. Machen 10% Humanserum und RPMI (10 ml Humanserum und 90 ml RPMI) nach Kultivierung von Parasiten in Erythrozyten fortzusetzen.
  4. Kultur P. falciparum (3D7 und FCR-3 Stämme) in TypA + menschlichen Erythrozyten bei 5% Hämatokrit und 20% Parasitämie in Petrischale oder einer 75 cm 3 Kulturflasche. Aufrechtzuerhalten Kultur in vitro nach der Methode von Trager und Jensen Kerzenfläschchen 26. Alternativ halten Kulturen sind im Inkubator bei 37 ° C aufrechterhalten 9,5% CO 2 und 3,4% N & sub2; -Gas. Kultur P. falciparum in RPMI 1640-Medium HEPES mit 10% Humanserum.
  5. Synchronisieren P. falciparum Kultur durch Zugabe von 65% Percoll (65 ml Percoll + 35 ml RPMI-1640 ohne Humanserum) zur Kulturkonzentrat 27.
  6. Zentrifugieren Sie die Kultur-Konzentrat mit Percoll bei 2500 xg für 5 min, die in 3 Schichten führt. Vorsichtig mit einer Transferpipette isolieren Schizonten von der mittleren Schichtübertragung in ein separates Röhrchen unter aseptischen Bedingungen 27.
  7. Die isolierten Kulturen mit 10% Humanserum + RPMI-1640 zweimal zu waschen, um überschüssige Percoll durch Zentrifugation bei 7500 × g für 5 Minuten entfernt werden. DiSCARD der Überstand jedes Mal unter aseptischen Bedingungen 27.
  8. Weiter Kultivieren des synchronisierten P. falciparum-Schizonten in 10% Humanserum + RPMI-1640 27.
  9. Sammeln Schizonten durch Behandeln Plasmodium infizierten Erythrozyten mit 10 mM Tris pH 8,8 und Zentrifugieren bei 15000 × g für 15 min 23. Speicher Parasiten Pellets bei -70 ° C nach Zugabe von 5 ul Protease-Inhibitor (Aprotinin) auf das Granulat. Verwenden Parasiten Pellets für Proteinextraktion, genomische DNA Isolierung und RNA-Isolierung.

2. Vorbereitung Plasmid Vektor

  1. Isolieren genomischer DNA aus P. falciparum Schizont Pellets aus Kulturen von etwa 20% Parasitämie hergestellt.
  2. Mit 600 & mgr; l 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS und 1 mg / ml Proteinase K, um Pellets in ein Mikrozentrifugenröhrchen, homogenisieren Pellet unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel. Alternate Befüllen der Spritzemit der Granulatmischung und Entleeren in einem Mikrozentrifugenröhrchen 20 mal. Das Röhrchen haltige Homogenisat O / N in einem 50 ° C Wasserbad.
  3. Führen Phenol - Chloroform (P + C) Extraktion durch Zugabe von 600 & mgr; l von P + C (300 ul Phenol und 300 ul Chloroform) homogenisierte Pellet. Cap Röhrchen fest und die Mischung kräftig schütteln durch Umkehren Rohr End-to-End. Zentrifugenröhrchen bei 14.000 × g für 2 min und sammeln obere wässrige Lösung mit einer Mikropipette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  4. Mit 600 & mgr; l Chloroform zu der wäßrigen Schicht in den neuen Rohrs aus Schritt 2.1.2. Das Röhrchen vortexen für 10 sec und Zentrifuge bei 14.000 × g für 2 min. Messen die obere wässrige Schicht wurde mit einer Mikropipette und überträgt es zu einem neuen Reaktionsgefäß.
  5. In 0,1 Vol von 5 M Natriumacetat pH 5,5 und 1 Vol Isopropanol (wenn wässrige Schicht ist 300 ul fügen 30 ul 5 M Natriumacetat pH 5,5 + 330 ul Isopropanol) zu wässrigen Laiener von Schritt 2.1.3. Das Röhrchen bei RT für 15 min.
  6. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 × g für 10 min, um DNA-Pellet auszufällen. Überstand verwerfen und Pellet Waschen mit 100 ul 70% Ethanol (70 ul Ethanol und 30 ul dH & sub2; O), um überschüssiges Salz aus der DNA zu entfernen. Speicher DNA in 50 ul dH & sub2; O bei -20 ° C.
  7. Gestalten Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer unter Verwendung von Software oder manuell zur Amplifikation von P. falciparum Genen PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 und PF3D7_0114100 zuvor in Proteomstudien 16,18 mit geeigneten Restriktionsstellen, um die Klonierung der Gensequenzen in die multiplen Klonierungsstellen von Expressionsplasmid pT7CFE1-ChiS Bedingungen zulassen, wie in Tabelle 2 gezeigt.
  8. Machen Sie eine 50 & mgr; l Reaktionsmischung durch Zugabe; 5 ul der isolierten P. falciparum genomische DNA, 5 ul 10x-Puffer, 5 ul MgCl 2, 1,5 & mgr; l Vorwärts-Primer, 1,5 ulRückwärts-Primer, 0,5 & mgr; l T7-DNA-Polymerase und 31,5 & mgr; l dH 2 O und führen Polymerasekettenreaktion (PCR) bei 94 ° C für 8 min zur Denaturierung, 50 ° C für 1 min 30 sec für die Erweiterung und 72 ° C für 9 min zum Tempern und Renaturierung zum Verstärken in Tabelle 1 gezeigten Genen.
  9. Getrennte PCR-Produkte auf 1% Agarose-Gel (1 g Agarose und 100 ml Tris-Acetat-EDTA (TAE) -Puffer) 32.
  10. Schneiden Sie die PCR-amplifizierte DNA-Banden aus dem Agarose-Gel, legen Sie die Gelscheiben DNA enthält, in einem DNA-Gel Extraction Spin-Säule und bei -20 ° C für 5 min. 100 l Isopropanol zu den gefrorenen Gelscheiben und Zentrifuge bei 14.000 xg für 5 min.
  11. Messung der wässrigen Durchströmung in das Sammelrohr aus Schritt 2.5 filtriert Verwendung einer Mikropipette und Transfer in ein neues Gefäß. Mit 0,1 Vol von 5 M Natriumacetat und Zentrifuge bei 14.000 × g für 5 min. Überstand verwerfen und fügen Sie 10 ul dH 2 O zu the DNA-Pellet.
  12. Verdauen die pT7CFE1-ChiS Expressionsvektor und gereinigte DNA-Fragmente (2,6) in zwei getrennten Röhrchen durch Zugabe von 3 ul von Plasmid und 5 ul PCR-Genprodukte in jedes Röhrchen. In jedes Röhrchen wurden 1 ul von spezifischen Restriktionsenzymen, 2 ul Reaktionspuffer und 14 ul dH 2 O.
  13. Werden 3 ul verdauten Plasmid, 5 ul verdauten DNA-Fragmente, 2 ul 10fach Ligasepuffer, 1 ul Ligase und 9 & mgr; l dH 2 O in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubation bei 12 ° CO / N.
  14. Mit 0,1 vol 3 M Natriumacetat bei pH 5,5 und 2 Volumen Ethanol (wenn die Ligationsröhrchen Volumen beträgt 20 & mgr; l add 2 ul 3 M Natriumacetat + 44 ul Ethanol), um die Röhre aus dem Schritt 2.14. Gut mischen und Inkubation bei -20 ° C für 15 min.
  15. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 × g für 15 min. Den Überstand mit einem Mikro-Pipette vorsichtig entfernen, ohne das Pellet zu stören.
  16. 100 ul 70% Ethanol to des Pellets aus Schritt 2.10. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 xg für 5 min. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Zugabe von 10 & mgr; l Nuklease-freies Wasser auf die DNA-Pellet.

3. Protein Expression mittels in vitro Menschliche Zelle Kostenlose Expression System

  1. Es werden 20 & mgr; l-Transkriptionsmischung durch Messung 2 ul des rekombinanten pT7CFE1-ChiS Plasmid-DNA, 4 ul 5x Transkriptionspuffer, 4 ul NTP-Mix, 2 & mgr; l T7-RNA-Polymerase und 8 & mgr; l Nuklease-freies Wasser für 2-Schritt humanen in vitro Proteinexpression mit Hilfe von DNA-Templates. Mischungskomponenten in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubation für 75 min bei 30 ° C in einem Wasserbad.
  2. Take 2 ul der Transkriptionsansatz und auf 23 & mgr; l Translationsgemisch, das 12,5 & mgr; l von HeLa-Zelllysat, 2,5 ul akzessorischen Proteinen, 1 & mgr; l Salzlösung A, 0,5 & mgr; l der Aminosäuren Met, 0,5 ul von Aminosäuren hinzuzufügen Leu, 181; l RNase-Inhibitor, 1,25 ul des Energiemix und 3,75 ul Nuklease-freies Wasser.
  3. Inkubieren Übersetzung Mischung aus Schritt 3.2 bei 30 ° C für 90 min. Speicher Translationsprodukte bei -20 ° C.
  4. Vorbereitung 25 ul der Transkription und Translationsgemisch durch Zugabe von 3 & mgr; l der rekombinanten pT7CFE1-ChiS Plasmid-DNA, 2 & mgr; l Nuklease-freies Wasser, 5 ul der Reaktionsmischung wurden 12,5 ul HeLa Lysat und 2,5 ul Helferproteine ​​für 1-Schritt menschliche Coupled IVT Protein Expression der DNA-Vorlagen.
  5. Inkubieren der Reaktionsmischung aus Schritt 3.4 für 90 min bis 6 h bei 30 ° C. Bewahren Sie die Übersetzung Produkte bei -20 ° C.

4. Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins

  1. Hinzuzufügen 75 ul 1x Reinigungspuffer auf 25 & mgr; l Translationsprodukt zu 100 ul Reinigungsmischung herzustellen.
  2. 100 l Nickel Chelatharz zu 100 ul Reinigungs mixture. Wasch Ni-Harz zweimal durch Zugabe von 300 & mgr; l dH 2 O und 300 & mgr; l Bindungspuffer. Re-suspend Harz und Zentrifuge bei 14.000 · g für 1 min, um überschüssiges Ethanol zu entfernen.
  3. 100 l Reinigungsmischung aus Schritt 4,2 bis 100 & mgr; l von Nickel Chelatharz und Inkubieren des Gemisches für 60 min bei RT.
  4. Zentrifugieren der Mischung bei 14.000 · g für 1 min und sammeln Stand in ein frisches Röhrchen als "durchströmen" gekennzeichnet.
  5. Wasch Harz mit 100 ul 1x-Waschpuffer (20 mM Imidazol, 250 mM NaH 2 PO 4 bei pH 8, 2,5 M NaCl und dH 2 O). Zentrifuge bei 14.000 · g für 1 min und sammeln Stand in frisches Röhrchen "wash" gekennzeichnet. Wiederholen Sie Schritt 4.5 zweimal.
  6. 100 ul 1x Elutionspuffer (100 mM Imidazol, 250 mM Na 2 PO 4, pH 8,0, 2,5 M NaCl und dH 2 O), um das Harz und die Proben für 15 min. Zentrifugieren bei 14.000 × g für 1 min. Haben die Elutionsschritt zweimal. JederZeit zu sammeln Überstand in frische Reaktionsgefäße und Label als "Eluat".
  7. Nach der Elution waschen Harz zweimal, wie in Schritt 4.5 beschrieben. Shop durch, wäscht und Elution Proben fließen bei -20 ° C oder niedriger. Harz muß bei 4 ° C gelagert werden. Verwenden 30 ul jeder Probe für die SDS-PAGE und Immunoblotting-Analyse.

5. Coomassie (Bradford) Protein Assay 34

  1. Sind Standardrinderserumalbumin (BSA) Lösung mit der Konzentration 20 ug / ml (Mischungs 10 ul BSA (2 mg / ml) und 90 ul dH & sub2; O), 40 ug / ml (Mischungs 20 ul BSA (2 mg / ml) und 80 ul dH & sub2; O), 60 ug / ml (Mischungs 30 ul BSA (2 mg / ml) und 70 ul dH & sub2; O), 80 ug / ml (Mischungs 40 ul BSA (2 mg / ml) und 60 ul dH & sub2; O), 100 ug / ml (Mischungs 50 ul BSA (2 mg / ml) und 50 ul dH & sub2; O), 160 ug / ml (Mischungs 80 ul BSA (2 mg / ml) und 20 ul dH2 O) und 200 ug / ml (100 ul BSA (2 mg / ml).
  2. Maßnahme 5 ul der Strömung durch, wäscht und Eluat-Proben von Schritt 4.7. Hinzuzufügen 95 ul dH 2 O.
  3. 5 ml Coomassie-Blau-Reagens zu den Mischungen aus den Schritten 5.1 und 5.2. Decken Sie die Röhrchen mit Parafilm und Vortex für 10 Sekunden, dann für 20 min bei RT inkubieren.
  4. Verwendung eines Spektrophotometers, Die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 650 nm für die Proteinröhrchen aus Schritt 5.3. Plot Konzentration gegen OD Lesen, um die Proteinkonzentrationen 34 zu bestimmen.

6. Western Blotting

  1. In 5 ul Schizont Extrakte aus P. falciparum, 2 ul von Escherichia coli exprimierte rekombinante Proteine ​​rhOP-3 31, 5 & mgr; l der rekombinanten Proteine ​​exprimiert unter Verwendung von 2-Schritt-und 1-Schritt in vitro menschliche Expressionssystemen und 10 ul Protein-Produkte wurden gereinigt unter Verwendung von Affinitätsverfahren, um Rohre zu trennen. Hinzuzufügen Elektrophorese-Probenpuffer, enthaltend Mercaptoethanol in jedes Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 20 ul zu solubilisierten Proteins Proben bilden. Sieden Rohre für 2 min.
  2. Laden solubilisierten Proteins Proben auf 10% SDS-PAGE-Gelen, um die Proteine ​​zu trennen.
  3. Übertragen getrennten Proteine ​​von SDS-PAGE-Gelen auf Nitrozellulosepapier (NCP) durch Elektrophorese bei 35 mA pro Gel in einem halbtrockenen Westernblot Kammer für 2 Stunden.
  4. Block NKS folgende Übertragungs mit 2% Magermilch.
  5. Inkubation blockiert NKS mit den folgenden polyklonalen Antikörpern 1: 100 verdünnt in 2% Milch Western-Blot durchzuführen; Kaninchen-Antikörper # 676 21 spezifisch für P. falciparum Merozoiten Rhoptrien, Maus-Antikörper 20 spezifisch für P. yoelii und P. berghei Merozoiten Rhoptrien Antiseren # 685 spezifisch für das P. falciparum parasitophoren Vakuole Protein, SERA (Serin-reiche Antigen) 22 und Antikörper, die für die Maurer217; s Spalte Protein PFMC-2TM 28.
  6. Inkubieren NKS auch in 1: 100 verdünnt normale Maus und Kaninchen-Serum und verbrachten Kulturüberstand (SCS) von SP2-Myelomzellen als Negativkontrollen.
  7. Inkubieren NKS mit Antikörpern und Kontrollen bei 4 ºC O / N.
  8. Wash NKS 4x mit Blot-Puffer und Inkubation NKS mit artspezifischen Sekundärantikörper mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert 1: 1000 verdünnt in 2% Milch.
  9. Wash NKS 4x mit Blot-Puffer. Inkubiere gewaschen NCPs mit der Farbentwicklungslösung A + B (Lösung A: in 50 ml 1x Blot-Puffer und 30 ul H & sub2; O & sub2; Lösung B: 10 ml Methanol und 30 mg 3-Chlor-naphtol) 30 min in Dunkelheit. Western-Blot-Analyse Ergebnisse kolorimetrisch.

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Representative Results

Validierung der exprimierten rekombinanten Proteine ​​durch Reaktivität mit spezifischen Antikörpern ist ein wichtiger erster Schritt bei der Bestätigung der korrekten Faltung der exprimierten Proteine. Rekombinanten Malaria-Proteine ​​wurden mit dem einen Schritt und zwei Schritt in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystemen exprimiert. Die rekombinanten Proteine ​​werden gereinigt Ni-Chelat-Affinitäts-Verfahren. Dann verwendeten wir Antiseren gegen ganze Merozoiten Rhoptrien in Western-Blotting von SDS-PAGE getrennt rekombinanten Proteinen.

1 zeigt PCR amplifiziert Genfragmente PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 und PF3D7_1436300 in einem 1% Agarosegel. DNA-Banden wurden ausgeschnitten und die DNA durch Einfrieren in der DNA-Extraktion Spin-Säule gereinigt.

Malaria-Gene erfolgreich amplifiziert aus genomischer DNA (in Tabelle 2 gezeigt) wurden in den pT7CFE-ChiS Expressionsvektor kloniert. Re-Amplifikation der Gene aus dem recombinant Plasmide zeigte die Anwesenheit der klonierten Genfragmente in dem Vektor. Das Flussdiagramm von Expressionssystemen für die Proteintranslation verwendet wird in Abbildung 2 dargestellt. 2A und 2B zeigt eine schrittweise Prozedur der 2-Schritt in vitro menschliche Zelle freie Expressionssystem und dem 1-Schritt-IVT-Übersetzungssystem gekoppelt. Erfolgreiche Expression von Proteinen unter Verwendung von Plasmodium in vitro menschliche Zelle freie Expressionssysteme wurde von rhoptry spezifischen Kaninchen-Antiseren bestätigt. Wie in 3A dargestellt ist, wurden die rekombinanten Proteine ​​durch rhoptry spezifischen Kaninchen-Antiserum # 676 erfasst. Wie zuvor gezeigt, exprimierten rekombinanten Proteine ​​nicht durch Antiseren gegen parasitophoren Vakuole Proteine ​​aus P. anerkannt falciparum und P. yoelii die Spezifität Kaninchenantiseren 676 gegen die exprimierten Proteine ​​32. Normales Kaninchenserum (NRS) nicht mit rekombinanten Proteinen reagierenübersetzt mit 2-Stufen-in-vitro-Zell kostenlos Expressionssystem von Mensch und 1-Schritt-IVT gekoppelt Übersetzungssystem (3B). Die erfolgreiche Expression von Plasmodium rekombinanten Proteine ​​wurde durch verschiedene Techniken wie In-Gel-Histidin-Färbung und Nickel-HRP Färbung 32 bestätigt. Exprimierten Proteine ​​wurden durch Affinitätsreinigungssystem gereinigt. Die Reinigung wird in Batch-Verfahren durchgeführt (keine Spalten verwendet). Die Technik wird durch Veränderung der Konzentration von Imidazol von 60 mm bis 100 mm optimiert. Die optimale Konzentration für die Elution ist 250 mM. 4 zeigt erfolgreiche Reinigung des translatierten Proteine ​​aus 25 ul translatierten Proteinprodukte. 4A zeigt erfolgreiche Reinigung von Maurer Spalt Transmembranprotein 18. 4B zeigt erfolgreiche Reinigung von PF3D7_0925900, P. falciparum Ortholog von Plasmodium yoelii Gen PY17X_0830000 einhypothetisches Protein 32. 4C zeigt erfolgreiche Reinigung des Gürteltier-Wiederholungen enthält Protein PY17X_1139200, ein hypothetisches Protein unter Verwendung von Ni-Harzkügelchen und 100 mM Imidazol in 1x Elutionspuffer. Die Ausbeute an Protein nach Reinigung beträgt 3,5 ug / 25 ul.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Amplifikation von P. falciparum und P. yoelii Gene. 1% Agarosegel, das Ethidiumbromid PCR-Produkte von Genfragmenten der PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 und PFA0680cw aus P. amplifizierte falciparum genomischer DNA.

Figur 2
Abbildung 2 Flussdiagramm von HeLa-bas ed zellfreien Expressionssystem. Schematische Darstellung der beiden 2-Stufen und 1-Schritt in vitro menschliche Zelle freie Expressionssysteme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Immunoblotting Bestätigung der Proteinexpression. Western Blot-Analyse des exprimierten rekombinanten Proteinen unter Verwendung von ganzen rhoptry spezifischen Kaninchen-Antiserum # 676 und normales Kaninchenserum. (A) Reaktivität von Antiseren 676 mit exprimierten rekombinanten Proteine. (B) normalem Kaninchenserum nicht mit der exprimierten rekombinanten Proteine ​​reagieren. Parasitophoren Vakuole Protein nicht mit rekombinanten Proteinen 32 reagieren.hres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Figur 4. Reinigung von Proteinen aus Mikrovolumina Translationsprodukt. Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteinen unter Verwendung von Nickel-Chelatharzes Affinitätsverfahren. Exprimierten Proteine ​​(Übersetzung) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000 und (C) PY17X_1139200 Proteine ​​wurden mit Nickel inkubiert - Chelatharze mit Nickel- chelatbildenden Harz in Abwesenheit von Imidazol in Bindungspuffer und Reinigungspuffer gereinigt. Nach der Inkubation wurden die Perlen zentrifugiert, ungebundenen Proteine ​​wurden getrennt, und die Perlen zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Gebundenen rekombinanten Proteine ​​wurden eluiert, zweimal durch Waschen der Kügelchen folgt. Übersetzt Proteine, Waschanlagen, Eluaten und Perlenwurden in Elektrophorese-Probenpuffer solubilisiert. Imidazol im Wash (20 mM Imidazol) und Elution (100 mM Imidazol) Puffer verwendet. Antiseren # 676 erfolgreich erkannt exprimiert und gereinigte rekombinante Proteine. Normales Kaninchenserum nicht mit exprimierten Proteine ​​als zeigen in 3B zu reagieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<td> 200 kDa
Eigenschaften Menschenzellfreien Expressionssystem Weizenkeimzelle frei Expressionssystem Kaninchen-Retikulozyten-Expressionssystem E.coli-Lysat-Protein-Expressionssystem
Zeit Geschehen Transkription und Translation in 3 Stunden Transkription für 6 Stunden und Übersetzung für 10 - 20 h RNA zu isolieren Übersetzung erfolgt 90 min Done in 1 h
Geeigneten Vektor T7 Vektor kann SP6-Vektor T7 verwendet werden T7 verwendet werden
Geeigneten Maßstab Geeignet für die Laborsynthese Wird für die Proteinsynthese im großen Maßstab Geeignet für Labor und Immunisierungsstudien Geeignet für Labor und Immunisierungsstudien
Extrakt HeLa zellfreien Extrakten Embryo Weizenextrakten Retikulozyten-Zellextrakten E. coli Zelllysat Extrakten
Änderung Co-translationale und posttranslationale Modifikation Posttranslationale Modifikation Co-translationale Modifikation Posttranslationale Modifikation
Größe des Proteins übersetzt 8 KDa und 250 KDa 220 KDa 250 KDa
Codon-Optimierung Fest Fest Lose Fest
Disulfid-Bindungsbildung Ja Ja Nein Ja
Ausbeute Geringe Ausbeute Hohe Ausbeute Low Yield Sehr hoher Ausbeute
Kosten $ 130,00 für 10 Reaktionen $ 173,00 für 10 Reaktionen $ 136,00 für 5 Reaktionen $ 159,00 für 8 Reaktionen
Die Proteinkonzentration 3 bis 5 & mgr; g pro Reaktion 100 & mgr; g / ml 100 & mgr; g / ml 500 & mgr; g / ml
Referenzen 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

Tabelle 1. Zellfreie Expressionssysteme in Malaria-Forschung. Vergleich von Zellfreie Expressionssysteme derzeit in Malaria-Forschung eingesetzt.

Gene ID Ortholog ID Protein Primer-Sequenz für die PCR
PF3D7_1436300 Translocon Komponente CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 PFMC-2TM Maurers Spalte Protein GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 Hypothetisches Protein GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 Hypothetisches Protein GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

Tabelle 2. rhoptry Gene in der Studie. Primers verschiedener Gene in dieser Untersuchung 19 ausgedrückt.

Name des Materials Unternehmen Katalog-Nummer Beschreibung
2-Stufen-in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystem 32 Thermo Fisher 88.856 Nicht mehr. Speichern Sie immer bei -80 ° C. Sie in warmem Wasser auftauen nicht.
1-Schritt-in vitro-Translationssystem gekoppelt Thermo Fisher 88.860 Speichern Sie immer bei -80 ° C. Th nichtaw in warmem Wasser.

Tabelle 3. Hela anhand zellfreie Expressionssysteme. Kits für die Expression von Proteinen verwendet.

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Discussion

Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Expression von Proteinen unter Verwendung von zweistufigen in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystem und Reinigung sind: 1) eine erfolgreiche Amplifikation und Klonierung von Genen in pT7CFE-ChiS Plasmidvektor; 2) Transkription RNA bei 30 o C; 3) Übersetzung von Protein bei 30 ° C in Gegenwart von RNAse-Inhibitor; 4) Entwicklung der Affinität basiert Reinigungsprotokoll mit Harzkügelchen mit Ni und 5 beschichtet) Analyse der Ergebnisse auf Western-Blot unter Verwendung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern. Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Expression von Proteinen unter Verwendung von einem Schritt IVT gekoppelten Protein-Translation-Systems sind: 1) eine erfolgreiche Amplifikation und Klonierung von Genen in pT7CFE-ChiS Plasmidvektor; 2) Transkription und Translation der Proteine ​​bei 30 ° C; 3) Entwicklung der Affinität basiert Reinigungsprotokoll mit Harzkügelchen mit Ni und 4 beschichtet) Analyse der Ergebnisse auf Western-Blot unter Verwendung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern.

Stromly, zellfreie Expressionssysteme sind für die Expression von rekombinanten Malaria-Proteine ​​verwendet. Die kritischen Merkmale der zellfreie Expressionssysteme, um Malaria-Proteine ​​zu exprimieren ist die Fähigkeit, AT-reiche Gene entschlüsseln, ein Mangel an lang translationale Pause, erfolgreiche Expression von wiederholten Aminosäuresequenzen, mangelnde Glykosylierung Mechanismen und die Fähigkeit der Plasmide, um Gen-Trunkierung steuern. In dieser Studie wurde die Verwendung eines Zwei-Schritt in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystem 32 und ein Ein-Schritt-IVT gekoppelt Übersetzungssysteme für die Expression von P. zeigen wir, falciparum Gen Orthologe von P. yoelii Merozoiten rhoptry Gene wie in Tabelle 1 gezeigt. Ein Reinigungsprotokoll wurde entwickelt und zum Reinigen von Mikrovolumina von rekombinanten Proteinen aus 1-Punkt- oder 2-Schritt in vitro menschliche Zelle freie Expressionssysteme erhalten optimiert. 4 P. falciparum Genen PF3D7_0114100 eine Trans hydrophobes Protein, ein vorhergesagtes hypothetischen ARM WiederholungsProtein PF3D7_1361800 und ein hydrophiles Protein PF3D7_0925900, wurden unter Verwendung einer 2-Schritt-und 1-Schritt in vitro menschliche Zelle freie Expressionssystem exprimiert. Gereinigtes Proteinausbeuten wurden bestimmt. Das Protein pFMC-2TM wurde in diesen Studien eingeschlossen, da es ein integrales Membranprotein mit zwei Transmembrandomänen, und wir waren daran interessiert festzustellen, ob die in vitro-Expressionssystem kann vollständig das Transmembranprotein exprimieren und ermöglichen eine einfache Reinigung.

Der Schlüsselunterschied in den beiden einen Schritt und Zwei-Schritt-Expressionssystemen ist, dass die Zwei-Schritt-Expressionssystem ist ein mRNA-abhängiges System, in dem eine stabile mRNA transkribiert und zu der Translationsreaktion. Dagegen ist die einen Schritt in vitro gekoppelten Transkriptions / Übersetzungssystem beinhaltet eine kontinuierliche Zufuhr von Transkription und mRNA, gefolgt von dem Co-Translation von Protein während der Reaktion. Sowohl 1-Schritt-IVT-Transkription / Translation gekoppelt expression System und 2-Schritt in vitro menschliche Zelle frei Expressionssystems wurden für die Expression der hochmolekularen Proteinen getestet. Beide Systeme waren in exprimieren niedermolekulare rekombinante Proteine ​​erfolgreich. In der 1-Schritt-Expressionssystem wurde Antikörper Kreuzreaktivität mit Proteinen in der Übersetzungsreaktionsgemisch beobachtet. Die spezifischen Proteine ​​überqueren Reaktion mit den Antikörpern sind unbekannt und müssen weitere Untersuchungen. Expression der hochmolekularen Proteine ​​erfolgreich war sowohl mit dem 1-Schritt-und 2-Schritt-Systeme. Eine Reinigungsprotokoll wurde zur Reinigung von Mikrovolumina von rekombinanten Proteinen unterschiedlicher Löslichkeitseigenschaften entwickelt ausgedrückt unter Verwendung von sowohl 1-Schritt und 2-Schritt in vitro menschliche Zelle freie Expressionssysteme. Proteine ​​wurden erfolgreich gereinigt und die erhaltene Ausbeute betrug 3,5 ug pro 25 ul bei Expression unter Verwendung von 2-Schritt in vitro-Proteintranslationssystem, und 1,5 & mgr; g pro 25 & mgr; l, wenn sie mit dem 1-Schritt-übersetzte IVT-Protein-Expressionssystem. Expression von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht reicht von 18 kDa bis 37 kDa ist reproduzierbar und geradlinig. , Führt jedoch Ausdruck mit hohem Molekulargewicht in Protein Verkürzungen. Aufgrund der für die klonierte DNA erhaltenen Mikrovolumina wurde die PCR-Amplifikation verwendet werden, um klonierte Produkte zu verifizieren. Mögliche Hindernisse für die Expression von hochmolekularen Proteinen unter Verwendung von zellfreien Expressionssystemen konnte konstant Phosphorylierung eIF2 alpha-Untereinheit ist aufgrund der hohen Konzentration von ATP in der Reaktion. Dies beeinträchtigt die Translationsinitiation in dem System, die während der Synthese von großen Proteinen in zellfreien Expressionssystemen 10 möglicherweise beeinflußt die Verlängerung der Proteinsynthese.

Das hier beschriebene Protokoll wird von Optimierungsbedingungen für die Expression von Proteinen unbeeinflusst. Weder die Gen-Codons noch der Plasmid enthielten, wurden zur Expression von Proteinen optimiert und Proteinrückfaltung nicht erforderlich war. Dieses System drückt proteins in 3 h und die Reinigung des Proteins kann in 2 h erhalten werden, die eine weitere nachfolgende Anwendungen wie Verarbeitung des rekombinanten Proteins für die Immunisierung oder Peptidsequenzierung. Mehrere rekombinante Proteine ​​können mit dem HeLa-Zell-freie System ausgedrückt werden, unter Verwendung von Microarray-Formate für Immunseren Screening und Identifizierung von möglichen Impfstoffkandidaten Moleküle. Darüber hinaus können potenziell immunogene Proteine ​​durch die Bildschirme identifiziert und ausgewählt werden, Proteine, die durch die Aufstockung der Ausdruck erhalten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

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Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

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