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Biology

Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

Espressione di proteine ​​della malaria nei sistemi basati su celle rimane difficile. Dimostriamo due sistemi di cella di espressione libera di passo e un passo IVT (nella traduzione vitro) per l'espressione di proteine ​​della malaria rhoptry ricombinanti da cellule HeLa. Usiamo un sistema di purificazione a base Ni-resina di affinità per purificare le proteine ​​rhoptry.

Abstract

La malaria causa una significativa morbilità e mortalità globale. Nessun vaccino di routine è attualmente disponibile. Uno dei motivi principali per la mancanza di un vaccino è la sfida di identificare idonei vaccini candidati. Proteine ​​malariche espressi utilizzando sistemi di espressione cellulari basati procariote ed eucariote sono scarsamente glicosilate, generalmente insolubile e sottoposti pieghevole improprio con conseguente riduzione della immunogenicità. I sistemi di espressione libere di germe di grano, reticolociti di coniglio lisato ed Escherichia coli lisato sono attualmente utilizzati per l'espressione di proteine ​​della malaria. Tuttavia, la lunghezza del tempo di espressione e glicosilazione impropria di proteine ​​rimane ancora una sfida. Dimostriamo espressione di proteine ​​Plasmodium in vitro utilizzando sistemi di espressione libera cellulari basato HeLa, denominati "sistemi in vitro di cellule umane libera espressione". I sistemi di espressione cell free basato 2 HeLa trascrivere mRNA in 75 minuti e 3 ml di transcribed mRNA è sufficiente la traduzione proteine ​​in 90 min. Il sistema di espressione 1-passo è una trascrizione e traduzione sistema di espressione accoppiato; la trascrizione e co-traslazione avviene in 3 ore. Il processo può anche essere esteso per 6 ore fornendo energia supplementare. Nel sistema di espressione 2-passo, viene prima mRNA trascritto e quindi aggiunto alla miscela di traduzione per l'espressione della proteina. Descriviamo come esprimere le proteine ​​della malaria; una idrofobica Cleft di PF3D7_0114100 Maurer - 2 transmembrana (PFMC-2TM) di proteine, una proteina PF3D7_0925900 idrofila e un armadillo ripete contenenti proteine ​​PF3D7_1361800, utilizzando il sistema di espressione delle cellule HeLa base. Le proteine ​​sono espresse nelle micro volumi impiegando strategie di espressione 2-step e 1-step. Un metodo di purificazione di affinità per purificare 25 ml di proteine ​​espresse utilizzando il sistema di libera espressione in vitro delle cellule umane è anche descritto. Resa di proteine ​​è determinato mediante saggio di Bradford e l'espressoe proteine ​​purificate possono essere confermati da analisi di western blotting. Proteine ​​ricombinanti espresse possono essere utilizzati per vaccinazioni, test immunologici e proteine ​​sequenziamento.

Introduction

Nella ricerca la malaria, l'espressione delle proteine ​​immunogeniche utilizzano sistemi basati cellula procariote o eucariote rimane una sfida. La ricchezza AT del genoma Plasmodium e sconosciute meccanismi posta traslazionali 14,7, contribuiscono alle difficoltà connesse con l'ottenimento di proteine ​​correttamente giunte e immunogenico per gli studi di produzione di anticorpi e vaccini. Sistemi procariotici quali Escherichia coli sono stati utilizzati per l'espressione della proteina ricombinante. Sistemi procariotiche sono a basso costo, efficace, producono alte rese di proteina ricombinante e hanno più vettori di clonazione. Host E. coli sono facili da trasformare e cellule crescono rapidamente. Tuttavia, i sistemi procarioti hanno delle limitazioni come la mancanza di sostituzione aminoacidica, modificazione post-traslazionale, rischio di contaminazione, prodotti eterogenei e l'accumulo di proteine ​​ricombinanti in corpi di inclusione 24.

In unstudio di Mehlin et al. (2006), sono stati espressi 1000 fotogrammi di lettura aperta (ORF). Circa il 7% delle proteine ​​espresse erano solubile 14. L'insolubilità osservata è dovuta alla natura di parte dei geni e l'alta frequenza di codoni che sono idealmente utilizzato dal Plasmodium AT ricca genoma 14. Una strategia alternativa per superare questo problema è stato sviluppato usando plasmidi o cellule ospiti contenenti tRNA che riconoscono codoni rare o codoni che corrispondono alle frequenze 3. Anche dopo l'esecuzione di queste ottimizzazioni, molto piccole porzioni di proteine ​​sono espresse come solubili, attiva e immunogenico 14. I sistemi di espressione cell-free contengono tutti i componenti necessari per la trascrizione e la traduzione, come ribosomi, fattori di inizio, fattori di allungamento (fattori traduzioni), tRNA e aminoacil-tRNA sintetasi. Entrambe le reazioni di trascrizione e traduzione sono accoppiati in procedimento a passo 11,29. Il transcrireazione ption viene eseguita in un tubo prima quantità appropriata di mRNA viene incubato con macchinari traduzione in un'altra 11,29 tubo. Sebbene questi metodi sono efficaci nel Plasmodium sp. Espressione della proteina, un grave inconveniente è la lunghezza di tempo per l'espressione della proteina, che è di circa 22 ore 29. Inoltre, l'alto costo delle forniture per l'inclusione nei protocolli 29, i preparativi alta intensità di lavoro del lisato cellulare e incongruenze nelle preparazioni dei componenti, rendono questi sistemi irraggiungibile. L'obiettivo principale dei ricercatori per lo sviluppo di un sistema di libera espressione delle cellule dipende da fattori come la modificazione genetica rapida, rese veloci con alte concentrazioni e diritte preparati lisato avanti 1.

Sistemi eucarioti come il lievito, linee cellulari di mammiferi, baculovirus sistema di espressione mediata, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum e sistemi di espressione parassitarie such come Leishmania sono stati utilizzati per l'espressione della proteina ricombinante 7. Sistemi eucarioti condividono relazione filogenetica e quindi condividono anche caratteristiche come la glicosilazione, acilazione, formazione di legami disolfuro, interazione chaperone, proteolisi e compartimentalizzazione sub-cellulare. Proteine ​​eventi secrezione in eucarioti prevengono l'accumulo e diminuisce la tossicità per sistemi di espressione 13. L'uso di sistemi di lievito è preferito come sono adatti per l'espressione di proteine ​​in larga scala e per ottenere alte rese 4. Due P. falciparum proteine ​​PFCP-29 e Pvs25 sono state prodotte utilizzando il sistema di lievito 4. Tuttavia, un grave inconveniente nella sintesi della maggior parte delle proteine ​​era N e O-glicosilazione pattern irregolari, pieghevole improprio e troncamento di proteine ​​dalla loro forma nativa 4.

L'uso di cellule di mammifero per la sintesi delle proteine ​​ricombinanti è laboriosa ed è expenSIVE di mantenere stabili linee cellulari ricombinanti 4. Pertanto, le cellule di mammifero sono stati limitati per l'analisi di proteine ​​di segnalazione, interazioni proteina e interazioni parassita-ospite e anche per testare vaccini DNA 4. Il DNA umano e in vitro sistema privo di cellule mRNA in espressione della proteina qui descritto è un sistema basato su mammiferi HeLa derivato dalle cellule che esprime proteine ​​in 3 ore. Proteine ​​espresse utilizzando pT7CFE1-Chis vettore di espressione hanno un tag C-terminale facilitare l'identificazione e la purificazione. Il sistema basato HeLa è completato con i fattori di inizio della traduzione e un regolatore di traduzione, migliorando così l'efficienza del sistema di traduzione. Le proteine ​​possono essere rapidamente tradotti, vagliati, verificati ed elaborati per l'utilizzo in diverse applicazioni immunologici e strutturali 15.

Sistemi di espressione senza cellule eucariotiche come germe di grano e reticolociti di coniglio sono attualmente utilizzati per l'espressione di varproteine ​​eucariotiche ious compreso Plasmodium proteine ​​11,29. Inoltre, E. sistemi acellulari basate coli sono anche impiegati per l'espressione della proteina eucariotica 11. Tabella 1 riassume diversi sistemi di espressione di cellule libera confrontando caratteristiche dei sistemi, nonché la facilità di utilizzo dei sistemi per l'espressione della proteina. Il sistema privo di cellule umane in confronto agli altri ha la capacità di eseguire postali e co-traslazionale modificazioni ed è meno costoso. Ottimizzazione Codon è possibile e tutte le reazioni possono essere eseguite in 3 ore. Il sistema HeLa è un sistema di traduzione ideale per la sintesi proteica in ambiente di laboratorio.

Uno dei principali vantaggi di sistemi di espressione di cellule umane libera rispetto ad altri sistemi cell free è la disponibilità di diverse linee cellulari derivate da diversi diversi organi e tessuti. Diverse varietà di sistemi liberi di cellule possono essere progettati in funzione della linea cellulare. L'estrattos derivate dalle cellule dei mammiferi hanno una maggiore efficienza di sintetizzare proteine ​​di grandi dimensioni di tutti gli altri sistemi di espressione delle cellule gratuito. Questi sistemi cella libera espressione possono essere utilizzate anche in applicazioni diagnostiche e caratterizzazione di proteine ​​come microarray 30. Le linee popolari cellule HeLa sono più ampiamente utilizzati per effettuare l'espressione di proteine ​​33. Il reticolo endoplasmatico in linee cellulari HeLa è sottosviluppati, portando alla mancanza di attività di modifica glicosilazione post-traduzionale 33. Tuttavia, questo sistema è ritenuto vantaggioso per Plasmodium sintesi proteica come Plasmodium manca anche traduzione modifica glicosilazione alberino 29. La libera protocollo di trascrizione-traduzione cellule HeLa è facile da eseguire, poco costoso e proteine ​​può essere espresso in 90 min, pronta per la purificazione e altre applicazioni a valle.

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Protocol

1. Preparazione di Parasite colture cellulari, Collezione di Parasite Pellet

  1. Preparare supporti RPMI-1640-HEPES aggiungendo 10 g di polvere RPMI-1640, 66 mg di solfato di gentamicina, 2 g di bicarbonato di sodio, 5,9 g tampone HEPES, 50 mg ipoxantina e 3,8 g di destrosio in 1 L dH sterile 2 O. Miscelare con tavolo agitatore magnetico fino a quando tutte le dissolve polvere in 1 l di acqua distillata. Eseguire micro filtrazione di media utilizzando 0,22 micron filtro. Conservare il supporto in bottiglie sterili.
  2. Lavare non infetti (fresco) di tipo A + eritrociti utilizzando RPMI. Preparare il 5% di ematocrito di eritrociti (0,5 ml di eritrociti freschi lavati in 9,5 ml al 10% RPMI siero umano +).
  3. Fai siero 15% umano + RPMI (15 ml di siero umano e 85 ml di RPMI) per avviare la coltivazione di parassiti. Crea siero umano 10% e RPMI (10 ml di siero umano e 90 ml di RPMI) per continuare coltura di parassiti nei globuli rossi.
  4. Cultura P. falciparum (3D7 e FCR-3 ceppi) in tipoA + eritrociti umani a 5% ematocrito e il 20% parassitemia in capsula di Petri o un pallone da 75 centimetri a 3 cultura. Mantenere coltura in vitro secondo il metodo di Trager e Jensen candela vaso 26. In alternativa, mantengono culture sono in incubatore a 37 ° C mantenendo 9,5% di CO 2 e 3,4% N 2 gas. Cultura P. falciparum in RPMI 1640 HEPES multimediale integrato con siero umano 10%.
  5. Sincronizzare P. falciparum cultura aggiungendo 65% Percoll (65 ml di Percoll + 35 ml di RPMI-1640 senza siero umano) alla coltura concentrato 27.
  6. Centrifugare il concentrato di cultura con Percoll a 2500 xg per 5 minuti che si traduce in 3 strati. Con attenzione, utilizzando una pipetta di trasferimento isolare schizonti dal mezzo di trasferimento in un tubo livello separato in condizioni asettiche 27.
  7. Lavare le culture isolate con siero umano 10% + RPMI-1640 due volte per rimuovere l'eccesso di Percoll per centrifugazione a 7500 xg per 5 min. Discard il surnatante ogni volta in condizioni asettiche 27.
  8. Continuare coltura P. sincronizzato schizonti falciparum nel siero umano 10% + RPMI-1640 27.
  9. Raccogliere schizonti trattando Plasmodium eritrociti -infected con 10 mM Tris pH 8.8 e centrifugazione a 15000 xg per 15 minuti 23. Pellets Conservare parassita a -70 ° C dopo l'aggiunta di 5 ml di inibitore della proteasi (aprotinina) al pellet. Utilizzare pellet parassita per l'estrazione di proteine, isolamento DNA genomico e l'isolamento di RNA.

2. Preparazione plasmide vettore

  1. Isolare DNA genomico da P. pellets schizonte falciparum preparate da colture di circa il 20% parassitemia.
  2. Aggiungere 600 ml di 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS e 1 mg / ml proteinasi K, in pellets in una provetta, omogeneizzare pellet usando una siringa da 1 ml collegata ad un ago 26 G. Alternate riempire la siringacon la miscela pellet e svuotamento in una provetta 20 volte. Incubare provetta contenente omogeneizzato O / N in un bagno a 50 ° C Acque.
  3. Eseguire fenolo - cloroformio (P + C) estrazione aggiungendo 600 ml di P + C (300 ml di fenolo e 300 ml di cloroformio) a pellet omogeneizzato. Tubo tappo e agitare la miscela vigorosamente invertendo end-to-end del tubo. Provetta da centrifuga a 14000 xg per 2 minuti e raccogliere soluzione acquosa superiore utilizzando una micropipetta in una nuova provetta. Ripetere questa operazione due volte.
  4. Aggiungere 600 ml di cloroformio per lo strato acquoso nel nuovo tubo dal punto 2.1.2. Agitare la provetta per 10 sec e centrifugare a 14.000 xg per 2 min. Misurare la fase acquosa superiore con una micropipetta e trasferirlo ad una nuova provetta.
  5. Aggiungere 0,1 vol 5 M di sodio acetato pH 5,5 e 1 vol di isopropanolo (se strato acquoso è 300 ml aggiungere 30 ml di 5 M di sodio acetato pH 5.5 + 330 ml di isopropanolo) per laici acquosaer dal punto 2.1.3. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 15 min.
  6. Centrifugare la provetta a 14000 xg per 10 minuti per precipitare pellet di DNA. Eliminare il supernatante e lavare pellet con 100 ml di etanolo al 70% (70 ml di etanolo e 30 ml di dH 2 O) per eliminare il sale in eccesso dal DNA. Conservare il DNA in 50 ml di dH 2 O a -20 ° C.
  7. Progettare avanti e indietro primer utilizzando il software o manualmente per l'amplificazione di P. geni falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 e PF3D7_0114100 precedentemente identificati in studi proteoma 16,18 con opportuni siti di restrizione per permettere la clonazione delle sequenze geniche nelle più siti di clonazione di espressione plasmide pT7CFE1-Chis, come illustrato nella tabella 2.
  8. Fare un 50 microlitri miscela di reazione con l'aggiunta; 5 ml di isolato P. falciparum DNA genomico, 5 ml di 10x tampone, 5μl di MgCl 2, 1,5 ml di primer forward, 1,5 microlitri diprimer reverse, 0,5 ml di DNA polimerasi T7 e 31,5 ml di dH 2 O e effettuare la reazione a catena della polimerasi (PCR) a 94 ° C per 8 min per denaturazione, 50 ° C per 1 minuto e 30 secondi per l'estensione e 72 ° C per 9 min per la ricottura e rinaturazione per amplificare i geni mostrati nella Tabella 1.
  9. I prodotti di PCR separate sulle 1% gel di agarosio (1 g di agarosio e 100 ml di acetato di Tris EDTA (TAE) buffer) 32.
  10. Tagliare le bande di DNA PCR amplificati dal gel di agarosio, disporre le fette di gel contenenti DNA in una colonna di estrazione centrifuga DNA gel e congelare a -20 ° C per 5 min. Aggiungere 100 ml di isopropanolo per le fette di gel ghiacciato e centrifugare a 14.000 xg per 5 min.
  11. Misurare il flusso continuo acquosa filtrato nel tubo di raccolta dal punto 2.5, usando una micropipetta e trasferire in una nuova provetta. Aggiungere 0,1 vol 5 M di acetato di sodio e centrifugare a 14.000 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e aggiungere 10 ml di dH 2 O a the pellet di DNA.
  12. Digerire il vettore di espressione pT7CFE1-Chis e frammenti di DNA purificato (da 2,6) in due tubi separati con l'aggiunta di 3 ml di plasmide e 5 ml di prodotti genici PCR per ogni tubo. Aggiungere a ogni provetta, 1 ml di specifici enzimi di restrizione, 2 ml di tampone di reazione e 14 ml di dH 2 O.
  13. Aggiungere 3 ml di plasmide digerito, 5 ml di frammenti di DNA digerito, 2 ml di 10x tampone ligasi, 1 ml di ligasi e 9 ml di dH 2 O in una provetta. Incubare a 12 ° CO / N.
  14. Aggiungere 0,1 vol di 3 M acetato di sodio, con pH 5,5 e 2 volumi di etanolo (se il volume di tubi legatura è di 20 ml aggiungono 2 ml di acetato di 3 M di sodio + 44 ml di etanolo) per il tubo dal punto 2.14. Mescolare bene e incubare a -20 ° C per 15 min.
  15. Centrifugare la provetta a 14000 xg per 15 min. Rimuovere con attenzione il surnatante con una micro pipetta senza disturbare il pellet.
  16. Aggiungere 100 ml di etanolo al 70% to il pellet dal punto 2.10. Centrifugare la provetta a 14000 xg per 5 min. Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 10 ml di acqua priva di nucleasi per il pellet di DNA.

3. Proteina espressione utilizzando in vitro Cellula umana Free Expression Sistema

  1. Preparare 20 ml di miscela di trascrizione misurando 2 ml di pT7CFE1-Chis plasmide DNA ricombinante, 4 ml di tampone 5x trascrizione, 4 ml di mix NTP, 2 ml di T7 RNA polimerasi e 8 ml di acqua priva di nucleasi per 2-step umana in vitro espressione della proteina utilizzando i modelli di DNA. Mescolare componenti in una provetta e incubare per 75 min a 30 ° C in un bagno d'acqua.
  2. Take 2 microlitri della miscela trascrizione e aggiungerlo a 23 ul di miscela di traduzione contenente 12,5 ml di lisato cellulare HeLa, 2,5 ml di proteine ​​accessorie, 1 ml di soluzione salina A, 0,5 ml di aminoacidi -met, 0,5 ml di aminoacidi -Leu, 181; l di inibitore RNAse, 1,25 ml di mix energetico e 3,75 ml di acqua priva di nucleasi.
  3. Incubare la miscela traduzione da passo 3,2 a 30 ° C per 90 min. Conservare i prodotti tradotti a -20 ° C.
  4. Preparare 25 ml di trascrizione e traduzione miscela con l'aggiunta di 3 ml di pT7CFE1-Chis plasmide DNA ricombinante, 2 ml di acqua priva di nucleasi, 5 ml di mix di reazione, 12,5 ml di HeLa lisato e 2,5 ml di proteine ​​accessorie per 1-step Umana Accoppiato Expression IVT proteine ​​per i modelli di DNA.
  5. Incubare la miscela di reazione proveniente dal passaggio 3.4 per 90 min per 6 ore a 30 ° C. Conservare i prodotti di traduzione a -20 ° C.

4. Purificazione di proteine ​​ricombinanti Espressi

  1. Aggiungere 75 ml di tampone purificazione 1x a 25 ml di prodotto di traduzione di fare 100 ml di miscela di purificazione.
  2. Aggiungere 100 ml di resina nichel chelante a 100 ml di mixt depurazioneUre. Wash Ni-resina per due volte con l'aggiunta di 300 ml di dH 2 O e 300 ml di buffer di legame. Risospendere resina e centrifugare a 14000 g per 1 minuto per rimuovere l'eccesso di etanolo.
  3. Aggiungere 100 ml di miscela di purificazione dal punto 4,2-100 ml di nichel resina chelante e incubare la miscela per 60 minuti a temperatura ambiente.
  4. Centrifugare la miscela a 14000 g per 1 minuto e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo etichettato come "flusso attraverso".
  5. Resina Lavare con 100 ml di tampone di lavaggio 1x (imidazolo 20 mm, 250 mm NaH 2 PO 4 a pH 8, 2.5 M NaCl e DH 2 O). Centrifugare a 14000 g per 1 minuto e raccogliere il surnatante in provetta con l'etichetta "lavare". Ripetere il punto 4.5 due volte.
  6. Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione 1x (imidazolo 100 mM, 250 mM Na 2 PO 4 a pH 8,0, 2,5 M NaCl e dH 2 O) alla resina e incubare per 15 min. Centrifugare a 14000 g per 1 min. Fare il passo eluizione due volte. Ognitempo di raccogliere il surnatante in provette da microcentrifuga fresche e etichetta come "eluito".
  7. Dopo l'eluizione, lavare resina due volte come descritto al punto 4.5. Conservare il flusso attraverso, lava e campioni di eluizione a -20 ° C o inferiore. Resina deve essere conservato a 4 ° C. Utilizzare 30 ml di ogni campione per SDS-PAGE e immunoblotting analisi.

5. Coomassie (Bradford) Protein Assay 34

  1. Preparare le soluzioni di livello di albumina sierica bovina (BSA) con la concentrazione di 20 mg / ml (mescolare 10 ml di BSA (2 mg / ml) e 90 ml di dH 2 O), 40 mg / ml (mescolare 20 ml di BSA (2 mg / ml) e 80 ml ​​di dH 2 O), 60 mg / ml (miscela 30 ml di BSA (2 mg / ml) e 70 ml di dH 2 O), 80 mg / ml (mescolare 40 ml di BSA (2 mg / ml) e 60 ml di dH 2 O), 100 pg / ml (miscela 50 ml di BSA (2 mg / ml) e 50 ml di dH 2 O), 160 mg / ml (mescolare 80 ml ​​di BSA (2 mg / ml) e 20 ml di dH2 O) e 200 pg / ml (100 ml di BSA (2 mg / ml).
  2. Misura 5 ml di flusso attraverso, lava e campioni di eluato dal punto 4.7. Aggiungere 95 ml di dH 2 O.
  3. Aggiungere 5 ml di Coomassie blu reattivo alle miscele di passi 5.1 e 5.2. Coprire le provette con parafilm e vortex per 10 sec poi incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  4. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica (OD) a lunghezza d'onda di 650 nm per i tubi di proteine ​​dal punto 5.3. Concentrazione Plot vs. lettura OD per determinare le concentrazioni di proteine ​​34.

6. Western Blotting

  1. Aggiungere 5 ml di estratti schizonte da P. falciparum, 2 ml di Escherichia coli espresso ricombinanti Rhop-3 proteine ​​31, 5 ml di proteine ​​ricombinanti espresse utilizzando 2-step e 1 fase in sistemi in vitro di espressione umana e 10 ml di prodotti proteina purificata con il metodo affinità per separare i tubi. Aggiungere tampone campione elettroforesi contenente mercaptoetanolo ad ogni provetta per un volume finale di 20 microlitri di rendere campioni di proteine ​​solubilizzate. Far bollire i tubi per 2 minuti.
  2. Caricare campioni di proteine ​​solubilizzate su 10% SDS-PAGE per separare le proteine.
  3. Trasferire proteine ​​separate da SDS-PAGE gel su carta di nitrocellulosa (NCP) per electrophoresing a 35 mA di corrente per il gel in una camera di western blotting semi-secco per 2 ore.
  4. Blocco PCN dopo il trasferimento con il 2% senza grassi del latte.
  5. Incubare bloccato PCN con i seguenti anticorpi policlonali diluiti 1: 100 in 2% di latte per eseguire western blotting; anticorpi di coniglio # 676 21 specifica per P. rhoptries merozoite falciparum, anticorpi murini 20 specifici per P. yoelii e P. berghei rhoptries merozoite, antisieri # 685 specifici per la P. falciparum proteine ​​vacuole parassitoforo, SERA (serina ricca antigene) 22 e gli anticorpi specifici per la Maurer217; s proteina schisi PFMC-2TM 28.
  6. Incubare PCN anche in 1: 100 diluito normali controlli negativi del mouse e siero di coniglio e la cultura trascorso surnatante (SCS) dalle cellule di mieloma SP2.
  7. Incubare PCN con anticorpi e di controllo a 4 ° C O / N.
  8. Lavare PCN 4x con Blot tampone e incubare PCN con specie specifici anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) diluito 1: 1000 in 2% di latte.
  9. Lavare PCN 4x con tampone Blot. Incubare lavato PCN con la soluzione di sviluppo del colore A + B (Soluzione A: aggiungere 50ml di 1x tampone Blot e 30 ml di H 2 O 2; Soluzione B: aggiungere 10 ml di metanolo e 30 mg di 3-cloro-naftolo) per 30 min nel buio. Analizzare i risultati Western Blot colorimetricamente.

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Representative Results

Validazione delle proteine ​​ricombinanti espresse attraverso la reattività con anticorpi specifici è un primo passo importante nel confermare il corretto ripiegamento delle proteine ​​espresse. Proteine ​​ricombinanti malariche sono state espresse utilizzando un passo e due fasi in sistemi di espressione libero cellulari umane in vitro. Le proteine ​​ricombinanti sono purificati metodo affinità Ni-chelante. Abbiamo poi utilizzato antisieri contro interi rhoptries merozoite in western blotting di SDS-PAGE proteine ​​ricombinanti separati.

La figura 1 mostra frammenti di geni PCR amplificati di PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 e PF3D7_1436300 in un gel di agarosio 1%. Bande di DNA sono stati asportati e DNA purificato congelando nel DNA di estrazione Spin Column.

Malaria geni amplificati con successo (indicati nella tabella 2) dal DNA genomico sono stati clonati nel vettore di espressione pT7CFE-Chis. Re-amplificazione dei geni del recoplasmidi mbinant dimostrato la presenza dei frammenti di geni clonati nel vettore. Il diagramma di flusso di sistemi di espressione impiegati per la traduzione della proteina è mostrato in Figura 2. Figure 2A e 2B mostra un passaggio della procedura saggio del 2-passo in vitro sistema di espressione cellula umana e l'IVT accoppiato sistema di traduzione 1-passo. Espressione di successo di proteine ​​di Plasmodium che utilizzano sistemi di espressione libera di cellule umane in vitro è stata confermata da rhoptry antisieri di coniglio specifico. Come illustrato in Figura 3A, le proteine ​​ricombinanti sono state riconosciute dal rhoptry coniglio antisieri specifici # 676. Come indicato in precedenza, espresso proteine ​​ricombinanti non sono stati riconosciuti da antisieri contro proteine ​​vacuolo parassitoforo da P. falciparum e P. yoelii dimostrare la specificità di antisieri di coniglio 676 contro le proteine ​​espresse 32. Siero di coniglio normale (NRS) non ha reagito con proteine ​​ricombinantitradotto con 2-step in vitro sistema espressione umana cella libera e sistema di traduzione 1 fase IVT accoppiata (Figura 3B). L'espressione di successo di proteine ​​ricombinanti Plasmodium è stato confermato da diverse tecniche come In-gel colorazione istidina e nichel-HRP colorazione 32. Proteine ​​espresse sono stati purificati dal sistema di purificazione di affinità. La purificazione avviene in modo LOTTO (senza colonne usate). La tecnica è ottimizzata cambiando la concentrazione di imidazolo da 60 mM a 100 mM. La concentrazione ottimale per eluizione è di 250 mm. Figura 4 mostra successo purificazione di proteine ​​tradotte da 25 ml di prodotti proteici tradotti. La figura 4A mostra successo purificazione della schisi proteina transmembrana di Maurer 18. La figura 4B mostra successo purificazione PF3D7_0925900, P. falciparum ortologo di Plasmodium PY17X_0830000 gene yoelii, unipotetica proteina 32. La figura 4C mostra successo depurazione delle ripetizioni armadillo contenenti proteine ​​PY17X_1139200, una proteina ipotetico utilizzando perle di resina Ni e imidazolo 100 mm tampone di eluizione 1x. La resa di proteina dopo purificazione è 3,5 mg / 25 ml.

Figura 1
Figura 1. Amplificazione di P. falciparum e P. geni yoelii. prodotti di PCR 1% gel mostrando bromuro di etidio macchiati di frammenti di geni di PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 e PFA0680cw amplificati da P. falciparum DNA genomico.

Figura 2
Figura 2. Diagramma di flusso di bas HeLa sistema di libera espressione delle cellule ed. Rappresentazione schematica di due 2-step e 1 fase in sistemi di espressione libera di cellule umane in vitro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Immunoblotting conferma di espressione proteica. Western blot di proteine ​​ricombinanti espresse utilizzando tutta rhoptry di coniglio specifici anti-sieri # 676 e siero di coniglio normale. (A) La reattività di antisieri 676 con proteine ​​ricombinanti espresse. (B) siero di coniglio normale non ha reagito con le proteine ​​ricombinanti espresse. Proteine ​​vacuole parassitoforo non ha reagito con le proteine ​​ricombinanti 32.hres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Purificazione delle proteine ​​da microvolumi di prodotto di traduzione. Purificazione di proteine ​​ricombinanti espresse utilizzando Nickel chelanti metodo resina di affinità. Proteine ​​espresse (traduzione) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, e (C) proteine ​​PY17X_1139200 stati incubati con nichel - resine chelanti sono purificate con nichel resina chelante in assenza di imidazolo in tampone e purificazione tampone di legame. Dopo l'incubazione, perle sono state centrifugate, proteine ​​non legate sono state separate e le perle lavate due volte in tampone di lavaggio. Proteine ​​ricombinanti Bound stati eluiti due volte seguita da lavaggio delle perline. Tradotto proteine, lavaggi, eluati e perlinesono stati solubilizzati in tampone di elettroforesi. Imidazolo è stato utilizzato nel lavaggio (20 mM di imidazolo) ed eluizione (100 mM di imidazolo) buffer. Antisera # 676 riconosciuto con successo espressa e proteine ​​ricombinanti purificate. Siero di coniglio normale non ha reagito con proteine ​​espresse come mostrato in Figura 3B. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

<td> 200 KDa
Caratteristiche Sistema di espressione delle cellule-Free umano Germe di grano cellule del sistema libera espressione Coniglio sistema di espressione dei reticolociti Lisato E.coli sistema di espressione proteica
Tempo Fatto trascrizione e traduzione in 3 ore Trascrizione per 6 ore e traduzione per 10-20 ore Traduzione RNA deve essere isolato prende 90 min Done in 1 ora
Adatto vettore T7 vettore può essere SP6 vettore T7 può essere usato T7 può essere usato
Scala Adatto Adatto per la sintesi di laboratorio Utilizzato per la sintesi proteica larga scala Adatto per studi di laboratorio e di immunizzazione Adatto per studi di laboratorio e di immunizzazione
Estratto Estratti cell free HeLa Embrione di estratti di grano Estratti cellulari reticolociti E. coli estratti lisato cellulare
Modifica Co-traslazionale e modificazioni post traslazionale Post traduzionali Co-traslazionale modifica Modifica post-traslazionale
Dimensioni di proteine ​​tradotto 8 KDa a 250 KDa 220 KDa 250 KDa
Ottimizzazione Codone Stretto Stretto Sciolto Stretto
Disolfuro formazione di legami Sì Sì No Sì
Dare La Precedenza Bassa resa Alto rendimento Basso Rendimento Molto alto rendimento
Costo 130,00 $ per 10 reazioni 173,00 $ per 10 reazioni 136,00 $ per 5 reazioni 159,00 dollari per 8 reazioni
La concentrazione proteica 3 a 5 mg per reazione 100 mg / ml 100 mg / ml 500 mg / ml
Riferimenti 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

Tabella sistemi di espressione libero 1. cellulari in ricerca malarica. Confronto di cellasistemi di espressione libero attualmente utilizzati nella ricerca malarica.

Gene ID Ortologo ID Proteina Sequenza Primer per PCR
PF3D7_1436300 Componente translocon CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 Proteine ​​schisi del PFMC-2TM Maurer GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 Proteine ​​Ipotetico GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 Proteine ​​Ipotetico GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

Tabella 2. geni Rhoptry allo studio. Primer di diversi geni espressi in questo studio 19.

Nome del Materiale Azienda Numero di catalogo Descrizione
2-step in cellule umane in vitro sistema di espressione free 32 Thermo Fisher 88.856 Non più. Conservare sempre a -80 ° C. Non scongelare in acqua calda.
1 fase in vitro accoppiata sistema di traduzione Thermo Fisher 88.860 Conservare sempre a -80 ° C. Non thaw in acqua calda.

Sistemi Tabella 3. Hela cellulari basato libera espressione. Kit utilizzate per l'espressione di proteine.

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Discussion

I passi per una proficua espressione di proteine ​​utilizzando due fasi in vitro sistema libera espressione delle cellule umane e di purificazione sono: 1) l'amplificazione di successo e clonazione di geni nelle pT7CFE-Chis plasmide vettore; 2) la trascrizione di RNA a 30 ° C; 3) definizione di proteina a 30 ° C in presenza di inibitore RNAse; 4) lo sviluppo del protocollo di purificazione di affinità based utilizzando perle di resina rivestiti con Ni e 5) analizzare i risultati in Western Blot utilizzando anticorpi policlonali e monoclonali. I passi per una proficua espressione di proteine ​​utilizzando uno IVT passo sistema di traduzione accoppiato proteine ​​sono: 1) l'amplificazione di successo e clonazione di geni nelle pT7CFE-Chis plasmide vettore; 2) trascrizione e traduzione di proteine ​​a 30 ° C; 3) lo sviluppo del protocollo di purificazione di affinità based utilizzando perle di resina rivestiti con Ni e 4) analizzare i risultati in Western Blot utilizzando anticorpi policlonali e monoclonali.

Correntely, sistemi di espressione cell free sono usati per esprimere le proteine ​​ricombinanti malariche. Le caratteristiche fondamentali dei sistemi di cellule libera espressione per esprimere le proteine ​​della malaria è la capacità di decodificare i geni ricchi, una mancanza di lunga pausa traslazionale, di successo espressione di sequenze di amminoacidi ripetute, mancanza di meccanismi di glicosilazione e la capacità di plasmidi di controllare gene troncamento. In questo studio, dimostriamo l'uso di un due fasi in vitro sistema libera espressione delle cellule umane 32 e un one-step sistemi di traduzione IVT accoppiato a manifestare P. ortologhi di geni di P. falciparum yoelii geni merozoite rhoptry come indicato nella tabella 1. Un protocollo di purificazione è stato sviluppato e ottimizzato per la purificazione di micro-volumi di proteine ​​ricombinanti ottenuti da 1-step e 2-step in sistemi di espressione libero cellulari umane in vitro. 4 P. geni falciparum, PF3D7_0114100 una proteina idrofobica transmembrana, un'ipotetica ripetizione ARM previstoproteine ​​PF3D7_1361800 e una proteina idrofila PF3D7_0925900, sono stati espressi con un 2-step e 1 fase in vitro sistema libera espressione delle cellule umane. Rendimenti proteina purificata sono stati determinati. La proteina PFMC-2TM è stato incluso in questi studi, perché è una proteina integrale di membrana con due domini transmembrana ed eravamo interessati a determinare se il sistema di espressione in vitro poteva esprimere correttamente la proteina transmembrana e consentire facilità di purificazione.

La differenza fondamentale in entrambi i sistemi di espressione di un passo e due fasi è che il sistema di espressione in due fasi è un sistema dipende mRNA, dove un mRNA stabile viene trascritto e aggiunto alla reazione di traduzione. Al contrario, l'un passo in vitro accoppiato trascrizione / sistema di traduzione comporta una trascrizione continuo e la fornitura di mRNA seguita dalla co-traduzione della proteina durante la reazione. Sia 1-step IVT trascrizione / traduzione accoppiato eSistema xpression e 2-step in vitro sistema cellulare di espressione umana sono stati testati per l'espressione di proteine ​​ad alto peso molecolare. Entrambi i sistemi sono riusciti a esprimere peso molecolare proteine ​​ricombinanti bassi. Nel sistema di espressione 1-passo, è stata osservata reattività crociata con anticorpi proteine ​​nella miscela di reazione di traduzione. Le proteine ​​specifiche attraversare reagiscono con gli anticorpi sono sconosciute e necessitano di ulteriori indagini. L'espressione di proteine ​​ad alto peso molecolare non ha avuto successo utilizzando sia la 1 fase e sistemi 2-step. Un protocollo di purificazione 'stato sviluppato per microvolumi purificazione di proteine ​​ricombinanti di diverse proprietà di solubilità espresse utilizzando sia 1-step e 2-step in sistemi di espressione libero cellulari umane in vitro. Le proteine ​​sono state con successo purificato e il rendimento ottenuto è stato 3.5 mg per 25 microlitri se espresso con 2-step in sistema di traduzione delle proteine ​​in vitro e 1,5 g per 25 microlitri se tradotto con la 1 fase ISistema di espressione della proteina VT. Espressione di proteine ​​a basso peso molecolare che varia da 18 kDa a 37 kDa è riproducibile e diretto. Tuttavia, espressione ad alto peso molecolare si traduce in troncamenti proteine. A causa delle microvolumi ottenuti per DNA clonato, amplificazione PCR è stato utilizzato per verificare prodotti clonati. Ostacoli potenziali per esprimere proteine ​​ad alto peso molecolare che utilizzano sistemi di espressione cell free potrebbe essere costante fosforilazione di eIF2 subunità alfa a causa dell'alta concentrazione di ATP nella reazione. Ciò nuoce inizio della traduzione nel sistema che interessa potenzialmente l'allungamento della sintesi proteica durante la sintesi di proteine ​​di grandi dimensioni in sistemi cellulari di espressione libera 10.

Il protocollo qui descritto non è influenzato dalle condizioni di ottimizzazione per l'espressione delle proteine. Né i codoni gene né il plasmide sono state ottimizzate per l'espressione delle proteine, e proteine ​​ripiegamento non era necessaria. Questo sistema esprime proteins in 3 ore e la purificazione della proteina possono essere ottenuti in 2 ore, consentendo altre applicazioni a valle come l'elaborazione della proteina ricombinante per vaccinazioni o peptide sequenziamento. Proteine ​​ricombinanti multipli possono essere espressi con il sistema libero cellule HeLa, utilizzando formati di microarray per lo screening sieri immuni e l'identificazione di potenziali molecole candidato vaccino. Inoltre, le proteine ​​potenzialmente immunogenico possono essere identificati attraverso schermi e proteine ​​ottenute da scaling up espressione selezionati.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

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Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

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