الحديديك تخثر نموذج الفأر على الشريان السباتي ومساريق السفينة التي يسببها كلوريد
Summary
The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.
Abstract
Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.
Introduction
دراسة الآليات التي تشارك في تطوير تجلط الدم وتقييم فعالية العقاقير المضادة للالجلطات يتطلب راسخة النماذج الحيوانية التجريبية. وكانت نماذج حيوانية كبيرة أول من استخدامها لأنها توفر السفن الكبيرة أكثر مماثلة على البشر من القوارض 1. ومع ذلك، وارتفاع تكلفة، والمرافق الكبيرة المطلوبة وصعوبة التلاعب بها وراثيا هي العوائق الرئيسية لاستخدامها والحيوانات الكبيرة تقتصر الآن على الدراسات قبل السريرية في وقت متأخر مرة واحدة أعطت الاختبارات الأولية على القوارض نتائج قاطعة 2. مع توافر واسعة من السلالات المعدلة وراثيا وخروج المغلوب وصغر حجمها أن يقلل من كمية المخدرات جرعات اللازمة لفي الجسم الحي اختبار، وتستخدم الفئران أساسا للبحث تجلط الدم. لذلك، تم وضع عدة نماذج من اضطرابات الجلطة في الفئران 3.
العديد من النماذج الجلطة التي أنشئت تعطل intimطبقة من جدار الوعاء الدموي، تليها تعرض المصفوفة خارج الخلية البطانية الفرعية لتدفق الدم يحفز تشكيل جلطات الدم 4. والجلطة الدموية قد تنجم عن التعرض الكولاجين الذي يؤدي إلى تنشيط الصفائح الدموية و / أو من التعرض للعامل النسيج الذي ينشط شلال التخثر 5. ثم يتم توظيف العديد من التقنيات لتحقيق إصابة الأوعية الأولية. Pierangeli آخرون بتطوير نموذج تعطل الميكانيكية بأداة المجهرية في الوريد الفخذي 6. Kikushi وآخرون وصفت نموذج الذي يتكون في إدارة صورة مركب تفاعلي (روز البنغال) التي تتراكم في طبقة ثنائية الدهون من الخلايا البطانية التي تتبعها الإثارة محددة من جدار الوعاء الدموي في المصالح مع الضوء الأخضر (540 نانومتر) 7. ويمكن أيضا الإصابة ان يحدثها قصيرة عالية الكثافة نبضة ليزر إضاءة 8. تقنية أخرى أنشئت أولا على الشريان السباتي الفئرانيتكون في التطبيق الموضعي للكلوريد الحديديك (FeCl 3) 9. في هذه الحالة، فإن النتائج سفينة تعرية من الجذور الحرة الناتجة عن FeCl 3 الذي يسبب بيروكسيد الدهون وتدمير الخلايا البطانية 10. إصابة الحث على التعبير عن عدة جزيئات الالتصاق مما اثار التصاق الصفائح الدموية وتجميعها وكذلك الكريات البيض التوظيف. وقد ثبت أن الكريات البيض، ولا سيما العدلات، تلعب دورا حاسما في تفعيل شلال التخثر في الدم مما يؤدي إلى تجلط الدم 11. هذه الطريقة مناسبة تماما لإنتاج شلال التخثر. يجب أن المحققين أن نضع في اعتبارنا أنه في هذا النموذج الماوس، وعادة ما يسببها تجلط الدم في الأوعية صحية في حين تجلط الدم في البشر يحدث بشكل رئيسي في مثل المريضة. سفن تصلب الشرايين.
حيث أن هذا النموذج هو بسيط جدا لتنفيذ وفعال أيضا في الفئران، هو الآن في وضع تخثر تستخدم في الغالبلتر بالنسبة للحيوان صغير الدراسات المجراة. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية توفر إمكانية للحث على تشكيل الجلطات في مجموعة متنوعة من السفن. يمكن السفن المستهدفة هي الشرايين أو الأوردة كبيرة قطرها (الشريان السباتي، الفخذ، الوريد الأجوف) أو القطر الصغير (مساريق، المشمرة) 12-14. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدامه أيضا في الشريان الدماغي الأوسط القريبة لتطوير نموذج من السكتة الدماغية 15. تشكيل الجلطة يمكن ملاحظة مباشرة من قبل intravital المجهري بعد وضع العلامات الفلورية من الصفائح الدموية وكريات الدم البيضاء أو مراقبتها عن طريق قياس انخفاض تدفق الدم مع التحقيق في درجة الحرارة أو 12،16،17 دوبلر التحقيق. ويمكن بعد ذلك التحقيق العديد من المعلمات مثل الوقت انسداد، والوقت تشكيل خثرة أو حجم الجلطة. الفروق الفسيولوجية بين السفن التحقيق في نتيجة الاختلافات الكبيرة في الجلطات التي تم الحصول عليها. وبالتالي، والمحققين عادة ما تختار السفينة المستهدفة وفقا لمعايير يريدون measuإعادة و / أو المرض وضع يريدون التحقيق. عادة، ونموذج على الشريان السباتي هو أكثر ملاءمة للبحث عن atherothrombosis المتعلقة احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية في حين أن الدراسات على الوريد الأجوف هي أكثر ملاءمة للبحث عن الخثار الوريدي العميق. سهولة الحصول على سفن مختلفة يحدد أيضا الطريقة المستخدمة لقياس النمو الجلطة. على سبيل المثال، والأوعية المساريقي من السهل للوصول إلى صنع هذا النموذج مناسبة تماما لمراقبة مجهرية حيوي داخلي ودراسة ديناميات تشكيل خثرة. الشريان السباتي هو يصعب الوصول إليها ولكن أكبر مما قياس تدفق الدم وتوفر نموذجا ممتازا لدراسة تخثر انسداد.
قدمت كلوريد الحديديك نموذج تجلط الدم الناجم عن التقدم الهائل في فهم هذه الحالة المرضية. وقد تم استخدامه في العديد من الدراسات التي تركز على دور عامل فون ويلبراند في تشكيل الجلطة 18،19. جنبا إلى جنب مع مودى الجينيتقنيات fication، وقد سمح ذلك تحديد العديد من الجينات المحددة المعنية في اضطرابات الجلطات. العمراني وآخرون. وقد أظهرت مثلا أن في المغلوب من الجين JAK2 V617F يرتبط مع تشكيل المتسارع للجلطة غير مستقرة 20. تشانغ وآخرون. وقد حققت في تورط الفسيولوجية للمستقبلات P2Y12 الصفائح الدموية وأظهرت أن الفئران المعدلة وراثيا overexpressing على وجه التحديد هذا المستقبل في الصفائح الدموية فقط، عرض تشكيل خثرة أسرع وأكثر استقرارا في الشريان المساريقي أصيب FeCl 3 21. كما تم التحقيق في الدور الحاسم للمنشط البلازمينوجين الأنسجة من نوع (TPA) ويوروكيناز من نوع المنشط plasminogen (ميكرو) في عملية تدهور الليفين في هذه الطريقة 22. وعلاوة على ذلك هذا النموذج يوفر أيضا وسيلة بسيطة ودقيقة لاختبار القدرات الحال للفبرين العديد من الأدوية الجديدة في الجسم الحي. على سبيل المثال، قد استخدمت وانغ وآخرون. هذا النموذج لعشرالبريد التحقق من صحة ما قبل السريرية من رواية المؤتلف منشط البلازمينوجين تستهدف تنشيط الصفائح الدموية 23. كما مكنت هذه الطريقة التحقق من البروتينات العلاجية معزولة عن اللعابية من القراد، الخفافيش مصاصي الدماء، والبعوض أو من السم من الثعابين مع تحديد معين من الهدف 24-27. هذه الأمثلة تدل على براعة نموذج كلوريد الحديديك. في هذه المقالة، ونحن نركز على طريقتين ودراسة كلوريد الحديديك التي يسببها تجلط الدم على اثنين من نوع سفينة مختلفة. سفينة المساريقي والشريان السباتي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكلوريد الحديديك الناجم عن نموذج تجلط الدم هو أداة بحث ممتازة. كما هو مبين في هذه الدراسة، فمن السهل للغاية لتنفيذ وعندما تستخدم بالاقتران مع intravital المجهري أو دوبلر مقياس الجريان، فإنه يوفر جيد للرصد في الوقت الحقيقي من تشكيل خثرة. ضبط التعرض الوقت وتركيز FeCl 3، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف الدعم الفني من الفرح ياو والدكتورة كارين البديل، فضلا عن تمويل من NHMRC وNHF.
Materials
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40 % (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
- Leadley, R. J., Chi, L., Rebello, S. S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. J Pharmacol Toxicol Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Johnson, G. J., Griggs, T. R., Badimon, L. The utility of animal models in the preclinical study of interventions to prevent human coronary artery restenosis: analysis and recommendations. On behalf of the Subcommittee on Animal, Cellular and Molecular Models of Thrombosis and Haemostasis of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost. 81 (5), 835-843 (1999).
- Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92 (3), 486-494 (2004).
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100 (7), 979-991 (2007).
- Furie, B., Furie, B. C. Mechanisms of thrombus formation. N Engl J Med. 359 (9), 938-949 (2008).
- Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H., Anderson, G., Harris, E. N. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74 (5), 1361-1367 (1995).
- Kikuchi, S., Umemura, K., Kondo, K., Saniabadi, A. R., Nakashima, M. Photochemically induced endothelial injury in the mouse as a screening model for inhibitors of vascular intimal thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18 (7), 1069-1078 (1998).
- Rosen, E. D., Raymond, S., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158, 1613-1622 (2001).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60 (4), 269-280 (1990).
- Eckly, A., Hechler, B., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9 (4), 779-789 (2011).
- Darbousset, R., et al. Involvement of neutrophils in thrombus formation in living mice. Pathol Biol (Paris). 62 (1), 1-9 (2014).
- Denis, C., Methia, N., et al. A mouse model of severe von Willebrand disease: defects in hemostasis and thrombosis). Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (16), 9524-9529 (1998).
- Wang, X., Hagemeyer, C. E., et al. Novel single-chain antibody-targeted microbubbles for molecular ultrasound imaging of thrombosis: validation of a unique noninvasive method for rapid and sensitive detection of thrombi and monitoring of success or failure of thrombolysis in mice. Circulation. 125 (25), 3117-3126 (2012).
- Wang, X., Smith, P. L., Hsu, M. -. Y., Ogletree, M. L., Schumacher, W. A. Murine model of ferric chloride-induced vena cava thrombosis: evidence for effect of potato carboxypeptidase inhibitor. J Thromb Haemost. 4 (2), 403-410 (2006).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Jirousková, M., Chereshnev, I., Väänänen, H., Degen, J. L., Coller, B. S. Antibody blockade or mutation of the fibrinogen gamma-chain C-terminus is more effective in inhibiting murine arterial thrombus formation than complete absence of fibrinogen. Blood. 103 (6), 1995-2002 (2004).
- Dubois, C., Panicot-Dubois, L., Merrill-Skoloff, G., Furie, B., Furie, B. C. Glycoprotein VI-dependent and -independent pathways of thrombus formation in vivo. Blood. 107 (10), 3902-3906 (2006).
- Navarrete, A. -. M., Casari, C., et al. A murine model to characterize the antithrombotic effect of molecules targeting human von Willebrand factor. Blood. 120 (13), 2723-2732 (2012).
- Rayes, J., Hollestelle, M. J., et al. Mutation and ADAMTS13-dependent modulation of disease severity in a mouse model for von Willebrand disease type 2B. Blood. 115 (23), 4870-4877 (2010).
- Lamrani, L., Lacout, C., et al. Hemostatic disorders in a JAK2V617F-driven mouse model of myeloproliferative neoplasm. Blood. 124 (7), 1136-1145 (2014).
- Zhang, Y., Ye, J., et al. Increased platelet activation and thrombosis in transgenic mice expressing constitutively active P2Y12. J Thromb Haemost. 10 (10), 2149-2157 (2012).
- Schäfer, K., Konstantinides, S., et al. Different mechanisms of increased luminal stenosis after arterial injury in mice deficient for urokinase- or tissue-type plasminogen activator. Circulation. 106 (14), 1847-1852 (2002).
- Wang, X., Palasubramaniam, J., et al. Towards effective and safe thrombolysis and thromboprophylaxis: preclinical testing of a novel antibody-targeted recombinant plasminogen activator directed against activated platelets. Circ Res. 114 (7), 1083-1093 (2014).
- Decrem, Y., et al. Ir-CPI, a coagulation contact phase inhibitor from the tick Ixodes ricinus, inhibits thrombus formation without impairing hemostasis. J Exp Med. 206 (11), 2381-2395 (2009).
- Ma, D., et al. Desmolaris, a novel factor XIa anticoagulant from the salivary gland of the vampire bat (Desmodus rotundus) inhibits inflammation and thrombosis in vivo. Blood. 122 (25), 4094-4106 (2013).
- Lei, X., et al. Anfibatide, a novel GPIb complex antagonist, inhibits platelet adhesion and thrombus formation in vitro and in vivo in murine models of thrombosis. Thromb Haemost. 111 (2), 279-289 (2014).
- Waisberg, M., et al. Plasmodium falciparum infection induces expression of a mosquito salivary protein (Agaphelin) that targets neutrophil function and inhibits thrombosis without impairing hemostasis. PLoS Pathog. 10 (9), e1004338 (2014).
- Owens, A. P., Lu, Y., Whinna, H. C., Gachet, C., Fay, W. P., Mackman, N. Towards a standardization of the murine ferric chloride-induced carotid arterial thrombosis model. J Thromb Haemost. 9 (9), 1862-1863 (2011).
- Wang, X., Xu, L. An optimized murine model of ferric chloride-induced arterial thrombosis for thrombosis research. Thromb Res. 115 (1-2), 95-100 (2005).
- Tseng, M. T., Dozier, A., Haribabu, B., Graham, U. M. Transendothelial migration of ferric ion in FeCl3 injured murine common carotid artery. Thromb Res. 118 (2), 275-280 (2006).
- Bonnard, T., et al. Leukocyte mimetic polysaccharide microparticles tracked in vivo on activated endothelium and in abdominal aortic aneurysm. Acta Biomater. 10 (8), 3535-3545 (2014).
- Boulaftali, Y., Lamrani, L., et al. The mouse dorsal skinfold chamber as a model for the study of thrombolysis by intravital microscopy. Thromb Haemost. 107 (5), 962-971 (2012).
- Konstantinides, S., Schäfer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103 (4), 576-583 (2001).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1 (1), 50-55 (2013).
