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Biology

Systèmes cellules HeLa base de la libre expression pour l'expression des Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

L'expression des protéines paludisme dans les systèmes à base de cellules reste difficile. Nous démontrons deux systèmes cellule libre expression étape et une IVT de l'étape (la traduction in vitro) pour exprimer des protéines recombinantes de rhoptries paludisme à partir de cellules HeLa. On utilise un système de purification par affinité à base de résine Ni-à purifier les protéines de rhoptries.

Abstract

Le paludisme entraîne une morbidité et une mortalité importantes mondiale. Aucun vaccin de routine est actuellement disponible. Une des principales raisons de l'absence d'un vaccin est le défi d'identifier des candidats vaccins appropriés. Protéines paludéennes exprimés en utilisant des systèmes d'expression à base de cellules procaryotes et eucaryotes sont mal glycosylés, généralement insolubles et subissent pliage impropre menant à immunogénicité réduite. Les systèmes d'expression exempt de germes de blé, de reticulocytes de lapin et Escherichia coli lysat cellulaire de lysat sont actuellement utilisés pour l'expression de protéines paludiques. Toutefois, la durée de temps d'expression et inappropriée glycosylation des protéines reste un défi. Nous démontrons l'expression de protéines de Plasmodium in vitro en utilisant des systèmes de la libre expression de cellules HeLa base, appelées "cellules sans systèmes d'expression in vitro humains». Les systèmes d'expression de cellules HeLa 2 basé libres transcrire l'ARNm en 75 min et 3 ul de transcribed ARNm est suffisante pour traduire des protéines en 90 min. Le système d'expression est une étape de transcription et une traduction couplé système d'expression; la transcription et la traduction co-produit dans 3 heures. Le processus peut également être prolongé pour 6 heures en fournissant une énergie supplémentaire. Dans le système d'expression en 2 étapes, l'ARNm est transcrit premier et ensuite ajouté au mélange de traduction de l'expression des protéines. Nous décrivons comment exprimer des protéines de paludisme; hydrophobe Fente de PF3D7_0114100 Maurer - 2 transmembranaire (GCFP-2TM) protéine, une protéine de PF3D7_0925900 hydrophile et une répétition de tatou contenant des protéines PF3D7_1361800, en utilisant le système de la libre expression dans des cellules HeLa base. Les protéines sont exprimées dans des micro volumes utilisant des stratégies d'expression en 2 étapes et 1-étape. Procédé de purification par affinité pour purifier 25 ul de protéines exprimées à l'aide du système cellulaire humaine libre d'expression in vitro est également décrit. le rendement en protéines est déterminée par le test de Bradford et l'a expriméet des protéines purifiées peuvent être confirmés par une analyse Western blot. Protéines recombinantes exprimées peuvent être utilisées pour des analyses immunologiques et des vaccinations, le séquençage de protéines.

Introduction

Dans la recherche du paludisme, l'expression de protéines immunogènes en utilisant des systèmes à base cellulaires procaryotes ou eucaryotes reste un défi. L'AT richesse du génome de Plasmodium et les mécanismes post-traductionnelles inconnus 14,7, contribuent aux difficultés liées à l'obtention des protéines correctement repliées et immunogènes pour les études de production d'anticorps et de vaccins. Des systèmes procaryotes tels que Escherichia coli ont été utilisés pour l'expression de protéines recombinantes. Systèmes procaryotes sont à faible coût, efficaces, produisent des rendements élevés de protéine recombinante et disposer de plusieurs vecteurs de clonage. Hôte E. coli cellules sont faciles à transformer et les cellules croissent rapidement. Cependant, les systèmes procaryotes ont des limitations telles que le manque de substitution d'acides aminés, la modification post-traductionnelle, le risque de contamination, les produits hétérogènes et l'accumulation de protéines recombinantes à l'intérieur des corps d'inclusion 24.

Dans unétude de Mehlin et al. (2006), 1000 cadres de lecture ouverts (ORF) ont été exprimés. Environ 7% des protéines exprimées étaient solubles 14. L'insolubilité est observée en raison de la nature polarisée de gènes et la haute fréquence de codons qui sont utilisés de préférence par le Plasmodium riche en AT 14 génome. Une autre stratégie pour surmonter ce problème a été mis au point en utilisant des plasmides ou des cellules hôtes contenant les ARNt qui reconnaissent les codons ou des codons qui correspondent aux fréquences 3 rares. Même après l'exécution de ces optimisations, de très petites portions de protéines sont exprimées comme soluble, active et immunogène 14. Les systèmes d'expression sans cellules contiennent tous les composants nécessaires pour la transcription et la traduction tels que les ribosomes, les facteurs d'initiation, les facteurs d'allongement (traductions facteurs), et ARNt aminoacyl-ARNt synthétases. Les deux réactions de transcription et de traduction sont couplées en une étape procédure 11,29. Le transcriréaction d'ption est effectuée dans un tube avant quantité appropriée d'ARNm est incubée avec de la machinerie de traduction dans un tube différent 11,29. Bien que ces méthodes sont efficaces dans Plasmodium sp. Expression de la protéine, un inconvénient majeur est la longueur de temps pour l'expression de la protéine, ce qui est environ 22 h 29. En outre, le coût élevé des fournitures pour l'inclusion dans les protocoles 29, les préparatifs de la main-d'œuvre du lysat cellulaire et des incohérences dans les préparations de composants, de rendre ces systèmes inaccessible. L'objectif principal de chercheurs pour le développement d'un système d'expression sans cellule dépend de facteurs tels que la modification génétique rapide, les rendements rapides avec des concentrations élevées et droites préparations de lysat à terme 1.

Les systèmes eucaryotes tels que les levures, les lignées cellulaires de mammifères, de baculovirus système d'expression à médiation par, Tetrahymena thermophilie, Dictyostelium discoideum et des systèmes d'expression parasites such comme Leishmania ont été utilisées pour l'expression de protéines recombinantes 7. Les systèmes eucaryotes part relation phylogénétique et donc part également des caractéristiques telles que la glycosylation, l'acylation, la formation de liaison disulfure, une interaction chaperonne, la protéolyse et sous-compartimentalisation cellulaire. Protéines événements de sécrétion chez les eucaryotes empêchent l'accumulation et diminue la toxicité pour les systèmes d'expression 13. L'utilisation de systèmes de levure est préféré comme ils sont indiqués pour l'expression de protéines à grande échelle et pour obtenir des rendements élevés 4. Deux P. protéines falciparum PFCP-29 et Pvs25 ont été produits en utilisant le système de levure 4. Cependant, un inconvénient majeur dans la synthèse de la plupart des protéines était motifs irréguliers N et O-glycosylation, pliage impropre et la troncature des protéines à partir de leur forme native 4.

L'utilisation de cellules de mammifères pour la synthèse de protéines recombinantes est laborieux et il est expensive pour maintenir des lignées de cellules recombinantes stables 4. Par conséquent, les cellules de mammifères ont été limitées pour l'analyse de la signalisation de protéine, les interactions entre protéines et d'interactions hôte-parasite et également pour tester des vaccins à ADN 4. L'ADN et l'ARNm humain vitro système exempt de cellules d'expression de protéine décrite ici est dans un système à base de mammifère dérivé des cellules HeLa qui exprime des protéines dans 3 heures. Protéines exprimées en utilisant le vecteur d'expression pT7CFE1-CHIS ont une étiquette de C-terminal de faciliter l'identification et la purification. Le système basé sur des cellules HeLa est complétée avec des facteurs d'initiation de traduction et un régulateur de traduction, ce qui améliore l'efficacité du système de traduction. Les protéines peuvent être rapidement traduits, sélectionnés, vérifiés et traités pour une utilisation dans diverses applications immunologiques et structurelles 15.

Des systèmes d'expression eucaryotes acellulaires tels que le germe de blé et de reticulocytes de lapin sont actuellement utilisés pour l'expression de varprotéines eucaryotes dif- y compris les protéines de Plasmodium 11,29. En outre, E. des systèmes exempts de cellules sur la base coli sont également employés pour l'expression des protéines eucaryotes 11. Le tableau 1 résume les différents systèmes d'expression de cellules libres en comparant les caractéristiques des systèmes, ainsi que la facilité d'utilisation des systèmes pour l'expression des protéines. Le système exempt de cellules humaines par rapport aux autres a la capacité d'effectuer et soumettre co-traductionnelle modifications et est moins coûteux. L'optimisation des codons est possible et l'ensemble des réactions peut être effectuée en 3 heures. Le système HeLa est un système de traduction idéal pour la synthèse des protéines dans le laboratoire.

Un avantage majeur de connexion des systèmes d'expression cellulaires humaines par rapport aux autres systèmes acellulaires est la disponibilité de plusieurs lignées cellulaires différentes provenant de différents organes et tissus. Plusieurs variétés de systèmes exempts de cellules peuvent être conçues en fonction de la lignée cellulaire. L'extraits dérivés de cellules de mammifère ont un rendement plus élevé pour synthétiser de grandes protéines que les autres systèmes d'expression de cellules libres. Ces systèmes d'expression de cellule libre peuvent également être utilisés dans des applications de diagnostic et de caractérisation des protéines telles que 30 microréseaux. Les lignes de cellules HeLa populaires sont les plus largement utilisés pour réaliser l'expression de protéines 33. Le réticulum endoplasmique dans les lignées cellulaires HeLa est peu développé, d'où l'absence de glycosylation post-traductionnelle 33 activité de modification. Cependant, ce système est considéré comme étant avantageux pour la synthèse des protéines de Plasmodium comme Plasmodium manque également de glycosylation après modification de traduction 29. La connexion de protocole de transcription-traduction cellule HeLa est facile à réaliser, peu coûteux et de protéines peut être exprimée en 90 min, prêt pour la purification et d'autres applications en aval.

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Protocol

1. Préparation des parasites des cultures cellulaires, Collection de Parasite Pellets

  1. Préparer un milieu RPMI-1640-HEPES en ajoutant 10 g de poudre de milieu RPMI-1640, 66 mg de sulfate de gentamycine, 2 g de bicarbonate de sodium, un tampon de HEPES 5,9 g, 50 mg d'hypoxanthine et 3,8 g de dextrose dans 1 L stérile dH 2 O. Mélanger à l'aide tableau agitateur magnétique jusqu'à ce que tous les poudre se dissout dans l'eau distillée 1 L. Effectuer micro filtration de milieux utilisant filtre de 0,22 um. Rangez les médias dans des flacons stériles.
  2. Lavez non infectés (frais) de type A + érythrocytes utilisant RPMI. Préparer 5% d'hématocrite des érythrocytes (0,5 ml de globules rouges frais lavés dans 9,5 ml 10% RPMI + sérum humain).
  3. Faire 15% de sérum humain + RPMI (15 ml de sérum humain et 85 ml de RPMI) pour initier la culture des parasites. Faire 10% de sérum humain et du milieu RPMI (10 ml de sérum humain et 90 ml de RPMI) à poursuivre la culture des parasites dans les globules rouges.
  4. Culture P. falciparum (3D7 et FCR-3 souches) dans le typeA + érythrocytes humains à 5% d'hématocrite et 20% de parasitémie en boîte de Pétri ou un flacon de culture de 75 cm 3. Maintenir la culture in vitro selon la méthode de Trager et Jensen bougie pot 26. Alternativement, maintenir les cultures sont dans un incubateur à 37 ° C en maintenant 9,5% de CO 2 et de 3,4% du gaz N2. Culture P. falciparum dans du RPMI 1640-HEPES milieu supplémenté avec 10% de sérum humain.
  5. Synchroniser P. culture falciparum en ajoutant 65% percoll (65 ml de percoll + 35 ml de RPMI-1640 sans sérum humain) à la culture concentrer 27.
  6. Centrifuger le concentré de culture avec percoll à 2500 g pendant 5 min, ce qui résulte en 3 couches. Soigneusement, en utilisant une pipette de transfert isoler schizontes du transfert de couche intermédiaire dans un tube séparé dans des conditions aseptiques 27.
  7. Laver les cultures isolées avec 10% de sérum humain + RPMI-1640 à deux reprises pour enlever l'excès de percoll par centrifugation à 7500 g pendant 5 min. DiSCard le surnageant à chaque fois dans des conditions aseptiques 27.
  8. Continuer la culture de la P. synchronisée schizontes falciparum dans 10% de sérum humain RPMI-1640 + 27.
  9. Recueillir schizontes en traitant Plasmodium érythrocytes infectés par avec 10 mM Tris pH 8,8 et centrifugation à 15000 g pendant 15 min 23. Granulés parasites de magasin à -70 ° C après addition de 5 ul d'inhibiteur de protéase (aprotinine) pour les pastilles. Utilisation des granulés de parasites pour l'extraction des protéines, l'isolement d'ADN génomique et l'isolement de l'ARN.

2. Préparation de vecteur plasmidique

  1. Isoler l'ADN génomique de P. Granulés schizontes falciparum préparés à partir de cultures d'environ 20% de parasitémie.
  2. Ajouter 600 ul de 10 mM de Tris-HCl de pH 7,6, 50 mM d'EDTA pH 8,0, 0,1% de SDS et 1 mg / ml de proteinase K, de pastilles dans un tube de microcentrifugeuse, homogénéiser pastille en utilisant une seringue de 1 ml fixée à une aiguille 26 G. Autre remplissage de la seringueavec le mélange de granulés et de vidange dans un tube de microcentrifugeuse 20 fois. Incuber tube contenant homogénat O / N dans un bain-marie à 50 °.
  3. Effectuer phénol - chloroforme (P + C) l'extraction en ajoutant 600 pl de P + C (300 pi de phénol et 300 pi de chloroforme) pour culot homogénéisé. Cap le tube hermétiquement et agitez vigoureusement le mélange en inversant le tube fin à la fin. Tube à centrifuger à 14000 g pendant 2 min et recueillir solution aqueuse supérieure à l'aide d'une micropipette dans un nouveau tube. Répéter deux fois cette étape.
  4. Ajouter 600 ul de chloroforme à la phase aqueuse dans le nouveau tube à partir de l'étape 2.1.2. Vortex le tube pendant 10 secondes et centrifuger à 14 000 g pendant 2 min. Mesurer la couche aqueuse supérieure avec une micropipette et le transférer à un nouveau tube.
  5. Ajouter 0,1 volume d'acétate de sodium 5 M pH 5,5 et 1 vol de l'isopropanol (si la couche aqueuse est de 300 pi ajouter 30 ul d'acétate de sodium 5 M pH 5,5 + 330 pl de l'isopropanol) à laïque aqueuseer de l'étape 2.1.3. Incuber le tube à température ambiante pendant 15 min.
  6. Centrifuger le tube à 14 000 g pendant 10 min pour précipiter l'ADN culot. Jeter le surnageant et laver culot avec 100 pi d'éthanol à 70% (70 pi d'éthanol et 30 pi de dH 2 O) pour éliminer l'excès de sel à partir de l'ADN. ADN de magasin dans 50 pi de dH 2 O à -20 ° C.
  7. Concevoir amorces directe et inverse en utilisant un logiciel ou manuellement pour l'amplification de P. PF3D7_1361800 gènes falciparum, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 et PF3D7_0114100 précédemment identifiées dans les études protéomiques 16,18 avec des sites de restriction appropriés pour permettre le clonage des séquences de gènes dans les multiples sites de clonage du plasmide d'expression pT7CFE1-CHIS, comme indiqué dans le tableau 2.
  8. Ajouter un mélange réactionnel de 50 ul en ajoutant; 5 pi de isolé P. ADN génomique falciparum, 5 pi de tampon 10x, 5 ul de MgCl2, 1,5 pl de amorce avant, 1,5 pi deamorce inverse, 0,5 ul de l'ADN polymerase T7 et 31,5 ul de dH 2 O et d'effectuer la réaction en chaîne par polymerase (PCR) à 94 ° C pendant 8 min pour la dénaturation, 50 ° C pendant 1 min 30 sec d'extension à 72 ° C pendant 9 min pour le recuit et renaturation pour amplifier des gènes présentés dans le tableau 1.
  9. Les produits de PCR séparés sur gel d'agarose à 1% (1 g d'agarose et 100 ml de Tris acétate EDTA (TAE) tampon) 32.
  10. Couper les bandes d'ADN amplifiés par PCR à partir du gel d'agarose, placer les tranches de gel contenant de l'ADN dans une colonne d'extraction de filage de gel d'ADN et congeler à -20 ° C pendant 5 min. Ajouter 100 ul d'isopropanol pour les tranches de gel congelés et centrifuger à 14 000 xg pendant 5 min.
  11. Mesurer l'écoulement aqueux filtré dans le tube de collecte de l'étape 2.5, en utilisant une micro-pipette et transférer dans un nouveau tube. Ajouter 0,1 volume de 5 M d'acétate de sodium et centrifuger à 14 000 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 10 ul de dH 2 O THe culot d'ADN.
  12. Digérer le vecteur d'expression pT7CFE1-CHIS et des fragments d'ADN purifié de (2,6) dans deux tubes séparés en ajoutant 3 ul de plasmide et 5 pi de produits de gènes de PCR à chaque tube. Ajouter à chaque tube, une pi d'enzymes de restriction spécifiques, 2 ul de tampon de réaction et 14 ul de dH 2 O.
  13. Ajouter 3 ul de plasmide digéré, 5 ul de fragments d'ADN digérés, 2 ul de tampon ligase 10X, 1 ul de ligase et 9 pl de dH 2 O dans un tube de microcentrifugation. Incuber à 12 ° CO / N.
  14. Ajouter 0,1 volume de 3 M d'acétate de sodium à pH 5,5 et 2 volumes d'éthanol (si le volume des tubes de ligature est 20 ul ajouter 2 ul de 3 M d'acétate de sodium + 44 ul d'éthanol) pour le tube de l'étape 2.14. Bien mélanger et incuber à 20 ° C pendant 15 min.
  15. Centrifuger le tube à 14 000 g pendant 15 min. Retirer délicatement le surnageant en utilisant un micro pipette sans perturber le culot.
  16. Ajouter 100 pi de 70% d'éthanol to le culot provenant de l'étape 2.10. Centrifuger le tube à 14 000 g pendant 5 min. Retirer et jeter le surnageant. Ajouter 10 ul d'eau exempte de nuclease à la pastille d'ADN.

3. Utilisation de l'expression des protéines dans la cellule humaine Expression System gratuit Vitro

  1. Préparer 20 pi de mélange de transcription en mesurant 2 pi de la pT7CFE1 CHIS à ADN recombiné plasmide, 4 pi de tampon 5x de transcription, 4 pi de NTP mélange, 2 pl de la T7 RNA Polymerase et 8 ld'eau exempte de nucléase pour 2 étapes humain in vitro Protein Expression en utilisant des modèles d'ADN. Mélanger les composants dans un tube de microcentrifugation et incuber pendant 75 min à 30 ° C dans un bain d'eau.
  2. Prendre 2 pi du mélange de transcription et l'ajouter à 23 pl de mélange de traduction contenant 12,5 pi de lysat de cellules HeLa, 2,5 ul de protéines accessoires, 1 ul de solution de sel A, 0,5 ul d'acides aminés -Met, 0,5 ul d'acides aminés Leu, 181; l d'inhibiteur de RNase, 1,25 ul de mix énergétique et 3,75 ld'eau exempte de nucléase.
  3. Incuber le mélange de traduction de l'étape 3.2 à 30 ° C pendant 90 min. Magasin produits traduits à -20 ° C.
  4. Préparer 25 pi de la transcription et de mélange de traduction en ajoutant 3 pi de la pT7CFE1 Chis-ADN recombinant plasmidique, 2 ul d'eau sans nucléase, 5 pi de mélange réactionnel, 12,5 pi de HeLa lysat et 2,5 pi de protéines accessoires pour 1 étape Couplé Human Expression IVT de protéines pour des matrices d'ADN.
  5. Incuber le mélange réactionnel de l'étape 3.4 pendant 90 min à 6 h à 30 ° C. Stockez les produits de traduction à -20 ° C.

4. Purification de protéines recombinantes exprimées

  1. Ajouter 75 ul de tampon de purification 1x à 25 pl de produit de traduction de 100 ul de rendre mélange de purification.
  2. Ajouter 100 ul de résine de chelation de nickel pour 100 ul de mixte de purificationure. Lavage de la résine Ni-deux fois en ajoutant 300 ul de dH 2 O et 300 pi de tampon de liaison. Re-suspendre la résine et centrifuger à 14 000 g pendant 1 min pour éliminer l'excès d'éthanol.
  3. Ajouter 100 ul de mélange provenant de l'étape de purification de 4,2 à 100 ul de résine de chelation de nickel et incuber le mélange pendant 60 min à température ambiante.
  4. Centrifuger le mélange à 14 000 g pendant 1 min et de recueillir surnageant dans un nouveau tube étiqueté comme «circuler à travers".
  5. Laver la résine avec 100 ul de tampon de lavage 1 x (20 mM d'imidazole, mM de NaH 2 PO 4 à pH 8, NaCl 2,5 M et dH 2 O 250). Centrifuger à 14 000 g pendant 1 min et de recueillir surnageant dans un tube frais étiqueté "lavage". Répétez l'étape deux fois 4.5.
  6. Ajouter 100 ul de 1 x tampon d'élution (100 mM d'imidazole, 250 mM de Na 2 PO 4 à pH 8,0, 2,5 M de NaCl et dH 2 O) à la résine et incubation pendant 15 min. Centrifuger à 14 000 g pendant 1 min. Faire deux fois l'étape d'élution. Chaquetemps ramasser le surnageant dans des tubes de microcentrifugation frais et que l'étiquette «éluat».
  7. Après élution, laver la résine deux fois comme décrit dans l'étape 4.5. Magasin couler à travers, lavages et des échantillons d'élution à -20 ° C ou moins. Résine doit être stockée à 4 ° C. Utiliser 30 ul de chaque échantillon pour SDS-PAGE et analyse d'immunotransfert.

5. Coomassie (Bradford) 34 Protein Assay

  1. Préparer des solutions d'albumine de sérum bovin norme (BSA) avec la concentration 20 pg / ml (mélanger 10 ul de BSA (2 mg / ml) et 90 ul de dH 2 O), 40 ug / ml (mélanger 20 ul de BSA (2 mg / ml) et 80 ul de dH 2 O), 60 ug / ml (mélange 30 ul de BSA (2 mg / ml) et 70 ul de dH 2 O), 80 ug / ml (mélanger 40 ul de BSA (2 mg / ml) et 60 ul de dH 2 O), 100 ug / ml (mélange 50 ul de BSA (2 mg / ml) et 50 ul de dH 2 O), 160 ug / ml (mélanger 80 ul de BSA (2 mg / ml) et 20 ul de dH2 O) et 200 ug / ml (100 ul de BSA (2 mg / ml).
  2. Mesure 5 pi de l'écoulement à travers, lavages et des échantillons d'élution de l'étape 4.7. Ajouter 95 pi de dH 2 O.
  3. Ajouter 5 ml de Coomassie réactif bleu pour les mélanges des étapes 5.1 et 5.2. Couvrez les tubes avec du parafilm et vortex pendant 10 secondes puis incuber pendant 20 min à température ambiante.
  4. En utilisant un spectrophotomètre, mesurer la densité optique (DO) à une longueur d'onde de 650 nm pour les tubes de protéines provenant de l'étape 5.3. la concentration de la parcelle contre OD lecture pour déterminer les concentrations de protéines 34.

6. Western Blot

  1. Ajouter 5 ul d'extraits de schizontes de P. falciparum, 2 ul d'Escherichia coli exprime rhOP-3 protéines recombinantes 31, 5 ul de protéines recombinantes exprimées selon deux étapes et une étape dans des systèmes in vitro d'expression humains et 10 pi de produits de la protéine purifiée en utilisant la méthode d'affinité pour séparer les tubes. Ajouter du tampon d'échantillon d'électrophorèse contenant du mercaptoéthanol à chaque tube pour un volume final de 20 ul à faire des échantillons de protéines solubilisées. Faire bouillir tubes pendant 2 min.
  2. Charger échantillons de protéines solubilisées sur 10% de gels de SDS-PAGE pour séparer les protéines.
  3. Transfert protéines séparées de gels de SDS-PAGE à papier de nitrocellulose (NCP) par électrophorèse à 35 mA par gel dans une chambre western blot semi-sèche pendant 2 heures.
  4. Bloquer les PCN après le transfert de 2% de lait écrémé.
  5. Incuber bloqué PCN avec les anticorps polyclonaux suivants dilué 1: 100 dans 2% de lait d'effectuer un transfert de Western; anticorps de lapin # 676 21 spécifique de P. rhoptries mérozoïtes falciparum, des anticorps de souris 20 spécifiques pour P. yoelii et P. berghei rhoptries mérozoïtes, antisérums # 685 spécifiques pour le P. falciparum protéines vacuole parasitophore, SERA (sérine riche antigène) 22 et des anticorps spécifiques de l'Maurer217; protéines fente s GCFP-2TM 28.
  6. Incuber PCN également en 1: 100 souris et de sérum de lapin et un surnageant de culture usé (SCS) à partir de cellules de myélome SP2 contrôles négatifs normales dilué.
  7. Incuber PCN avec des anticorps et des contrôles à 4 ºC O / N.
  8. Laver PCN 4x avec Blot tampon et incuber PCN avec des espèces anticorps secondaires spécifiques conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) diluée à 1: 1000 dans le lait 2%.
  9. Laver PCN 4x avec un tampon Blot. Incuber lavé PCN avec la solution de développement de couleur A + B (solution A: ajouter 50 ml de 1 x Blot tampon et 30 ul de H 2 O 2; Solution B: ajouter 10 ml de methanol et 30 mg de 3-chloro-naphtol) pour 30 min dans l'obscurité. Analyser les résultats de Western blot colorimétrie.

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Representative Results

Validation des protéines recombinantes exprimées par la réactivité avec des anticorps spécifiques est une première étape importante en confirmant le bon pliage des protéines exprimées. Protéines recombinantes paludisme ont été exprimées à l'aide d'une étape et en deux étapes dans des systèmes in vitro de la libre expression de cellules humaines. Les protéines recombinantes sont méthode d'affinité Ni-chélateur purifié. Nous avons ensuite utilisé des antiserums contre rhoptries mérozoïtes entiers dans western blot de protéines recombinantes séparés SDS-PAGE.

La figure 1 montre des fragments de gènes amplifiés par PCR de PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 et PF3D7_1436300 dans un gel d'agarose à 1%. Les bandes d'ADN ont été excisées et purifiées par l'ADN dans le gel extraction ADN Spin Column.

gènes du paludisme amplifiés avec succès (indiquées dans le tableau 2) à partir d'ADN génomique ont été clonées dans le vecteur d'expression pT7CFE-CHIS. Re-amplification des gènes de la recombinant plasmides ont démontré la présence des fragments de gènes clonés dans le vecteur. L'organigramme de systèmes d'expression utilisés pour la traduction de la protéine est représentée sur la Figure 2. Les figures 2A et 2B représente un sage procédure de l'étape de la 2-étape in vitro système d'expression de droits sur les cellules et le système de traduction IVT couplée une étape. L'expression réussie de protéines de Plasmodium utilisant des systèmes de la libre expression de cellules humaines in vitro a été confirmée par rhoptries spécifique antisérums de lapin. Comme illustré sur la figure 3A, des protéines recombinantes ont été reconnus par des antisérums spécifiques rhoptries lapin # 676. Protéines recombinantes Comme indiqué précédemment, exprimées ne sont pas reconnus par des antiserums contre les protéines vacuole parasitophore de P. falciparum et P. yoelii démontre la spécificité des antiserums de lapin 676 contre les protéines exprimées 32. De sérum de lapin normal (NRS) n'a pas réagi avec les protéines recombinantestraduit en utilisant deux étapes système in vitro sur les cellules d'expression de droits et un système de traduction couplé IVT une étape (figure 3B). L'expression réussie de protéines recombinantes a été confirmée par Plasmodium différentes techniques telles que la coloration de l'histidine In-gel et coloration au nickel-HRP 32. Protéines exprimées ont été purifiés par le système de purification d'affinité. La purification est réalisée dans la méthode de LOT (pas de colonnes utilisées). La technique est optimisée en modifiant la concentration en imidazole de 60 mM à 100 mM. La concentration optimale pour l'élution est de 250 mM. La figure 4 montre la purification réussie de protéines traduites à partir de 25 ul de produits protéiques traduits. La figure 4A montre la purification réussie de fente protéine transmembranaire de Maurer 18. La figure 4B montre la purification réussie de PF3D7_0925900, P. orthologue falciparum de Plasmodium yoelii PY17X_0830000 génique, unprotéine hypothétique 32. Figure 4C montre la purification succès de répétitions tatou contenant des protéines PY17X_1139200, une protéine hypothétique utilisant Ni billes de résine et 100 mM imidazole dans le tampon d'élution 1x. Le rendement en protéine après purification est de 3,5 ug / 25 ul.

Figure 1
Figure 1. Amplification de P. falciparum et P. yoelii gènes. Les produits de PCR 1% de gel d'agarose bromure d'éthidium montrant colorées de fragments de gène de PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 PFA0680cw et amplifiés à partir de P. ADN génomique falciparum.

Figure 2
Figure 2. Diagramme de bas HeLa système d'expression acellulaire éd. Représentation schématique des deux 2-étape et une étape dans les systèmes de la libre expression de cellules humaines in vitro. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Immunoblotting confirmation de l'expression des protéines. De Western blot de protéines recombinantes exprimées en utilisant rhoptries toute lapin spécifique anti-sérums # 676 et le sérum de lapin normal. (A) La réactivité des antiserums 676 avec des protéines recombinantes exprimées. (B) de sérum de lapin normal n'a pas réagi avec les protéines recombinantes exprimées. Vacuole parasitophore protéine ne réagit pas avec les protéines recombinantes 32.hres.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. La purification des protéines à partir de micro-volumes de produits de traduction. La purification des protéines recombinantes exprimées à l'aide de Nickel méthode d'affinité de chelation de résine. Les protéines exprimées (traduction) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, et (C) des protéines ont été incubées avec PY17X_1139200 Nickel - résines chélatantes sont purifiés avec de la résine de chelation au nickel-en l'absence d'imidazole dans du tampon de tampon de liaison et de purification. Après l'incubation, les billes ont été centrifugées, les protéines non liées ont été séparées et les billes lavées deux fois dans du tampon de lavage. Protéines recombinantes liées ont été éluées deux fois suivies par un lavage des billes. Traduit protéines, lavages, éluats et perlesont été solubilisées dans du tampon d'échantillon d'électrophorèse. Imidazole a été utilisé dans le lavage (20 mM d'imidazole) et élution (100 mM de tampon imidazole). Antisérums # 676 reconnue succès exprimée et protéines recombinantes purifiées. Sérum normal de lapin n'a pas réagi avec les protéines exprimées comme indiqué dans la Figure 3B. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

<td> 200 kDa
Caractéristiques Système d'expression de cellules humaines gratuit Le germe de blé cellule du système de la libre expression Lapin système d'expression de réticulocytes Lysat de E. coli système d'expression de protéine
Temps Fait transcription et la traduction en 3 h Transcription pour 6 heures et de traduction pour les 10 - 20 h La traduction de l'ARN doit être isolé prend 90 min Done en 1 h
Vecteur approprié vecteur T7 peut être vecteur SP6 T7 peut être utilisé T7 peut être utilisé
Échelle appropriée Utilisation pour la synthèse en laboratoire Utilisé pour la synthèse de protéines à grande échelle Convient pour des études de laboratoire et de vaccination Convient pour des études de laboratoire et de vaccination
Extrait Extraits de cellules HeLa gratuits Embryon d'extraits de blé Extraits cellulaires réticulocytes E. coli extraits de lysats de cellules
Modification Co-traductionnelle et la modification post-traductionnelle Poster modification translationnelle Co-traductionnelle modification Modification post-traductionnelle
Taille de la protéine traduite 8 kDa à 250 kDa 220 kDa 250 kDa
L'optimisation des codons Serré Serré En vrac Serré
Formation de pont disulfure Oui Oui Non Oui
Rendement Faible rendement Haut rendement Faible rendement Très haut rendement
Coût $ 130,00 pour 10 réactions $ 173,00 pour 10 réactions $ 136,00 pour 5 réactions $ 159,00 pour 8 réactions
La concentration en protéines 3 à 5 ug par réaction 100 pg / ml 100 pg / ml 500 pg / ml
Références 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

Tableau 1. Téléphones systèmes de la libre expression dans la recherche du paludisme. Comparaison de la cellulesystèmes de la libre expression actuellement utilisés dans la recherche du paludisme.

Gene ID Orthologue ID Protéine Séquence amorce pour PCR
PF3D7_1436300 composant translocon CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 Protéines fente de GCFP-2TM Maurer GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 Protéine hypothétique GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 Protéine hypothétique GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

Tableau 2. gènes rhoptries dans l'étude. Les amorces de différents gènes exprimés dans cette étude 19.

Nom de la matière Entreprise Numéro de catalogue Description
2-étape dans la cellule humaine vitro système de la libre expression 32 Thermo Fisher 88856 Abandonnées. Toujours stocker à -80 ° C. Ne pas décongeler dans l'eau chaude.
1-étape in vitro couplé système de traduction Thermo Fisher 88860 Toujours stocker à -80 ° C. Ne pas thaw dans l'eau chaude.

Tableau 3. cellulaires Hela libres sur la base des systèmes d'expression. Kits utilisés pour l'expression de protéines.

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Discussion

Les étapes importantes pour l'expression réussie de protéines en utilisant deux étapes dans le système de cellule humaine de la libre expression et la purification vitro sont: 1) l'amplification réussie et le clonage de gènes dans le vecteur plasmidique pT7CFE-Chis; 2) la transcription de l'ARN à 30 ° C; 3) la traduction de protéine à 30 ° C en présence d'inhibiteur de la RNAse; 4) le développement du protocole de purification par affinité en utilisant des billes à base de résine revêtues de Ni et 5) l'analyse des résultats de Western blot en utilisant des anticorps polyclonaux et monoclonaux. Les étapes importantes pour l'expression réussie de protéines en utilisant un IVT étape système de traduction couplé à la protéine sont: 1) l'amplification réussie et le clonage de gènes dans le vecteur plasmidique pT7CFE-Chis; 2) La transcription et la traduction des protéines à 30 ° C; 3) le développement du protocole de purification par affinité en utilisant des billes à base de résine revêtues de Ni et 4) l'analyse des résultats de Western blot en utilisant des anticorps polyclonaux et monoclonaux.

Courantment, les systèmes de la libre expression de cellules sont utilisées pour exprimer des protéines recombinantes paludisme. Les caractéristiques essentielles des systèmes cellule libre d'expression pour exprimer des protéines de paludisme est la capacité de décoder les gènes riches, un manque de longue pause translationnelle, expression réussie de séquences répétées d'acides aminés, le manque de mécanismes de glycosylation et de la capacité des plasmides pour contrôler la troncature du gène. Dans cette étude, nous démontrons l'utilisation d'un deux étapes système in vitro de la libre expression de cellules humaines 32 et en une seule étape IVT couplé systèmes de traduction pour l'expression de P. orthologues de gènes de P. falciparum rhoptries de mérozoïtes gènes yoelii, comme indiqué dans le tableau 1. Un protocole de purification a été développé et optimisé pour la purification des micro-volumes de protéines recombinantes obtenues à partir d'une étape et deux étapes dans les systèmes d'expression in vitro sans cellules humaines. 4 P. gènes falciparum, PF3D7_0114100 une protéine transmembranaire hydrophobe, une répétition ARM hypothétique préditPF3D7_1361800 protéine et une protéine hydrophile PF3D7_0925900, ont été exprimés au moyen de deux étapes et une étape de connexion du système d'expression de cellules humaines in vitro. Les rendements de protéines purifiées ont été déterminées. La protéine GCFP-2TM a été inclus dans ces études parce qu'elle est une protéine membranaire intégrale avec deux domaines transmembranaires et nous étions intéressés à déterminer si le système in vitro d'expression dans pouvait exprimer correctement la protéine transmembranaire et permettre une facilité de purification.

La principale différence dans les deux systèmes d'expression une étape et à deux étapes est que le système d'expression à deux étapes est un système dépendant de l'ARNm, où un ARNm stable est transcrit et ajouté à la réaction de traduction. En revanche, l'une étape in vitro couplées de transcription / Système de traduction comprend une transcription continu et la fourniture de l'ARNm, suivie par la co-traduction de la protéine au cours de la réaction. Les deux 1-étape IVT transcription / traduction couplé eSystème de xpression et deux étapes in vitro système d'expression acellulaire humain ont été testées pour l'expression de protéines de poids moléculaire élevé. Les deux systèmes ont réussi à exprimer des protéines recombinantes de bas poids moléculaire. Dans le système d'expression une étape, la réactivité croisée d'anticorps avec les protéines dans le mélange de réaction de traduction a été observée. Les protéines spécifiques réaction croisée avec les anticorps sont inconnus et doivent être étudiées plus. L'expression de protéines de poids moléculaire élevé a échoué en utilisant à la fois le 1-étape et deux systèmes pas à pas. Un protocole de purification a été développée pour des microvolumes de purification de protéines recombinantes de différentes propriétés de solubilité exprimée en utilisant à la fois une étape et deux étapes dans les systèmes d'expression in vitro acellulaires humain. Les protéines ont été purifiés avec succès et le rendement obtenu est de 3,5 ug par 25 ul lorsqu'il est exprimé en utilisant deux étapes in vitro système de traduction de protéine et 1,5 pg par 25 ul quand il est traduit avec le 1-étape IVT système d'expression de protéine. L'expression de protéines de faible poids moléculaire allant de 18 kDa à 37 kDa est reproductible et simple. Toutefois, l'expression de haut poids moléculaire se traduit par des troncatures de la protéine. En raison des microvolumes obtenues pour l'ADN cloné, l'amplification PCR a été utilisée pour vérifier les produits clonés. Les obstacles potentiels pour exprimer des protéines de haut poids moléculaire en utilisant des systèmes de la libre expression de cellules pourrait être la phosphorylation constante de eIF2 sous-unité alpha raison de la forte concentration de l'ATP dans la réaction. Ceci nuit à l'initiation de la traduction dans le système qui affecte potentiellement l'allongement de la synthèse des protéines lors de la synthèse de grandes protéines dans des systèmes d'expression de cellules libres 10.

Le protocole décrit ici est influencée par les conditions d'optimisation pour l'expression des protéines. Ni les codons du gène ni le plasmide ont été optimisés pour l'expression des protéines, et le repliement des protéines n'a pas été nécessaire. Ce système exprime proteins à 3 heures et la purification de la protéine peuvent être obtenus en deux heures, ce qui permet d'autres applications telles que le traitement en aval de la protéine recombinante pour l'immunisation ou le séquençage peptidique. Protéines recombinantes multiples peuvent être exprimés avec le système exempt de cellules HeLa, en utilisant des formats de puces à ADN pour le dépistage du sérum immunitaire et l'identification des molécules candidats potentiels du vaccin. En outre, les protéines potentiellement immunogènes peuvent être identifiées à travers des écrans et sélectionnés protéines obtenues par extrapolation expression.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

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Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

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