Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

Expressie van malaria eiwitten in cellen gebaseerde systemen blijft uitdagend. We tonen twee stappen en een stap IVT (in vitro translatie) celvrije expressiesystemen voor het uitdrukken van malaria rhoptry recombinante eiwitten uit HeLa-cellen. We maken gebruik van een Ni-gebaseerde hars affiniteit zuiveringssysteem de rhoptry eiwitten te zuiveren.

Abstract

Malaria veroorzaakt aanzienlijke wereldwijde morbiditeit en mortaliteit. Geen routine vaccin is momenteel beschikbaar. Een van de belangrijkste redenen voor het ontbreken van een vaccin is het probleem van het identificeren van geschikte vaccin gegadigden. Malaria proteïnen uitgedrukt in prokaryote en eukaryote cellen gebaseerde expressiesystemen worden slecht geglycosyleerd algemeen onoplosbaar ondergaan onjuiste vouwing leidt tot verminderde immunogeniciteit. De tarwekiemen, konijn reticulocytlysaat en Escherichia coli lysaat cel vrije expressie systemen worden momenteel gebruikt voor de expressie van malaria eiwitten. De lengte van de expressieperiode en oneigenlijk glycosylering van eiwitten nog steeds een uitdaging. We tonen expressie van Plasmodium eiwitten in vitro gebruik van HeLa gebaseerde mobiele vrije expressie systemen, aangeduid als "in vitro menselijke cel vrije expressie systemen". De 2 HeLa gebaseerd celvrije expressiesystemen transcriberen mRNA in 75 min en 3 pi transcribed mRNA is voldoende om eiwitten te vertalen in 90 min. De 1-staps expressiesysteem is een transcriptie- en translatie-gekoppelde expressiesysteem; de transcriptie en co-translatie voorkomt in 3 uur. De werkwijze kan ook worden uitgebreid voor 6 uur door extra energie. In de 2-staps expressiesysteem, wordt mRNA eerst getranscribeerd en vervolgens aan het translatiemengsel voor eiwitexpressie. We beschrijven hoe malaria eiwitten tot expressie; een hydrofobe PF3D7_0114100 Maurer's Gespleten - 2 transmembraan (PfMC-2TM) eiwit, een hydrofiele PF3D7_0925900 eiwit en een gordeldier herhalingen bevatten eiwit PF3D7_1361800, met behulp van de HeLa gebaseerde cel vrije expressie systeem. De eiwitten worden tot expressie gebracht in microvolumes gebruik 2 stappen en stap 1 expressie strategieën. Een werkwijze voor affiniteitszuivering 25 gl eiwitten aanwezig gebruikmaking van de in vitro humane celvrij expressiesysteem wordt ook beschreven zuiveren. Eiwitrendement wordt bepaald door de Bradford test en de tot expressie gebrachteen gezuiverde eiwitten kan worden bevestigd door Western blot analyse. Expressie gebrachte recombinante eiwitten kunnen worden gebruikt voor immunisaties, immunoassays en eiwitsequentie.

Introduction

In malaria onderzoek, blijft de expressie van immunogène eiwitten met behulp van prokaryote of eukaryote cellen gebaseerde systemen een uitdaging. De AT rijkdom van Plasmodium genoom en onbekende posttranslationele mechanismen 14,7, bij aan de problemen geassocieerd met het verkrijgen van correct gevouwen en immunogene eiwitten voor antilichaamproductie en vaccine studies. Prokaryote systemen zoals Escherichia coli werden gebruikt voor recombinante eiwitexpressie. Prokaryotische systemen zijn lage kosten, efficiënte, produceren hoge opbrengsten van recombinante eiwitten en meerdere kloonvectoren. Host E. coli-cellen zijn eenvoudig te transformeren en cellen snel groeien. Echter, prokaryotische systemen hebben beperkingen zoals gebrek aan aminozuursubstitutie, post-translationele modificatie, besmettingsgevaar, heterogene producten en accumulatie van recombinante eiwitten in insluitingslichamen 24.

In eenonderzoek van Mehlin et al. (2006), 1000 open reading frames (ORF) hadden. Ongeveer 7% van de tot expressie gebrachte eiwitten waren oplosbaar 14. De onoplosbaarheid waargenomen wordt veroorzaakt door de voorgespannen aard van de genen en de hoge frequentie van codons die idealiter worden gebruikt door de Plasmodium AT rijke genoom 14. Een alternatieve strategie om dit probleem te ondervangen is ontwikkeld door plasmiden en gastheercellen die tRNAs dat zeldzame codons of codons die overeenkomen met de frequenties 3 herkennen. Zelfs na het uitvoeren van deze optimalisaties, zeer kleine porties eiwitten aanwezig als oplosbare, actieve immunogene 14. De cel-vrije expressie systemen bevatten alle componenten die nodig zijn voor de transcriptie en translatie zoals ribosomen, initiatie factoren, elongatie factoren (vertalingen factoren), tRNA en aminoacyl-tRNA synthetasen. Zowel transcriptie en translatie reacties worden gekoppeld eenstapsprocedure 11,29. De transcription reactie wordt uitgevoerd in een rol voor geschikte hoeveelheid mRNA geïncubeerd met translatie machinerie in een ander buisje 11,29. Hoewel deze werkwijzen succesvol Plasmodium sp. Eiwitexpressie zijn een groot nadeel is de duur van eiwitexpressie, wat ongeveer 22 uur 29. Daarnaast zijn de hoge kosten van benodigdheden voor opneming in de protocollen 29, de arbeidsintensieve preparaten van het cellysaat en inconsistenties in bestanddeel preparaten, maken deze systemen onbereikbaar. De belangrijkste focus van de onderzoekers voor de ontwikkeling van een cel vrije expressie systeem is afhankelijk van factoren zoals de snelle genetische modificatie, snel rendement met een hoge concentraties en straight forward lysaat voorbereidingen 1.

Eukaryote systemen zoals gist, zoogdiercellijnen, baculovirus expressiesysteem gemedieerd, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum en parasitaire expressiesystemen such zoals Leishmania werden gebruikt voor recombinante eiwitexpressie 7. Eukaryote systemen delen fylogenetische relatie en dus ook de kenmerken zoals glycosylering, acylering, de vorming van disulfidebinding, chaperone interactie, proteolyse en sub-cellulaire verkokering te delen. Eiwitsecretie gebeurtenissen in eukaryoten voorkomen accumulatie en verlaagt de toxiciteit voor expressie systemen 13. Het gebruik van gistsystemen heeft de voorkeur aangezien zij geschikt zijn voor eiwitexpressie op grote schaal en voor het verkrijgen van hoge opbrengsten 4. Twee P. falciparum eiwitten PfCP-29 en Pvs25 werden geproduceerd met behulp van de gist systeem 4. Echter, een belangrijk nadeel in de synthese van de meeste eiwitten was onregelmatig N en O-glycosylering patronen verkeerde vouwing en truncatie van eiwitten uit hun natieve vorm 4.

Het gebruik van zoogdiercellen voor de synthese van recombinante eiwitten is arbeidsintensief en wordt expensive stabiele recombinante cellijnen 4 te handhaven. Daarom zijn zoogdiercellen beperkt voor de analyse van eiwit signalering, eiwitinteracties en parasiet-gastheer interacties maar ook voor het testen van DNA-vaccins 4. The Human DNA en mRNA in vitro eiwitexpressie celvrij systeem hierin beschreven is een HeLa-cellen afgeleide-zoogdierlijke systeem dat eiwitten tot expressie in 3 uur. Eiwitten uitgedrukt met behulp pT7CFE1-Chis expressievector hebben een C-terminaal tag vergemakkelijkt de identificatie en zuivering. De HeLa systeem wordt aangevuld met translatie initiatie factoren en een vertaling regulator, waardoor de efficiëntie van het vertaalsysteem verbeteren. Eiwitten kunnen snel worden vertaald gescreend geverifieerd en in diverse immunologische en structurele toepassingen 15 verwerkt voor gebruik.

Eukaryote celvrije expressiesystemen zoals tarwekiemen en konijnen reticulocyten worden momenteel gebruikt voor de expressie van various eukaryotische eiwitten waaronder Plasmodium eiwitten 11,29. Bovendien, E. coli gebaseerde celvrije systemen worden ook toegepast voor eukaryote eiwitexpressie 11. Tabel 1 vat de verschillende celvrije expressiesystemen door vergelijking van kenmerken van de systemen en het gemak van het gebruik van systemen voor eiwitexpressie. De humane celvrij systeem in vergelijking met de anderen heeft de mogelijkheid om post en co-translationele modificaties uitvoeren en goedkoper. Codon-optimalisatie mogelijk en alle reacties in 3 uur worden uitgevoerd. De HeLa-systeem een ​​ideale translatiesysteem voor eiwitsynthese in de laboratoriumopstelling.

Een groot voordeel van humane celvrije expressiesystemen boven andere celvrije systemen is de beschikbaarheid van verschillende cellijnen afkomstig van verschillende organen en weefsels. Verschillende soorten celvrije systemen worden ontworpen, afhankelijk van de cellijn. Het extracts afgeleid van zoogdiercellen hogere efficiëntie grote eiwitten te synthetiseren dan andere celvrije expressiesystemen. De celvrije expressiesystemen kunnen ook worden gebruikt in diagnostische en eiwitkarakterisering toepassingen zoals micro arrays 30. De populaire HeLa cellijnen worden het meest gebruikt voor de expressie van eiwitten 33 te voeren. Het endoplasmatisch reticulum in HeLa cellijnen onvoldoende ontwikkeld, waardoor de afwezigheid van post-translationele modificatie glycosylering activiteit 33. Echter, dit systeem aangenomen voordelig Plasmodium eiwitsynthese te zijn zoals Plasmodium ontbreekt ook glycosylering na translatie modificatie 29. De HeLa celvrije transcriptie-translatie protocol is eenvoudig uit te voeren, goedkoop en eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in 90 min, gereed voor zuivering en toepassingen later.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de Parasite Celkweken, Collectie van Parasite Pellets

  1. Bereid RPMI-1640-medium door toevoeging HEPES 10 g RPMI-1640 poeder, 66 mg gentamycine sulfaat, 2 g natriumbicarbonaat, 5,9 g HEPES-buffer, 50 mg hypoxanthine en 3,8 g dextrose in 1 L steriele dH 2 O. Meng met behulp van tafel magneetroerder tot alle poeder opgelost in 1 liter gedestilleerd water. Voer micro filtratie van media met behulp van 0,22 pm filter. Bewaar de media in steriele flessen.
  2. Was ongeïnfecteerd (vers) type A + erytrocyten met behulp van RPMI. Bereid 5% hematocriet van erytrocyten (0,5 ml vers gewassen erytrocyten in 9,5 ml RPMI + 10% humaan serum).
  3. Voeg 15% humaan serum + RPMI (15 ml humaan serum en 85 ml RPMI) het kweken van parasieten leiden. Voeg 10% humaan serum en RPMI (10 ml humaan serum en 90 ml RPMI) verder kweken van parasieten in rode bloedcellen.
  4. Cultuur P. falciparum (3D7 en FCR-3 stammen) in typeA + menselijk erytrocyten bij 5% hematocriet en 20% parasitemie in petrischaal of een 75 cm 3 kolf. Handhaaf cultuur in vitro volgens de werkwijze van Trager en Jensen Theelichthouder 26. Alternatief handhaven culturen in incubator bij 37 ° C werd gehouden 9,5% CO2 en 3,4% N2 gas. Cultuur P. falciparum in RPMI 1640-HEPES medium gesupplementeerd met 10% humaan serum.
  5. Synchroniseer P. falciparum cultuur door het toevoegen van 65% Percoll (65 ml Percoll + 35 ml RPMI-1640 zonder menselijke serum) aan de kweek te concentreren 27.
  6. Centrifugeer de kweek concentraat met Percoll bij 2500 xg gedurende 5 minuten waardoor 3 lagen. Zorgvuldig met een transferpipet isoleren schizonten van het midden overdrachtslaag in een afzonderlijke buis onder aseptische condities 27.
  7. Was de geïsoleerde kweken met 10% humaan serum + RPMI-1640 maal tot overmaat Percoll te verwijderen door centrifugeren bij 7500 g gedurende 5 min. Discard de bovenstaande telkens onder aseptische omstandigheden 27.
  8. Ga door het kweken van de gesynchroniseerde P. falciparum schizonten in 10% humaan serum + RPMI-1640 27.
  9. Verzamel schizonten door behandeling Plasmodium geïnfecteerde erytrocyten met 10 mM Tris pH 8,8 en centrifugeren bij 15.000 xg gedurende 15 min 23. WINKEL parasiet pellets bij -70 ° C na toevoeging van 5 pl proteaseremmer (aprotinine) aan de pellets. Gebruik parasiet pellets voor eiwit-extractie, genomische DNA isolatie en RNA-isolatie.

2. Voorbereiden plasmidevector

  1. Isoleer genomisch DNA van P. falciparum schizont pellets bereid uit kweken van ongeveer 20% parasitemie.
  2. Voeg 600 ul van 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS en 1 mg / ml proteinase K, pellets in een microcentrifugebuis, homogeniseren pellet met behulp van een 1 ml spuit verbonden met een 26 G naald. Alternatieve vullen van de spuitde pellet mengsel en legen in een microcentrifugebuis 20 keer. Incubate buis met homogenaat O / N in een 50 ° C waterbad.
  3. Voer fenol - chloroform (P + C) extractie met toevoeging van 600 ui P + C (300 ui fenol en 300 pl chloroform) gehomogeniseerd pellet. Cap buis strak en schud het mengsel krachtig door het omkeren van de buis end-to-end. Centrifugebuis bij 14.000 xg gedurende 2 minuten en laat bovenstaande waterige oplossing met behulp van een micropipet in een nieuwe microcentrifugebuis. Herhaal deze stap twee keer.
  4. Voeg 600 ul chloroform aan de waterige laag in de nieuwe buis uit stap 2.1.2. Vortex de buis gedurende 10 seconden en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 2 min. Meet de bovenste waterlaag met een micropipet en overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis.
  5. Voeg 0,1 volume van 5 M natriumacetaat pH 5,5 en 1 volume isopropanol (als waterige laag 300 pl voeg 30 pl van 5 M natriumacetaat pH 5,5 + 330 pl isopropanol) aan waterige layer vanaf stap 2.1.3. Incubeer de buis bij kamertemperatuur 15 min.
  6. Centrifugeer de buis bij 14.000 xg gedurende 10 min om DNA pellet precipiteren. Verwijder het supernatant en was pellet met 100 pl 70% ethanol (70 pl ethanol en 30 ui dH 2 O) om overmaat zout uit het DNA te verwijderen. WINKEL DNA in 50 ui dH 2 O bij -20 ° C.
  7. Ontwerp van voorwaartse en reverse primers met behulp van software of handmatig voor amplificatie van P. falciparum genen PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 en PF3D7_0114100 eerder geïdentificeerd in proteoom 16,18 studies met geschikte restrictieplaatsen voor het kloneren van het gen sequenties in de meervoudige kloneringsplaatsen van expressieplasmide pT7CFE1-CHIS toe zoals getoond in Tabel 2.
  8. Wordt 50 pi reactiemengsel door toevoegen; 5 pl geïsoleerde P. falciparum genomisch DNA, 5 ui 10X buffer, 5 pl MgCl2, 1,5 pl voorwaartse primer, 1,5 plreverse primer, 0,5 pl T7 DNA polymerase en 31,5 pl dH 2 O en uitvoeren polymerase chain reaction (PCR) bij 94 ° C gedurende 8 minuten voor denaturatie, 50 ° C gedurende 1 min 30 sec voor uitbreiding of 72 ° C gedurende 9 min voor annealing en renaturatie voor het amplificeren van genen in tabel 1.
  9. Afzonderlijke PCR-producten op 1% agarose gel (1 g agarose en 100 ml Tris-acetaat EDTA (TAE) buffer) 32.
  10. Snijd het PCR geamplificeerde DNA-banden van de agarose gel, plaatst de gelschijfjes bevattende DNA in een gel van DNA-extractie centrifugekolom en invriezen bij -20 ° C gedurende 5 min. Voeg 100 ul isopropanol aan de bevroren gelplakjes en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 min.
  11. Meet de waterige doorstroom gefiltreerd in de verzamelbuis van stap 2,5, met behulp van een micropipet en naar een nieuwe buis. Voeg 0,1 volume van 5 M natriumacetaat en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en voeg 10 ul van dH 2 O aan The DNA pellet.
  12. Digest de pT7CFE1 CHIS-expressievector en gezuiverde DNA-fragmenten (van 2,6) in twee afzonderlijke buizen door de toevoeging van 3 pi plasmide en 5 ui PCR genproducten aan elke buis. Aan elke buis, 1 gl specifieke restrictie-enzymen, 2 pl reactiebuffer en 14 ui dH 2 O.
  13. Voeg 3 ul van gedigereerde plasmide, 5 ui gedigereerde DNA-fragmenten, 2 ui 10X ligase buffer, 1 ui ligase en 9 ul van dH 2 O in een microcentrifugebuis. Incubeer bij 12 ° CO / N.
  14. Voeg 0,1 volume van 3 M natriumacetaat bij pH 5,5 en 2 volumes ethanol (als ligatie tubes volume is 20 gl voeg 2 pl 3 M natriumacetaat + 44 pl ethanol) aan de buis uit stap 2,14. Goed mengen en incuberen bij -20 ° C gedurende 15 min.
  15. Centrifugeer de buis bij 14.000 xg gedurende 15 min. Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een micro pipet zonder de pellet te verstoren.
  16. Voeg 100 ui 70% ethanol to de pellet uit stap 2.10. Centrifugeer de buis bij 14.000 xg gedurende 5 min. Verwijder de bovenstaande vloeistof. Voeg 10 ul nuclease-vrij water aan het DNA pellet.

3. Eiwit expressie met behulp van in vitro Menselijke cel Gratis Expression System

  1. Bereid 20 pi van transcriptie mengsel door het meten van 2 pl van het recombinant pT7CFE1 CHIS-plasmide-DNA, 4 ui 5x transcriptiebuffer, 4 pi NTP mix, 2 pi T7 RNA Polymerase en 8 pi nuclease-vrij water voor 2 stappen Mens in vitro Protein Expression met behulp van DNA templates. Meng componenten in een microcentrifugebuis en incubeer gedurende 75 minuten bij 30 ° C in een waterbad.
  2. Neem 2 pi van de transcriptie mengsel toevoegen aan 23 gl vertaling mengsel dat 12,5 pl HeLa cellysaat, 2,5 gl additionele eiwitten, 1 pl zoutoplossing A, 0,5 pi aminozuren -Met, 0,5 pi aminozuren Leu, 181; l van RNAse inhibitor, 1,25 pi van de energiemix en 3,75 ul van nuclease-vrij water.
  3. Incubeer de vertaling mengsel van stap 3,2 bij 30 ° C gedurende 90 min. WINKEL vertaald producten bij -20 ° C.
  4. Bereid 25 pl transcriptie en translatie mengsel door toevoeging van 3 pl van het recombinante pT7CFE1 CHIS-plasmide-DNA, 2 pi nuclease-vrij water, 5 gl reactiemengsel, 12,5 ul lysaat HeLa en 2,5 ul van additionele eiwitten van 1-staps Human Gekoppeld IVT Protein Expression voor DNA-templates.
  5. Incubeer het reactiemengsel uit stap 3,4 gedurende 90 minuten tot 6 uur bij 30 ° C. Bewaar de vertaling producten op -20 ° C.

4. Zuivering van tot expressie gebrachte recombinante eiwitten

  1. Voeg 75 ul van 1x zuivering buffer om 25 ul van de vertaling product tot 100 ul van zuivering mengsel te maken.
  2. Voeg 100 ul van nikkel chelerende hars 100 ul zuivering mixture. Wash Ni-hars tweemaal door toevoeging van 300 pi dH 2 O en 300 pl van de bindingsbuffer. Resuspendeer hars en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min om overmaat ethanol te verwijderen.
  3. Voeg 100 ul van zuivering mengsel uit stap 4,2-100 pl nikkel chelaat hars en incubeer gedurende 60 min bij kamertemperatuur werd het mengsel.
  4. Centrifugeer het mengsel bij 14.000 xg gedurende 1 minuut en laat supernatant in een nieuwe buis aangeduid als "doorstromen".
  5. Was de hars met 100 ul 1x wasbuffer (20 mM imidazool, 250 mM NaH 2 PO 4 bij pH 8, 2,5 M NaCl en dH 2 O). Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min en verzamel supernatant in nieuwe buis met het label "wash". Herhaal stap 4,5 keer.
  6. Voeg 100 ul van 1 x elutiebuffer (100 mM imidazool, 250 mM Na 2 PO 4 bij pH 8,0, 2,5 M NaCl en dH 2 O) aan de hars en incubeer gedurende 15 minuten. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min. Doe de elutiestap tweemaal. Iedertijd verzamel supernatant in de frisse microcentrifugebuisjes en label als "eluaat".
  7. Na elutie was tweemaal hars zoals beschreven in stap 4.5. Store doorstromen, wast en elutie monsters bij -20 ° C of lager. Resin moet worden bewaard bij 4 ° C. Gebruik 30 pi van elk monster voor SDS-PAGE en immunoblotting-analyse.

5. Coomassie (Bradford) Protein Assay 34

  1. Bereid standaard bovine serum albumine (BSA) oplossing met de concentratie 20 pg / ml (mix 10 gl BSA (2 mg / ml) en 90 ul van dH 2 O), 40 ug / ml (mix 20 gl BSA (2 mg / ml) en 80 ul van dH 2 O), 60 ug / ml (mix 30 gl BSA (2 mg / ml) en 70 gl van dH 2 O), 80 ug / ml (mix 40 gl BSA (2 mg / ml) en 60 ui dH 2 O), 100 ug / ml (mix 50 gl BSA (2 mg / ml) en 50 ui dH 2 O), 160 ug / ml (mix 80 gl BSA (2 mg / ml) en 20 gl dH2 O) en 200 ug / ml (100 pl BSA (2 mg / ml).
  2. Maatregel 5 pl doorstroming, wast en eluaatmonsters uit stap 4.7. Voeg 95 ul van dH 2 O.
  3. Voeg 5 ml van Coomassie blauw reagens om het mengsel van stap 5.1 en 5.2. Bedek de buizen met parafilm en vortex gedurende 10 seconden daarna geïncubeerd gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
  4. Met behulp van een spectrofotometer meet de optische dichtheid (OD) bij golflengte van 650 nm voor eiwitbuisjes uit stap 5.3. Plot concentratie vs. OD lezing aan het eiwit concentraties 34 te bepalen.

6. Western Blotting

  1. Voeg 5 ul van schizont uittreksels uit P. falciparum, 2 pl Escherichia coli tot expressie gebracht recombinant Rhop-3 eiwitten 31, 5 pi van recombinante eiwitten tot expressie gebracht middels 2 stappen en stap 1 in vitro humane expressiesystemen en 10 pl eiwitproducten gezuiverd middels affiniteit methode buizen scheiden. Voeg elektroforese monsterbuffer met mercapto- ethanol aan elke buis een eindvolume van 20 pi aan oplosbaar eiwit monsters te maken. Kook buisjes gedurende 2 minuten.
  2. Laad gesolubiliseerde eiwit monsters op 10% SDS-PAGE gels om de eiwitten te scheiden.
  3. Transfer gescheiden eiwitten van SDS-PAGE gels op nitrocellulose papier (NCP) van elektroforeren bij 35 mA per gel in een semi-droge western blotting kamer gedurende 2 uur.
  4. Block NCP's na de overdracht met 2% magere melk.
  5. Incubate geblokkeerd NCP's met de volgende polyklonale antilichamen verdund 1: 100 in 2% melk aan western blotting te voeren; konijn antilichaam # 676 21 specifiek voor P. falciparum merozoïet rhoptries, muis antilichamen 20 specifiek voor P. en P. yoelii berghei merozoite rhoptries antisera # 685 specifiek voor P. falciparum parasitophorous vacuole eiwit, SERA (serine rijk antigeen) 22 en antilichamen specifiek voor de Maurer217; s gespleten eiwit PfMC-2TM 28.
  6. Incubate NCP's ook in 1: 100 verdund normale muis en konijn serum en bracht kweeksupernatant (SCS) van SP2 myeloma cellen als negatieve controles.
  7. Incubate NCP's met antilichamen en controles op 4 ºC O / N.
  8. Wash NCP 4x met Blot buffer en incubeer NCP met soortspecifieke secundaire antilichamen, geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) 1: 1000 verdund in 2% melk.
  9. Wash NCP 4x met Blot buffer. Incubeer gewassen NCP de kleurontwikkeling-oplossing A + B (Oplossing A: voeg 50 ml 1x Blot buffer en 30 ui H2O 2, Oplossing B: voeg 10 ml methanol en 30 mg 3-chloor-naftol) voor 30 min in het donker. Analyseer western blot resultaten colorimetrisch.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validatie van de tot expressie gebrachte recombinante eiwitten door middel van reactiviteit met specifieke antilichamen is een belangrijke eerste stap bij het bevestigen van de juiste vouwing van de tot expressie gebrachte eiwitten. Recombinant malaria eiwitten werden uitgedrukt met behulp van de een stap en twee stappen in vitro menselijke cel vrije expressie systemen. De recombinante eiwitten worden gezuiverd Ni-chelerende affiniteit methode. We vervolgens gebruikt antisera tegen hele merozoïet rhoptries in westerse blotting van SDS-PAGE gescheiden recombinante eiwitten.

Figuur 1 toont PCR geamplificeerde genfragmenten van PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 en PF3D7_1436300 in een 1% agarose gel. DNA-banden werden uitgesneden en het DNA gezuiverd door bevriezing in de DNA-extractie Spin Column.

Malaria genen succesvol geamplificeerd (Tabel 2) uit genomisch DNA werden gekloneerd in de pT7CFE CHIS-expressievector. Re-amplificatie van de genen van de recombinant plasmiden toonde de aanwezigheid van de gekloneerde genfragmenten in de vector. Het stroomschema van expressiesystemen toegepast voor eiwittranslatie wordt getoond in figuur 2. Figuren 2A en 2B toont een stapsgewijze werkwijze van de 2-staps in vitro humane celvrij expressiesysteem en de 1-staps IVT gekoppelde translatiesysteem. Succesvolle expressie van Plasmodium eiwitten met behulp van in vitro menselijke cel vrije expressie systemen werd bevestigd door rhoptry specifieke konijnenantisera. Zoals geïllustreerd in figuur 3A, werden recombinante eiwitten herkend door rhoptry specifieke antisera van konijnen # 676. Zoals eerder aangetoond, tot expressie gebrachte recombinante eiwitten werden door antisera tegen parasitophorous vacuole eiwitten van P. erkende falciparum en P. yoelii aantonen van de specificiteit van konijnenantisera 676 ten opzichte van de tot expressie gebrachte eiwitten 32. Normaal konijnenserum (NRS) reageerden niet met recombinant proteïnenomgerekend 2-staps in vitro humane celvrij expressiesysteem en 1-staps IVT gekoppelde translatiesysteem (figuur 3B). De succesvolle expressie van Plasmodium recombinante eiwitten werd bevestigd door verschillende technieken zoals In-gel histidine kleuring en nikkel-HRP kleuring 32. Expressie gebrachte eiwitten werden gezuiverd door affiniteit zuiveringssysteem. Zuivering wordt uitgevoerd in ladingsgewijze methode (geen columns gebruikt). De techniek wordt geoptimaliseerd door verandering van de concentratie van 60 mM imidazol tot 100 mM. De optimale concentratie voor elutie 250 mM. Figuur 4 toont succesvolle zuivering van vertaald eiwit van 25 gl van vertaalde eiwitproducten. Figuur 4A toont succesvolle zuivering van Maurer gespleten transmembraanproteïne 18. Figuur 4B toont succesvolle zuivering van PF3D7_0925900, P. falciparum ortholoog van Plasmodium yoelii gen PY17X_0830000 eenhypothetisch eiwit 32. Figuur 4C toont succesvolle zuivering van armadillo herhalingen bevatten eiwit PY17X_1139200, een hypothetisch eiwit met behulp van Ni hars kralen en 100 mM imidazol in 1x elutiebuffer. De opbrengst aan eiwit na zuivering 3,5 ug / 25 ul.

Figuur 1
Figuur 1. Amplificatie van P. falciparum en P. yoelii genen. 1% agarose gel die ethidiumbromide gekleurde PCR producten van genfragmenten van PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 en PFA0680cw geamplificeerd uit P. falciparum genomisch DNA.

Figuur 2
Figuur 2. Stroomdiagram van HeLa bas ed celvrij expressiesysteem. Schematische weergave van zowel 2-step en 1-stap in vitro menselijke cel vrije expressie systemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Immunoblotting bevestiging van eiwitexpressie. Western blot analyse van expressie van recombinante eiwitten met behulp van gehele rhoptry specifieke konijn anti-sera # 676 en normaal konijnenserum. (A) Reactiviteit van antisera 676 met expressie gebrachte recombinante eiwitten. (B) normaal konijnenserum niet reageert met het tot expressie gebrachte recombinante eiwitten. Parasitophorous vacuole proteïne reageerde niet met recombinante eiwitten 32.hres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Zuivering van eiwitten uit microvolumes translatieproduct. Zuivering van tot expressie gebrachte recombinant eiwitten onder toepassing van nikkel chelerende hars affiniteit methode. Uitgedrukt proteïnen (vertaling) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, en (C) PY17X_1139200 eiwitten werden geïncubeerd met nikkel - chelaatvormende harsen worden gereinigd nikkel- chelerende hars in afwezigheid van imidazool in bindingsbuffer en zuivering buffer. Na incubatie werden beads gecentrifugeerd ongebonden eiwitten werden gescheiden en de parels tweemaal gewassen in wasbuffer. Gebonden recombinante eiwitten werden tweemaal geëlueerd, gevolgd door wassen van de bolletjes. Vertaalde eiwitten, wast, eluaten en kralenwerden opgelost in elektroforese monsterbuffer. Imidazool werd gebruikt in de was (20 mM imidazool) en elutie (100 mM imidazool) buffers. Antisera # 676 met succes herkende expressie gebracht en gezuiverd recombinante eiwitten. Normaal konijnenserum niet reageren met uitgedrukt eiwitten zoals getoond in figuur 3B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

<td> 200 kDa
Kenmerken Menselijke cel-vrije expressie systeem Tarwekiemen celvrij expressiesysteem Konijn reticulocyten expressiesysteem E.coli lysaat eiwit expressie systeem
Tijd Gedaan transcriptie en vertaling in 3 uur Transcriptie voor 6 uur en vertaling voor 10-20 uur RNA te isoleren vertaling duurt 90 min Done in 1 uur
Geschikte vector T7 vector kan SP6 vector T7 kan worden gebruikt T7 kan worden gebruikt
Geschikte schaal Geschikt voor het laboratorium synthese Gebruikt voor de grootschalige eiwitsynthese Geschikt voor het laboratorium en immunisatie studies Geschikt voor het laboratorium en immunisatie studies
Extract HeLa celvrije extracten Embryo van de tarwe-extracten Reticulocyten cel extracten E. coli cellysaat extracten
Wijziging Co-translationele en post-translationele modificatie Bericht translationele modificatie Co-translationele modificatie Post-translationele modificatie
Grootte van eiwit vertaald 8 kDa tot 250 kDa 220 KDa 250 KDa
Codon-optimalisatie Strak Strak Los Strak
Disulfidevorming bond Ja Ja Nee Ja
Opbrengst Lage opbrengst Hoge opbrengst Low Yield Zeer hoge opbrengst
Kosten $ 130,00 voor 10 reacties $ 173,00 voor 10 reacties $ 136,00 voor 5 reacties $ 159,00 voor 8 reacties
Eiwitconcentratie 3-5 ug per reactie 100 ug / ml 100 ug / ml 500 ug / ml
Referenties 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

Tabel 1. Cel vrije expressie systemen in malaria-onderzoek. Vergelijking van de celvrije expressie systemen die momenteel worden gebruikt in de malaria-onderzoek.

Gene ID Ortholoog ID Eiwit Primersequentie voor PCR
PF3D7_1436300 Translocatie component CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 PfMC-2TM Maurer's gespleten eiwit GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 Hypothetische Protein GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 Hypothetische Protein GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

Tabel 2. Rhoptry genen in de studie. Primers van verschillende genen die in dit onderzoek 19.

Stofnaam Bedrijf Catalogusnummer Beschrijving
2-staps in vitro menselijke cel vrije meningsuiting systeem 32 Thermo Fisher 88.856 Stopgezet. Bewaar bij -80 ° C. Niet ontdooien in warm water.
1-staps in vitro gekoppelde translatiesysteem Thermo Fisher 88.860 Bewaar bij -80 ° C. Niet thaw in warm water.

Tabel 3. Hela gebaseerd celvrije expressiesystemen. Kits voor de expressie van eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De belangrijke stappen voor een succesvolle expressie van eiwitten onder toepassing tweestaps in vitro humane celvrij expressiesysteem en zuivering zijn: 1) succesvolle amplificatie en klonering van genen in pT7CFE-CHIS plasmidevector; 2) het transcriberen van RNA bij 30 o C; 3) translatie van proteïne bij 30 ° C in aanwezigheid van RNAse inhibitor; 4) de affiniteit gebaseerde zuiveringsprotocol middels harskorrels bekleed met Ni en 5) het analyseren van de resultaten op Western blot met behulp van polyklonale en monoklonale antilichamen. De belangrijke stappen voor een succesvolle expressie van eiwitten via een stap IVT gekoppeld eiwit translatiesysteem zijn: 1) succesvolle amplificatie en klonering van genen in pT7CFE-CHIS plasmidevector; 2) Transcriptie en translatie van eiwitten bij 30 ° C; 3) het ontwikkelen van de op affiniteit gebaseerde zuiveringsprotocol middels harskorrels bekleed met Ni en 4) het analyseren van de resultaten op Western blot met behulp van polyklonale en monoklonale antilichamen.

Actueelly, zijn cel vrije expressie systemen die worden gebruikt voor het uitdrukken van recombinante eiwitten malaria. De kritische kenmerken van celvrije expressiesystemen malaria-eiwitten tot expressie is de mogelijkheid om te decoderen AT rijke genen ontbreken van lange translationele pauze succesvolle expressie van herhaalde aminozuursequenties, gebrek aan glycosylering mechanismen en het vermogen van plasmiden genen truncatie controleren. In deze studie demonstreren we gebruik van een tweestaps in vitro humane celvrij expressiesysteem 32 en in één stap IVT gekoppelde vertaalsystemen voor expressie van P. falciparum gen orthologen van P. yoelii merozoite rhoptry genen zoals weergegeven in tabel 1. Een zuivering protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd voor micro-volumes van recombinante eiwitten verkregen uit 1-staps en 2-staps in vitro humane celvrije expressiesystemen zuiveren. 4 P. falciparum genen, PF3D7_0114100 een transmembraan hydrofoob eiwit, een voorspelde hypothetische ARM-repeateiwit PF3D7_1361800 en een hydrofiel eiwit PF3D7_0925900 werden uitgedrukt onder gebruikmaking van een 2-stappen en stap 1 in vitro humane celvrij expressiesysteem. Gezuiverd eiwit opbrengsten werden bepaald. Het eiwit PfMC-2TM werd in deze studies omdat het een integraal membraaneiwit met twee transmembraandomeinen en we geïnteresseerd waren om te bepalen of het in vitro expressiesysteem correct kon uitdrukken het transmembraan eiwit en maken gemakkelijke zuivering.

Het belangrijkste verschil tussen beide een stap en twee stappen expressiesystemen is dat de tweestaps expressiesysteem een mRNA afhankelijke systeem, waarbij een stabiel mRNA wordt getranscribeerd en toegevoegd aan de translatiereactie. Daarentegen één schakel in vitro gekoppelde transcriptie / translatiesysteem omvat een continue transcriptie en aanvoer van mRNA gevolgd door het co-translatie van eiwit gedurende de reactie. Zowel de 1-stap IVT transcriptie / translatie gekoppeld expression systeem en 2-staps in vitro humane celvrij expressiesysteem werden getest op expressie van eiwitten met hoog molecuulgewicht. Beide systemen waren succesvol in het uitdrukken van laag moleculair gewicht recombinante eiwitten. In de 1-staps expressiesysteem werd antilichaam kruisreactiviteit eiwitten in het translatiereactie mengsel waargenomen. De specifieke kruisreagerende eiwitten met de antilichamen zijn bekend en hebben verder onderzoek. Expressie van eiwitten met hoog molecuulgewicht niet succesvol zowel met de 1-staps en 2-staps systemen. Een zuivering protocol is ontwikkeld voor het zuiveren microvolumes van recombinante eiwitten van verschillende oplosbaarheidseigenschappen uitgedrukt in zowel 1-staps en 2-staps in vitro humane celvrije expressiesystemen. Eiwitten werden succesvol gezuiverd en de verkregen opbrengst was 3,5 ug per 25 ul bij uitgedrukt in 2-staps in vitro translatiesysteem eiwit en 1,5 mg per 25 ul bij vertaling van de 1-staps IVT eiwit expressiesysteem. Expressie van laagmoleculaire eiwitten die variëren van 18 kDa tot 37 kDa reproduceerbaar en ongecompliceerd. Echter, hoog molecuulgewicht expressie resulteert in eiwit inkortingen. Door de verkregen gekloneerde DNA microvolumes, werd PCR amplificatie gebruikt om gekloonde producten te verifiëren. Mogelijke belemmeringen voor die hoge molecuulgewicht eiwitten middels celvrije expressiesystemen constant fosforylatie van eIF2 alfa-subeenheid kan worden veroorzaakt door hoge concentraties van ATP in de reactie. Dit verslechtert het translatie initiatie in het systeem dat tot gevolg dat de rek van de proteïnesynthese tijdens de synthese van grote eiwitten in celvrije expressiesystemen 10.

De hier beschreven protocol wordt niet beïnvloed door optimaliteitsvoorwaarden voor expressie van proteïnen. Noch het gen codons of het plasmide geoptimaliseerd voor expressie van proteïnen en proteïne hervouwing was niet nodig. Dit systeem uitdrukt proteins in 3 uren en de zuivering van het eiwit kan worden verkregen in 2 uur, waardoor voor toepassingen later als verwerking van het recombinante eiwit om de immunisatie of peptide sequencing. Meerdere recombinante proteïnen kunnen tot expressie worden gebracht met de HeLa celvrij systeem met behulp microarray formaten voor immune sera screening en identificatie van potentiële vaccin kandidaat moleculen. Bovendien kan mogelijk immunogene eiwitten worden geïdentificeerd door schermen en de geselecteerde eiwitten verkregen door grotere expressie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
  2. Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).
  3. Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  4. Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197 (2008).
  5. Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
  6. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
  7. Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
  8. Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
  9. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
  10. Hinnebusch, A. Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).
  11. Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
  12. Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
  13. Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
  14. Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
  15. Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
  16. Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
  17. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
  18. Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
  19. Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
  20. Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
  21. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
  22. Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
  23. Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
  24. Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
  25. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  26. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  27. Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
  28. Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
  29. Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
  30. Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
  31. Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
  32. Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
  33. Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Tags

Biochemie Cell gratis in vitro transcriptie-translatie HeLa cel vrije expressie rhoptry eiwitten zoogdiercellen vrije expressie systeem, Pro Bond affiniteitszuivering
HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Eiwitten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa… More

Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter