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Biology

Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

Expressão de proteínas da malária em sistemas baseados em células permanece um desafio. Nós demonstramos dois sistemas de célula livre expressão de passo e um passo IVT (em tradução vitro) para expressar proteínas recombinantes rhoptry malária a partir de células HeLa. Nós usamos um sistema de purificação baseado afinidade Ni-resina para purificar as proteínas rhoptry.

Abstract

A malária causa de morbidade e mortalidade mundial significativa. Nenhuma vacina de rotina está disponível no momento. Uma das principais razões para a falta de uma vacina é o desafio de identificar candidatos a vacinas adequadas. Proteínas malária expresso utilizando sistemas procariotas e eucariotas de expressão baseados em células são mal glicosilada, geralmente insolúveis e passam por dobragem inadequada levando a imunogenicidade reduzida. Os sistemas de expressão livres de gérmen de trigo, lisado de reticulócitos de coelho e lisado de células de Escherichia coli são actualmente utilizados para a expressão de proteínas da malária. No entanto, o período de tempo e a expressão inadequada de glicosilação de proteínas continua a ser um desafio. Nós demonstramos a expressão de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando células HeLa sistemas baseados livre expressão, denominados "in vitro de células livre sistemas de expressão humanos". Os sistemas de expressão isentos de células HeLa baseado 2 transcrever o ARNm em 75 min e 3 ul de transcribed ARNm é suficiente para traduzir proteínas em 90 min. O sistema de expressão de um-passo é uma transcrição e tradução acoplado sistema de expressão; a transcrição e tradução de co-ocorre em 3 h. O processo também pode ser estendido durante 6 horas, fornecendo energia adicional. No sistema de expressão de 2 passos, o ARNm é transcrita em primeiro lugar e, em seguida, adicionados à mistura de tradução para a expressão da proteína. Nós descrevemos como expressar proteínas de malária; um hidrofóbico Cleft de PF3D7_0114100 Maurer - 2 proteína transmembranar (CGFP-2TM), uma proteína PF3D7_0925900 hidrófilo e um tatu repetições contendo proteína PF3D7_1361800, utilizando o sistema de livre expressão de células HeLa base. As proteínas são expressas em micro volumes empregando 2-passo e um passo-estratégias de expressão. Um método de purificação por afinidade para purificar a 25 ul de proteínas expressas utilizando o sistema isento de células humanas de expressão in vitro é também descrito. Rendimento de proteína é determinada pelo ensaio de Bradford e a expressoe proteínas purificadas pode ser confirmada por análise de transferência de western. Proteínas recombinantes expressas podem ser utilizados para a vacinação, imunoensaios e sequenciação de proteínas.

Introduction

Na pesquisa da malária, a expressão de proteínas imunogénicas utilizando sistemas baseados em células procarióticas ou eucarióticas continua a ser um desafio. A riqueza AT do genoma de Plasmodium e desconhecidos os mecanismos pós translacionais 14,7, contribuir para as dificuldades associadas com a obtenção de proteínas correctamente dobradas e imunogénicos para produção de anticorpos e estudos de vacinas. Sistemas procariotas tais como Escherichia coli, têm sido utilizados para a expressão da proteína recombinante. Sistemas procariotas são de baixo custo, eficaz, produzir altos rendimentos de proteína recombinante e ter vários vectores de clonagem. Anfitrião E. coli são fáceis de transformar e células crescem rapidamente. No entanto, os sistemas procarióticos têm limitações, tais como a falta de substituição de aminoácidos, modificação pós-translacional, risco de contaminação, produtos heterogéneos e acumulação de proteínas recombinantes dentro de corpos de inclusão 24.

Em umestudo realizado por Mehlin et al. (2006), 1000 grelhas de leitura aberta (ORF) foram expressos. Aproximadamente 7% das proteínas expressas foram solúvel 14. A insolubilidade observado é devido à natureza tendenciosa dos genes e da alta freqüência de códons que são usados ​​idealmente pelo Plasmodium AT genoma rico 14. Uma estratégia alternativa para ultrapassar este problema foi desenvolvido usando plasmídeos ou células hospedeiras contendo ARNt que reconhece codões raros ou codões que correspondem aos três frequências. Mesmo depois de executar essas otimizações, muito pequenas porções de proteínas são expressas como solúvel, ativa e imunogênica 14. Os sistemas de expressão isentos de células contêm todos os componentes necessários para a transcrição e tradução, tais como os ribossomos, fatores de iniciação, factores de alongamento (traduções fatores), tRNA e aminoacil-tRNA. Ambas as reacções de transcrição e de tradução são acopladas no procedimento de um só passo 11,29. O transcriPÇÃO reacção é realizada num tubo antes quantidade adequada de mRNA é incubada com uma maquinaria de tradução em 11,29 tubo diferente. Embora estes métodos são bem sucedidos em Plasmodium sp. A expressão da proteína, uma grande desvantagem é o período de tempo para a expressão da proteína, que é de aproximadamente 22 h 29. Além disso, o alto custo dos materiais para inclusão nos protocolos 29, os preparativos de trabalho intensivo do ligado celular e inconsistências nos preparativos de componentes, tornar esses sistemas inatingível. O principal foco dos pesquisadores para o desenvolvimento de um sistema de expressão livre de células depende de fatores como a rápida modificação genética, os rendimentos rápidos com altas concentrações e preparações lisado para a frente em linha reta 1.

Os sistemas eucarióticos, tais como leveduras, linhas celulares de mamíferos, baculovírus sistema de expressão mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum e sistemas de expressão parasitárias such como Leishmania foram utilizados para a expressão da proteína recombinante 7. Os sistemas eucarióticos partes relação filogenética e, por conseguinte, também partilham características, tais como glicosilação, acilação, formação de ligação dissulfureto, interacção chaperona, proteólise e compartimentalização sub-celular. Eventos secreção de proteínas em eucariotas evitar a acumulação e toxicidade diminui para sistemas de expressão 13. A utilização de sistemas de leveduras é preferível que elas sejam adequadas para a expressão de proteínas em grande escala e para a obtenção de rendimentos elevados 4. Dois P. proteínas falciparum PfCP-29 e Pvs25 foram produzidas utilizando o sistema de levedura 4. No entanto, uma grande desvantagem na síntese da maioria das proteínas foi padrões irregulares de N e O-glicosilação, truncagem e dobragem incorrecta de proteínas a partir da sua forma nativa 4.

A utilização de células de mamíferos para a síntese de proteínas recombinantes é trabalho intensivo e é expensive para manter linhas de células recombinantes estáveis ​​4. Portanto, as células de mamíferos têm-se limitado para a análise de sinalização de proteína, as interacções proteína e interacções hospedeiro-parasita e também para testar as vacinas de ADN 4. O ADN humano e de ARNm no sistema in vitro isento de células de expressão da proteína aqui descrito é um sistema de mamífero baseados em derivados de células HeLa que expressam as proteínas em 3 h. As proteínas expressas utilizando pT7CFE1-chis vetor de expressão têm uma tag C-terminal facilitando a identificação e purificação. O sistema de base de HeLa é suplementado com factores de iniciação da tradução e um regulador de tradução, aumentando assim a eficiência do sistema de tradução. As proteínas podem ser rapidamente traduzidos, peneirados, verificado e processado para uso em várias aplicações imunológicas e estruturais 15.

Os sistemas de expressão isentos de células eucarióticas, tais como germe de trigo e de reticulócitos de coelho são actualmente utilizados para a expressão de varproteínas eucarióticas ious incluindo proteínas de Plasmodium 11,29. Além disso, a E. sistemas livres de células com base coli também são empregues para a expressão da proteína eucariótica 11. A Tabela 1 resume os diferentes sistemas de expressão de células livres, comparando as características dos sistemas, bem como a facilidade da utilização dos sistemas para a expressão da proteína. O sistema isento de células humano em comparação com os outros tem a capacidade de executar pós e co-translacional modificações e é menos dispendiosa. Codon optimization é possível e todas as reacções podem ser realizadas em 3 h. O sistema de HeLa é um sistema de tradução ideal para a síntese de proteína no ambiente de laboratório.

Uma grande vantagem dos sistemas de expressão de células humanas livre em relação a outros sistemas livres de células, é a disponibilidade de várias linhas celulares diferentes derivadas de diferentes órgãos e tecidos. Existem diversas variedades de sistemas isentos de células pode ser desenhado dependendo da linha celular. O extractos derivados a partir de células de mamífero têm uma maior eficiência de sintetizar proteínas grandes do que quaisquer outros sistemas de expressão de célula livre. Estes sistemas de células sem expressão podem também ser utilizados em aplicações de diagnóstico e caracterização de proteínas, tais como micro matrizes 30. As linhas de células HeLa populares são mais amplamente utilizados para realizar a expressão de proteínas 33. O retículo endoplasmático nas linhas de células HeLa é subdesenvolvidos, levando à ausência de glicosilação pós-tradução actividade modificação 33. No entanto, este sistema é que se acredita ser vantajoso para a síntese de proteínas Plasmodium Plasmodium como também não possui modificação pós tradução 29 glicosilação. O protocolo de transcrição-tradução livre de células HeLa é de fácil execução, barata e as proteínas podem ser expressas em 90 min, pronta para a purificação e aplicações a jusante.

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Protocol

1. Preparação de culturas de células de parasitas, Coleção de Parasite Pellets

  1. Prepare meio RPMI-1640-HEPES por adição de 10 g de pó de meio RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sódio, tampão HEPES 5,9 g, 50 mg de hipoxantina e 3,8 g de dextrose em 1 L estéril dH 2 O. Misture usando a tabela agitador magnético até que todos o pó se dissolva em 1 L de água destilada. Execute micro filtração de mídia usando 0,22 nm. Armazene a mídia em frascos esterilizados.
  2. Lavar não infectados (fresco) do tipo A + eritrócitos utilizando RPMI. Prepare a 5% de hematócrito dos eritrócitos (0,5 ml de eritrócitos frescos lavados em 9,5 ml de 10% RPMI + soro humano).
  3. Adicione 15% de soro humano + RPMI (15 ml de soro humano e 85 ml de RPMI) para iniciar a cultura de parasitas. Adicione 10% de soro humano e meio RPMI (10 ml de soro humano e 90 ml de RPMI) para continuar a cultura de parasitas nas células vermelhas do sangue.
  4. Cultura P. falciparum (3D7 e FCR-3 estirpes) em TipoA + humanos eritrócitos a 5% de hematócrito e de 20% de parasitemia em placa de petri ou num frasco de cultura de 75 centímetros 3. Manter a cultura in vitro de acordo com o método de Trager e Jensen vela frasco 26. Alternativamente, manter culturas são em incubadora a 37 ° C mantendo 9,5% de CO 2 e 3,4% de N 2 gasoso. Cultura P. falciparum em meio RPMI 1640 suplementado com HEPES meios 10% de soro humano.
  5. Sincronize P. falciparum cultura pela adição de 65% de Percoll (65 ml de Percoll + 35 mL de meio RPMI-1640 sem soro humano) para concentrar a cultura 27.
  6. Centrifuga-se o concentrado de cultura com Percoll a 2500 xg durante 5 minutos o que resulta em 3 camadas. Cuidadosamente, com uma pipeta de transferência isolar esquizontes da transferência camada intermediária em um tubo separado sob condições assépticas 27.
  7. Lavam-se as culturas de isolado com 10% de soro humano + RPMI-1640 por duas vezes para remover o excesso de Percoll por centrifugação a 7500 xg durante 5 min. DiScard o sobrenadante de cada vez, sob condições assépticas 27.
  8. Continuar a cultura de P. sincronizado esquizontes falciparum em 10% de soro humano + 27 meio RPMI-1640.
  9. Recolhe esquizontes por tratamento de Plasmodium eritrócitos infectados com 10 mM de Tris pH 8,8 e centrifugação a 15000 xg durante 15 min 23. Pelotas do parasita da loja, a -70 ° C após a adição de 5 ul de inibidor de protease (aprotinina) para as peletes. Use pastilhas de parasitas para extração de proteínas, o isolamento de ADN genómico e RNA isolamento.

2. Preparar plasmídeo Vector

  1. Isolar o ADN genómico a partir de P. pelotas esquizontes falciparum preparados a partir de culturas de cerca de 20% de parasitemia.
  2. Adicionar 600 ul de 10 mM Tris-HCl de pH 7,6, 50 mM de EDTA pH 8,0, 0,1% de SDS e 1 mg / ml de proteinase K, para os microgrânulos num tubo de microcentrífuga, homogeneizar sedimento utilizando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 26. Alternativa encher a seringacom a mistura de sedimento e de esvaziamento para um tubo de microcentrífuga de 20 vezes. Incubar tubo contendo homogeneizado de O / N em um banho de água a 50 ° C.
  3. Realizar fenol - clorofórmio (P + C) Extracção por adição de 600 ul de P + C (300 ul de fenol e 300 ul de clorofórmio) para sedimento homogeneizado. Tubo de tampa bem apertada e agite a mistura vigorosamente invertendo final end-to-tubo. Tubo de centrifugação a 14000 xg durante 2 min e recolher solução aquosa superior utilizando uma micropipeta para um novo tubo de microcentrifugação. Repita esta etapa duas vezes.
  4. Adicionar 600 ul de clorofórmio à camada aquosa no tubo novo a partir do passo 2.1.2. Vortex o tubo durante 10 segundos e centrifugar a 14000 xg durante 2 min. Medir a camada aquosa superior com uma micropipeta e transferi-lo para um novo tubo de microcentrifugação.
  5. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 5 M pH 5,5 e um volume de isopropanol (se camada aquosa é adicionar 300 ul 30 ul de acetato de sódio 5 M pH 5,5 + 330 mL de isopropanol) para a postura aquosoer a partir do passo 2.1.3. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 15 min.
  6. Centrifuga-se o tubo a 14.000 xg durante 10 min para precipitar sedimento de DNA. Descartar o sobrenadante e lave o peletizado com 100 ul de etanol a 70% (70 ul de etanol e 30 uL de dH2O) para remover o excesso de sal a partir do ADN. DNA da loja em 50 ul de dH2O a -20 ° C.
  7. Conceber iniciadores directos e inversos usando software ou manualmente para a amplificação de P. genes falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 e PF3D7_0114100 previamente identificados em estudos 16,18 proteoma com locais de restrição apropriados para permitir a clonagem das sequências de genes para os múltiplos locais de clonagem do plasmídeo de expressão pT7CFE1-CHIS, como mostrado na Tabela 2.
  8. Fazer uma mistura reaccional de 50 ul por adição; 5 ul de P. isolado ADN genómico de P. falciparum, 5 ul de tampão 10x, 5 jil de MgCl2, 1,5 ul de iniciador directo, 1,5 ul deiniciador de sentido reverso, 0,5 jil de polimerase de ADN de T7 e 31,5 uL de dH2O e realizar a reacção em cadeia da polimerase (PCR) a 94 ° C durante 8 min para desnaturação, 50 ° C durante 1 min 30 s para a extensão e 72 ° C durante 9 min para o recozimento e renaturação para amplificar os genes mostrados na Tabela 1.
  9. Os produtos de PCR separados sobre gel de agarose a 1% (1 g de agarose e 100 ml de acetato de Tris EDTA (TAE) tampão) 32.
  10. Corte as bandas de DNA amplificados por PCR a partir do gel de agarose, colocar as fatias de gel que contêm o ADN numa coluna de extracção de ADN de gel de rotação e congelar a -20 ° C durante 5 min. Adicionar 100 uL de isopropanol para as fatias de gel congelado e centrifugar a 14000 xg durante 5 min.
  11. Medir o escoamento aquosa filtrada no tubo de recolha a partir do passo 2.5, utilizando uma micropipeta e transferir para um tubo novo. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 5 M e centrifugar a 14000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e adicionar 10 uL de dH2O para the sedimento de DNA.
  12. Digerir o vector de expressão pT7CFE1-Chis e os fragmentos de ADN purificado a partir de (2.6) em dois tubos separados pela adição de 3 ul de plasmídeo e 5 ul de produtos de PCR do gene para cada tubo. Adicionar a cada tubo, 1 ul de enzimas de restrição específicas, 2 ul de tampão de reacção e 14 ul de dH2O
  13. Adicionar 3 ul de plasmídeo digerido, 5 ul de fragmentos de ADN digeridos, 2 ul de tampão ligase 10X, 1 ul de ligase e 9 jil de dH2O num tubo de microcentrífuga. Incubar a 12 ° CO / N.
  14. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 3M a pH 5,5 e 2 volumes de etanol (se o volume de tubos de ligação é de 20 ul adicionar 2 mL de 3 M de acetato de sódio + 44 mL de etanol) para o tubo a partir do passo 2.14. Misturar bem e incubar à temperatura de -20 ° C durante 15 min.
  15. Centrifuga-se o tubo a 14.000 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma pipeta micro sem perturbar o sedimento.
  16. Adicionar 100 ul de etanol a 70% tO sedimento do passo de 2,10. Centrifuga-se o tubo a 14000 xg durante 5 min. Remova e descarte o sobrenadante. Adicionar 10 ul de água isenta de nuclease para o sedimento de DNA.

3. Usando Protein Expression in Vitro Célula humana Livre Expressão Sistema

  1. Preparar 20 ul de mistura de transcrição medindo 2 ul do recombinante pT7CFE1-Chis plasmídeo de DNA, 4 ul de tampão de transcrição 5x, 4 ul de mistura de NTP, 2 ul de ARN-polimerase de T7 e 8 mL de água isenta de nuclease para 2 passos humanas in vitro Protein Expression usando moldes de ADN. Misturar os componentes num tubo de microcentrífuga e incubar durante 75 min a 30 ° C num banho de água.
  2. Tome 2 ul da mistura de transcrição e adicioná-lo para 23 ul de mistura de tradução contendo 12,5 ul de lisado de células HeLa, 2,5 ul de proteínas acessórias, 1 ul de solução de sal de A, 0,5 ul de aminoácidos Met, 0,5 ul de aminoácidos Leu, 181; l de inibidor de RNAse, 1,25 mL de cabaz energético e 3,75 mL de água livre de nuclease.
  3. Incubar a mistura de tradução a partir do passo 3.2 a 30 ° C durante 90 min. Loja produtos traduzidos a -20 ° C.
  4. Preparar 25 ul de mistura de transcrição e de tradução através da adição de 3 ul de o recombinante pT7CFE1-Chis plasmídeo de ADN, 2 ul de água isenta de nuclease, 5 ul de mistura de reacção, 12,5 ul de lisado de células HeLa e 2,5 ul de proteínas acessórias para um passo- Juntamente Humano Expressão IVT proteína para moldes de ADN.
  5. Incubar a mistura de reacção a partir do passo 3.4, durante 90 min a 6 h a 30 ° C. Guarde os produtos de tradução -20 ° C.

4. Purificação de proteínas recombinantes expressas

  1. Adicionar 75 ul de tampão de purificação 1x a 25 ul de produto de tradução para perfazer 100 uL de mistura de purificação.
  2. Adiciona-se 100 ul de resina quelante de níquel de 100 ul de mixt purificaçãoure. Lavar Ni-resina duas vezes por adição de 300 uL de dH2O e 300 ul de tampão de ligação. Re-suspender resina e centrifugar a 14000 xg durante 1 min para remover o excesso de etanol.
  3. Adiciona-se 100 ul de mistura a partir do passo de purificação de 4,2-100 ul de resina quelante de níquel e incubar a mistura durante 60 min à temperatura ambiente.
  4. Centrifugar a mistura a 14000 x g durante 1 min e recolher o sobrenadante para um novo tubo marcado como "flow through".
  5. Lavar a resina com 100 ul de 1x tampão de lavagem (imidazol 20 mM, 250 mM de NaH 2 PO 4 a pH 8, 2,5 M de NaCl e dH 2 O). Centrifugar a 14.000 xg por 1 min e recolher o sobrenadante no novo tubo rotulado de "lavagem". Repita o passo 4.5 duas vezes.
  6. Adicionar 100 ul de 1x tampão de eluição (imidazole 100 mM, 250 mM de Na 2 PO 4 a pH 8,0, 2,5 M NaCl e dH2O) à resina e incubar durante 15 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. Faça o passo de eluição duas vezes. Cadatempo recolher o sobrenadante para tubos de microcentrífuga fresco e rótulo como "fluido".
  7. Após eluição, lavar a resina duas vezes tal como descrito no passo 4.5. Fluir através da loja, lavagens e amostras de eluição à temperatura de -20 ° C ou inferior. A resina deve ser armazenada a 4 ° C. Utilizar 30 ul de cada amostra para SDS-PAGE e análise de imunotransferência.

5. Coomassie (Bradford) Ensaio de Proteína 34

  1. Preparar padrão de albumina de soro bovino (BSA) as soluções com a concentração de 20 ug / ml (mistura de 10 ul de BSA (2 mg / mL) e 90 uL de dH2O), 40 ug / ml (mistura de 20 ul de BSA (2 mg / mL) e 80 uL de dH2O), 60 ug / ml (mistura de 30 ul de BSA (2 mg / mL) e 70 uL de dH2O), 80 ug / ml (mistura de 40 ul de BSA (2 mg / mL) e 60 uL de dH2O), 100 ug / ml (mistura de 50 ul de BSA (2 mg / mL) e 50 uL de dH2O), 160 ug / ml (mistura de 80 ul de BSA (2 mg / mL) e 20 uL de dH2 O) e 200 ug / ml (100 l de BSA (2 mg / ml).
  2. Medida 5 ul de fluxo através de lavagens e amostras de eluato do passo 4.7. Adicionar 95 uL de dH2O
  3. Adicionam-se 5 ml de reagente azul de Coomassie para as misturas dos passos 5.1 e 5.2. Cubra os tubos com parafilme e de vórtice durante 10 seg depois incubar durante 20 min à TA.
  4. Usando um espectrofotómetro, medir a densidade óptica (DO) ao comprimento de onda de 650 nm para os tubos de proteína a partir do passo 5.3. Lote concentração vs. leitura OD para determinar as concentrações de proteínas 34.

6. Western Blotting

  1. Adicionam-se 5 ul de extractos de P. esquizontes falciparum, 2 ul de Escherichia coli recombinante expressa rhOP-3 proteínas 31, 5 ul de proteínas recombinantes expressas utilizando 2-passo e um passo em sistemas de expressão in vitro humano e 10 ul de produtos de proteína purificada utilizando o método de afinidade para separar os tubos. Adicionar tampão de amostra de electroforese contendo mercaptoetanol a cada tubo para um volume final de 20 ul de fazer amostras de proteínas solubilizadas. Ferver tubos durante 2 minutos.
  2. Carregue amostras de proteínas solubilizadas sobre 10% de gel SDS-PAGE para separar as proteínas.
  3. Transferir proteínas separadas a partir de géis de SDS-PAGE para papel de nitrocelulose (PCN) por electroforese a 35 mA por gel em uma câmara de western blotting semi-seco durante 2 h.
  4. Bloco PCN após a transferência com 2% de leite desnatado.
  5. Incubar bloqueados PCN com os seguintes anticorpos policlonais diluídos 1: 100 em 2% de leite para efectuar transferência de Western; anticorpo de coelho # 676 21 específico para P. roptrias merozóito falciparum, 20 anticorpos de ratinho específicos para P. yoelii e P. roptrias merozoite berghei, anti-soros # 685 específicos para a P. falciparum proteína vacúolo parasitóforo, SERA (serina rico antígeno) 22 e anticorpos específicos para o Maurer217; s proteína fenda CGFP-2TM 28.
  6. Incubar PCNs também em 1: 100 controles do mouse e soro de coelho e cultura gasto sobrenadante (SCS) a partir de células de mieloma SP2 normais diluído como negativos.
  7. Incubar PCNs com anticorpos e os controlos nas 4 ºC O / N.
  8. Lavar PCN 4x com tampão Blot e incubar PCN com espécies anticorpos secundários específicos conjugados com peroxidase de rábano (HRP), diluído 1: 1000 em 2% de leite.
  9. Lavar PCN 4x com tampão de transferência. Incubar PCN lavada com a solução de desenvolvimento de cor A + B (Solução A: adicionar 50 ml de tampão 1x Blot e 30 ul de H 2 O 2; Solução B: adicionam-se 10 ml de metanol e 30 mg de 3-cloro-naftol) para 30 min no escuro. Analisar os resultados western blot colorimetria.

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Representative Results

Validação das proteínas recombinantes expressas através de reactividade com anticorpos específicos é um primeiro passo importante para confirmar a dobragem correcta das proteínas expressas. Proteínas da malária recombinantes foram expressos utilizando o passo e de dois passos em sistemas de expressão isentos de células humanas in vitro. As proteínas recombinantes são o método de afinidade de Ni-quelante purificada. Em seguida, usamos anti-soros contra roptrias inteiras merozoite em transferência Western de proteínas recombinantes separados SDS-PAGE.

A Figura 1 mostra fragmentos de genes amplificados por PCR de PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 PF3D7_1436300 e em um gel de agarose a 1%. As bandas de DNA foram excisadas e DNA purificado por congelamento no DNA extração rotação da coluna.

Malária genes amplificados com sucesso (mostrados na Tabela 2) a partir de ADN genómico foram clonados no vector de expressão pT7CFE-Chis. Re-amplificação dos genes do recoplasmídeos mbinant demonstrou a presença dos fragmentos de genes clonados no vector. O diagrama de fluxo de sistemas de expressão utilizados para a tradução da proteína é mostrada na Figura 2. As Figuras 2A e 2B mostra um procedimento prudente passo do procedimento de 2 passos em sistema de expressão in vitro humano e de células sem o sistema de tradução acoplado IVT 1-passo. Expressão sucesso de proteínas de Plasmodium utilizando sistemas in vitro de células humanas livre expressão foi confirmada por rhoptry anti-soros de coelho específico. Tal como ilustrado na Figura 3A, as proteínas recombinantes foram reconhecidos por anti-soros de coelho específico rhoptry # 676. Como mostrado anteriormente, expressaram proteínas recombinantes não foram reconhecidos por anti-soros contra proteínas de P. vacúolo parasitóforos falciparum e P. yoelii demonstrando a especificidade do anti-soro de coelho 676 contra as proteínas expressas a 32. Soro de coelho normal (NRS), não reagiram com proteínas recombinantestraduzido usando 2-passo na célula do sistema de expressão in vitro humano livre e um passo IVT acoplado sistema de tradução (Figura 3B). A expressão bem sucedida das proteínas recombinantes Plasmodium foi confirmada por diferentes técnicas, tais como Na-gel de coloração de histidina e de níquel-HRP 32 coloração. As proteínas expressas foram purificadas pelo sistema de purificação por afinidade. A purificação é realizada no método descontínuo (não colunas usado). A técnica é optimizado por alteração da concentração de imidazole de 60 mM a 100 mM. A concentração óptima para a eluição é de 250 mM. A Figura 4 mostra a purificação bem sucedida de proteínas traduzidas a partir de 25 ul de produtos proteicos traduzidos. A Figura 4A mostra a purificação bem sucedida de fenda proteína transmembranar de Maurer 18. A Figura 4B mostra a purificação bem sucedida de PF3D7_0925900, P. falciparum ortólogo de Plasmodium yoelii PY17X_0830000 gene, umaproteína hipotética de 32. A Figura 4C mostra a purificação bem sucedida de repetições tatu contendo proteína PY17X_1139200, uma proteína hipotética usando pérolas de resina de Ni e 100 mM de imidazole em 1x tampão de eluição. O rendimento de proteína após a purificação é de 3,5 ug / 25 uL.

Figura 1
Figura 1. A amplificação de P. falciparum e P. genes. yoelii produtos em gel de agarose 1% de brometo de etídio mostrando coradas PCR de fragmentos de genes de PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 e PFA0680cw amplificados a partir de P. ADN genómico de P. falciparum.

Figura 2
Figura 2. Fluxograma de bas HeLa celular ed sistema de expressão livre. Representação esquemática de ambos 2-step e 1-passo em sistemas in vitro livre expressão de células humanas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Imunotransferência confirmação da expressão da proteína. A análise de Western blot de proteínas recombinantes expressas utilizando coelho específico todo rhoptry anti-soros # 676 e soro de coelho normal. (A) A reactividade de anti-soros de 676 com as proteínas recombinantes expressas. (B) de soro normal de coelho não reagiu com as proteínas recombinantes expressas. Proteína vacúolo parasitóforo não reagiu com as proteínas recombinantes 32."target =" _ blank hres.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Purificação de proteínas a partir das micro volumes de produto de tradução. A purificação de proteínas recombinantes expressas utilizando níquel quelante método de afinidade em resina. As proteínas expressas (tradução) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, e (C) PY17X_1139200 proteínas foram incubadas com Níquel - resinas quelantes são purificados com resina quelante de Níquel, na ausência de tampão de imidazol em tampão de ligação e purificação. Após a incubação, as esferas foram centrifugadas, as proteínas não ligadas foram separadas e as pérolas lavadas duas vezes em tampão de lavagem. Proteínas recombinantes ligadas foram eluídas duas vezes seguida de uma lavagem das pérolas. Proteínas traduzidas, lavagens, eluatos e contasforam solubilizados em tampão de amostra de electroforese. Imidazole foi usado na lavagem (20 mM de imidazol) e eluição (100 mM de imidazol) buffers. Os anti-soros # 676 reconhecido com sucesso e expressa proteínas recombinantes purificadas. Soro normal de coelho não reagiu com proteínas expressas como mostrado na Figura 3B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<td> 200 KDa
Características Sistema de expressão de célula humana gratuito Trigo células germinativas sistema de expressão livre Sistema de expressão de reticulócitos de coelho Lisado de E. coli sistema de expressão de proteínas
Tempo Feito transcrição e tradução em 3 horas Transcrição durante 6 horas e tradução de 10-20 horas ARN tem de ser isolado a tradução é 90 min Dome em 1 hora
Vector adequado T7 vector pode ser SP6 vector T7 pode ser utilizada T7 pode ser utilizada
Escala adequada Adequado para a síntese de laboratório Usado para a síntese de proteínas em grande escala Adequado para estudos laboratoriais e imunização Adequado para estudos laboratoriais e imunização
Extrato Extractos livres de células HeLa Embrião de extratos de trigo Extractos de células dos reticulócitos Extractos de E. coli lisado celular
Modificação A co-translacional e modificação pós translacional Pós translacional A co-translacional modificação Modificação pós-translacional
Tamanho da proteína traduzida 8 kDa e 250 kDa 220 KDa 250 KDa
Otimização códon Justa Justa Solto Justa
Dissulfeto de formação de ligação Sim Sim Não Sim
Rendimento Baixo rendimento Alto rendimento Baixo Rendimento Muito alto rendimento
Custo $ 130,00 para 10 reacções 173,00 $ para 10 reacções 136,00 $ 5 para reacções 159,00 $ 8 para reacções
A concentração de proteínas 3 a 5 ug por reacção 100 ug / ml 100 ug / ml 500 ug / ml
Referências 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

Tabela 1. Celulares sistemas de livre expressão na pesquisa da malária. Comparação de celularOs sistemas de expressão livres usado actualmente em investigação da malária.

Gene ID Ort�logo ID Proteína Sequência iniciadora para PCR
PF3D7_1436300 Componente translocon CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 Proteína de fenda CGFP-2TM Maurer GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 Proteína hipotética GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 Proteína hipotética GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

Tabela 2. genes Rhoptry no estudo. Os iniciadores de diferentes genes expressos neste estudo 19.

Nome dos Materiais Companhia Número de catálogo Descrição
2-step em células humanas in vitro sistema de livre expressão 32 Thermo Fisher 88.856 Interrompido. Sempre armazenar a -80 ° C. Não descongelar em água morna.
Um passo in vitro acoplado sistema de tradução Thermo Fisher 88.860 Sempre armazenar a -80 ° C. Não thaw em água morna.

Tabela 3. Hela com células, os sistemas de expressão livres. Kits utilizados para a expressão de proteínas.

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Discussion

Os passos importantes para a expressão bem sucedida das proteínas em dois passos, utilizando em sistema de expressão de células humanas in vitro livre e purificação são: 1) a amplificação bem sucedida e clonagem de genes em pT7CFE-Chis plasmídeo vector; 2) a transcrição do RNA a 30 ° C; 3) a tradução de proteína a 30 ° C na presença de inibidor de ARNase; 4) desenvolver o protocolo de purificação de afinidade com base usando esferas de resina revestidos com Ni e 5) análise de resultados em western blot utilizando anticorpos policlonais e monoclonais. Os passos importantes para a expressão bem sucedida das proteínas utilizando um sistema de tradução IVT passo acoplado à proteína são: 1) a amplificação bem sucedida e clonagem de genes em pT7CFE-Chis plasmídeo vector; 2) A transcrição e a tradução de proteínas a 30 ° C; 3) desenvolvimento do protocolo de purificação de afinidade com base usando esferas de resina revestidos com Ni e 4) analisar os resultados em western blot utilizando anticorpos policlonais e monoclonais.

Atually, sistemas de expressão isentos de células são utilizadas para expressar proteínas recombinantes malária. Os recursos críticos de sistemas de célula de livre expressão para expressar proteínas malária é a capacidade de decodificar genes AT ricas, a falta de pausa longa translacional, expressão bem sucedida de sequências repetidas de aminoácidos, a falta de mecanismos de glicosilação ea capacidade de plasmídeos para controlar truncamento gene. No presente estudo, nós demonstramos a utilização de um de dois passos in vitro de células humanas sistema de expressão livre 32 e de um passo de FPI acoplado sistemas de tradução para expressão de P. ortólogos de gene de P. falciparum genes yoelii merozoítos rhoptry como mostrados na Tabela 1. Um protocolo de purificação foi desenvolvido e optimizado para a purificação de micro-volumes das proteínas recombinantes obtidas a partir de um passo e de dois passos em sistemas de expressão isentos de células humanas in vitro. 4 P. genes falciparum, PF3D7_0114100 uma proteína hidrofóbica transmembranar, uma repetição ARM hipotético previstoPF3D7_1361800 proteína e uma proteína hidrofílica PF3D7_0925900, foram expressos usando um 2-step e 1-passo na célula humana sistema livre expressão vitro. Rendimentos proteína purificada foram determinadas. A proteína CGFP-2TM foi incluído nestes estudos porque é uma proteína de membrana integral com dois domínios transmembranares e estávamos interessados ​​em determinar se o sistema de expressão in vitro pode expressar correctamente a proteína transmembranar e permitir a facilidade de purificação.

A principal diferença em ambos os sistemas de expressão de um passo e de dois passos é que o sistema de expressão de duas fases é um sistema dependente de ARNm, em que um ARNm estável é transcrito e adicionado à reacção de tradução. Em contraste, a um passo in vitro acoplado transcrição / sistema de tradução envolve uma transcrição contínua e fornecimento de ARNm seguido da co-tradução da proteína durante a reacção. Ambos um passo IVT transcrição / tradução acoplada esistema Xpression e 2-passo no sistema de expressão de célula livre humano in vitro foram testadas para a expressão de proteínas de elevado peso molecular. Ambos os sistemas foram bem sucedidos em expressar proteínas recombinantes de baixo peso molecular. No sistema de expressão de um-passo, foi observada reactividade cruzada do anticorpo com as proteínas na mistura de reacção de tradução. As proteínas específicas cruzar reagir com os anticorpos são desconhecidos e precisam de uma investigação mais aprofundada. Expressão de proteínas de elevado peso molecular não teve sucesso utilizando tanto a sistemas de 2 passos e um passo. Um protocolo de purificação foi desenvolvido para microvolumes purificação de proteínas recombinantes de diferentes propriedades de solubilidade expressos usando tanto um passo e 2-passo em sistemas de expressão isentos de células humanas in vitro. As proteínas foram purificadas com sucesso e o rendimento obtido foi de 3,5 g por 25 jil quando expressa utilizando 2-passo no sistema de tradução de proteínas in vitro e de 1,5 ug por 25 jil quando traduzido com o passo eu 1-VT sistema de expressão de proteína. Expressão de proteínas de baixo peso molecular entre 18 kDa a 37 kDa, é reprodutível e para a frente. No entanto, a expressão elevada de peso molecular de proteína resulta em truncagens. Devido às microvolumes obtidos para o DNA clonado, a amplificação por PCR foi usada para verificar a produtos clonados. Obstáculos potenciais para a expressão de proteínas de elevado peso molecular, utilizando sistemas de expressão isentos de células podiam ser fosforilação constante de eIF2 subunidade alfa devido à alta concentração de ATP na reacção. Isto prejudica a iniciação da tradução no sistema que afecta potencialmente o alongamento da síntese de proteínas durante a síntese de proteínas grandes em sistemas de expressão de célula livre 10.

O protocolo aqui descrito não é influenciado por condições de optimização para a expressão de proteínas. Nem os codões do gene nem o plasmídeo foram optimizados para a expressão de proteínas, e de redobragem de proteínas não foi necessária. Este sistema expressa proteins em 3 h e a purificação da proteína pode ser obtida em 2 horas, permitindo que em aplicações a jusante, tais como o processamento da proteína recombinante para vacinas ou péptido sequenciação. Várias proteínas recombinantes podem ser expressas com o sistema isento de células HeLa, utilizando formatos microarray para o rastreio de soros imunes e identificação de potenciais moléculas de candidatos a vacinas. Além disso, as proteínas potencialmente imunogénicas podem ser identificados através de telas e selecionados proteínas obtidas pela ampliação expressão.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

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Bioquímica Edição 100 celular livre transcrição in vitro-tradução células HeLa a liberdade de expressão as proteínas rhoptry células de mamíferos sistema de livre expressão, Pro bond purificação por afinidade
Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas
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Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa… More

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

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