Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Sommario

Espressione di proteine ​​della malaria nei sistemi basati su celle rimane difficile. Dimostriamo due sistemi di cella di espressione libera di passo e un passo IVT (nella traduzione vitro) per l'espressione di proteine ​​della malaria rhoptry ricombinanti da cellule HeLa. Usiamo un sistema di purificazione a base Ni-resina di affinità per purificare le proteine ​​rhoptry.

Abstract

La malaria causa una significativa morbilità e mortalità globale. Nessun vaccino di routine è attualmente disponibile. Uno dei motivi principali per la mancanza di un vaccino è la sfida di identificare idonei vaccini candidati. Proteine ​​malariche espressi utilizzando sistemi di espressione cellulari basati procariote ed eucariote sono scarsamente glicosilate, generalmente insolubile e sottoposti pieghevole improprio con conseguente riduzione della immunogenicità. I sistemi di espressione libere di germe di grano, reticolociti di coniglio lisato ed Escherichia coli lisato sono attualmente utilizzati per l'espressione di proteine ​​della malaria. Tuttavia, la lunghezza del tempo di espressione e glicosilazione impropria di proteine ​​rimane ancora una sfida. Dimostriamo espressione di proteine ​​Plasmodium in vitro utilizzando sistemi di espressione libera cellulari basato HeLa, denominati "sistemi in vitro di cellule umane libera espressione". I sistemi di espressione cell free basato 2 HeLa trascrivere mRNA in 75 minuti e 3 ml di transcribed mRNA è sufficiente la traduzione proteine ​​in 90 min. Il sistema di espressione 1-passo è una trascrizione e traduzione sistema di espressione accoppiato; la trascrizione e co-traslazione avviene in 3 ore. Il processo può anche essere esteso per 6 ore fornendo energia supplementare. Nel sistema di espressione 2-passo, viene prima mRNA trascritto e quindi aggiunto alla miscela di traduzione per l'espressione della proteina. Descriviamo come esprimere le proteine ​​della malaria; una idrofobica Cleft di PF3D7_0114100 Maurer - 2 transmembrana (PFMC-2TM) di proteine, una proteina PF3D7_0925900 idrofila e un armadillo ripete contenenti proteine ​​PF3D7_1361800, utilizzando il sistema di espressione delle cellule HeLa base. Le proteine ​​sono espresse nelle micro volumi impiegando strategie di espressione 2-step e 1-step. Un metodo di purificazione di affinità per purificare 25 ml di proteine ​​espresse utilizzando il sistema di libera espressione in vitro delle cellule umane è anche descritto. Resa di proteine ​​è determinato mediante saggio di Bradford e l'espressoe proteine ​​purificate possono essere confermati da analisi di western blotting. Proteine ​​ricombinanti espresse possono essere utilizzati per vaccinazioni, test immunologici e proteine ​​sequenziamento.

Introduzione

Nella ricerca la malaria, l'espressione delle proteine ​​immunogeniche utilizzano sistemi basati cellula procariote o eucariote rimane una sfida. La ricchezza AT del genoma Plasmodium e sconosciute meccanismi posta traslazionali ^14,7, contribuiscono alle difficoltà connesse con l'ottenimento di proteine ​​correttamente giunte e immunogenico per gli studi di produzione di anticorpi e vaccini. Sistemi procariotici quali Escherichia coli sono stati utilizzati per l'espressione della proteina ricombinante. Sistemi procariotiche sono a basso costo, efficace, producono alte rese di proteina ricombinante e hanno pi....

Protocollo

1. Preparazione di Parasite colture cellulari, Collezione di Parasite Pellet

1. Preparare supporti RPMI-1640-HEPES aggiungendo 10 g di polvere RPMI-1640, 66 mg di solfato di gentamicina, 2 g di bicarbonato di sodio, 5,9 g tampone HEPES, 50 mg ipoxantina e 3,8 g di destrosio in 1 L dH sterile ₂ O. Miscelare con tavolo agitatore magnetico fino a quando tutte le dissolve polvere in 1 l di acqua distillata. Eseguire micro filtrazione di media utilizzando 0,22 micron filtro. Conservare il supporto in bottiglie sterili.
2. Lavare non infetti (fresco) di tipo A + eritrociti utilizzando RPMI. Preparare il 5% di ematocrito di eritrociti (0,5 ml di er....

Risultati

Validazione delle proteine ​​ricombinanti espresse attraverso la reattività con anticorpi specifici è un primo passo importante nel confermare il corretto ripiegamento delle proteine ​​espresse. Proteine ​​ricombinanti malariche sono state espresse utilizzando un passo e due fasi in sistemi di espressione libero cellulari umane in vitro. Le proteine ​​ricombinanti sono purificati metodo affinità Ni-chelante. Abbiamo poi utilizzato antisieri contro interi rhoptries merozoite in western blotting di SDS-PAGE proteine ​​ric.......

Discussione

I passi per una proficua espressione di proteine ​​utilizzando due fasi in vitro sistema libera espressione delle cellule umane e di purificazione sono: 1) l'amplificazione di successo e clonazione di geni nelle pT7CFE-Chis plasmide vettore; 2) la trascrizione di RNA a ³⁰ ° C; 3) definizione di proteina a 30 ° C in presenza di inibitore RNAse; 4) lo sviluppo del protocollo di purificazione di affinità based utilizzando perle di resina rivestiti con Ni e 5) analizzare i risultati in Western Blot utilizzand.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di espressione libera di cellule umane in <> in vitro in 2 fasi	Thermo Fisher	88856	Fuori produzione. Conservare sempre a -80 °C. Non scongelare in acqua tiepida
Sistema di traslazione accoppiato a 1 passaggio in vitro	Thermo fischer	88860	Conservare sempre a -80 °C. Non scongelare in acqua calda
Sistema di purificazione ProBond	Invitrogen	K850-01	Conservare presso RT
Resina nichel-chelante Probond	Invitrogen	R801-01	Conservare a 4oC.
A + Negozio di banca	del sangue		del sangue umano a 4 °C.

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