Introduction
Lo studio dei meccanismi coinvolti nello sviluppo della trombosi e la valutazione dell'efficacia di farmaci anti-trombotici richiede ben consolidata modelli animali sperimentali. Grandi modelli animali sono stati i primi ad essere usati in quanto forniscono grandi vasi più simile agli esseri umani dei roditori 1. Tuttavia, costo elevato, le strutture più grandi richieste e la difficoltà nel manipolare geneticamente sono i principali svantaggi del loro utilizzo e grandi animali ora sono solo gli studi preclinici in ritardo una volta test preliminari sui roditori hanno dato risultati conclusivi 2. Con la vasta disponibilità di transgenici e knockout ceppi e le loro piccole dimensioni che riduce al minimo la quantità di farmaci antitrombotici necessarie per il test in vivo, i topi sono utilizzati principalmente per la ricerca trombosi. Pertanto, diversi modelli di disturbi trombotici sono stati sviluppati in topi 3.
Molti modelli trombosi stabiliti rompono gli intimuno strato della parete del vaso, seguita dall'esposizione del sub matrice extracellulare endoteliale al flusso sanguigno indurre la formazione di coaguli di sangue 4. Il trombi può derivare dall'esposizione di collagene, che provoca l'attivazione delle piastrine e / o dall'esposizione del fattore tissutale che attiva la cascata coagulativa 5. Diverse tecniche sono poi utilizzati per raggiungere il danno vascolare iniziale. Pierangeli et al. Sviluppato un modello rottura meccanica con un utensile microchirurgia sulla vena femorale 6. Kikushi et al. Descrissero un modello che consiste nella somministrazione di una foto composto reattivo (Rosa Bengala) che si accumula nel doppio strato lipidico delle cellule endoteliali seguita dall'eccitazione specifica della parete del vaso di interesse con luce verde (540 nm) 7. La lesione può anche essere indotta da una breve ad alta intensità di illuminazione laser a impulsi 8. Un'altra tecnica dapprima stabilito sulla carotide di ratticonsiste nella applicazione topica di cloruro ferrico (FeCl 3) 9. In questo caso, i risultati nave denudazione dai radicali liberi generati da FeCl 3 che provoca la perossidazione lipidica e la distruzione delle cellule endoteliali 10. L'infortunio induce l'espressione di diverse molecole di adesione scatenanti adesione piastrinica e l'aggregazione, così come leucociti reclutamento. È stato dimostrato che, in particolare leucociti neutrofili, giocano un ruolo cruciale nella attivazione della cascata della coagulazione del sangue che porta alla trombosi 11. Questo metodo è adatto per riprodurre la cascata della coagulazione; gli investigatori devono tenere presente che, in questo modello di topo, la trombosi è tipicamente indotta in vasi sani, mentre la trombosi nell'uomo si verifica principalmente nei es malato. vasi aterosclerotici.
Poiché questo modello è molto semplice da implementare ed è anche efficace nei topi, è ora il modo più utilizzato trombosil per piccoli animali in vivo. Inoltre, questa tecnica offre la possibilità di indurre la formazione di trombi in una varietà di navi. Vasi di destinazione possono essere arterie o le vene di grande diametro (carotidea, femorale, vena cava) o di piccolo diametro (mesenterio, Cremaster) 12-14. Più di recente, è stato utilizzato anche in prossimale dell'arteria cerebrale media di sviluppare un modello di ictus 15. La formazione trombosi può essere direttamente osservata tramite microscopia intravitale dopo marcatura fluorescente di piastrine e leucociti o monitorato misurando la diminuzione del flusso di sangue con una sonda di temperatura o una sonda Doppler 12,16,17. Diversi parametri come il tempo di occlusione, ora la formazione di trombi o dimensione del trombo possono quindi essere esaminati. Le differenze fisiologiche tra i vasi risultato indagati in significative variazioni nel trombi ottenuto. Pertanto, gli investigatori di solito scegliere il vaso target in base ai parametri che vogliono misuri e / o l'impostazione vogliono studiare la malattia. In genere, il modello sul carotide è più rilevante per la ricerca su aterotrombosi relativa a infarto miocardico o ictus, mentre studi sulla vena cava sono più rilevanti per la ricerca sulla trombosi venosa profonda. L'accessibilità dei vasi differenti determina anche il metodo utilizzato per misurare la crescita trombo. Per esempio, i vasi mesenterici sono facilmente accessibili, che questo modello adatto per l'osservazione al microscopio intravitale e lo studio della dinamica di formazione di trombi. L'arteria carotidea è meno accessibile ma più grande che consentano di flusso misurazioni sangue e fornire un modello eccellente per studiare la trombosi occlusiva.
Il cloruro ferrico modello trombosi indotta ha fornito enormi progressi nella comprensione di questa patologia. E 'stato utilizzato in molti studi incentrati sul ruolo del fattore di von Willebrand nella formazione di trombosi 18,19. In combinazione con modi geneticatecniche ficazione, essa ha permesso l'individuazione di molti geni specifici coinvolti in disordini trombotici. Lamrani et al. per esempio hanno mostrato che un knock-in del gene JAK2 V617F è associata con una formazione accelerazione di coagulo instabile 20. Zhang et al. Hanno studiato le implicazioni fisiologica del recettore P2Y12 piastrine e dimostrato che i topi transgenici specificamente questo recettore nelle piastrine solo, visualizzate una più rapida e stabile formazione di trombi nelle arterie mesenterica ferito con FeCl 3 21. Il ruolo cruciale di Tissue-tipo attivatore del plasminogeno (tPA) e urochinasi tipo plasminogeno (uPA) nel processo di degradazione della fibrina è stato studiato in questo metodo 22. Inoltre questo modello fornisce anche un modo semplice ed accurato di testare le capacità fibrinolitica di molti nuovi farmaci in vivo. Ad esempio, Wang et al. Hanno utilizzato questo modello per the validazione preclinica di un romanzo attivatore del plasminogeno ricombinante mirata contro piastrine attivate 23. Questo metodo ha consentito inoltre la convalida di proteine terapeutiche isolate dal salivare di zecche, pipistrelli vampiri, e zanzare o dal veleno dei serpenti con specifico l'identificazione del target 24-27. Questi esempi dimostrano la versatilità del modello di cloruro ferrico. In questo articolo, ci concentriamo su due metodi e studiamo cloruro ferrico trombosi indotta su due diversi tipo di nave; nave mesenterica e carotide.
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Protocol
Tutti gli esperimenti su animali sono stati approvati dalla Alfred Medical Research and Education Precinct comitato etico degli animali (E / 1534/2015 / B). Tutte le operazioni chirurgiche sono stati eseguiti in anestesia totale e gli animali non hanno esperienza del dolore in qualsiasi momento. Tutti gli esperimenti descritti sono mancato recupero.
1. Preparazione
- Tagliare bande sottili di carta filtro (1 mm x 2 mm).
- Appena preparare 2 soluzioni di cloruro ferrico del 4% (w / v) e il 6% (w / v) diluito in acqua deionizzata. Preparare una soluzione rodamina 6G 0,3% in PBS, filtrata attraverso 0,22 micron.
- Tagliare un piccolo pezzo (5 mm x 1 cm) dalla plastica bianca della siringa involucro.
2. Mesentere Arteriola trombo Formazione Osservato da intravitale Microscopia
- Pesano 10-12 settimane maschio C57BL / 6 wild type mouse e anestetizzare conseguenza con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) se iniezione intraperitoneale. Monitorare la profondità dell'anestesia dalla risposta ai piedi, coda e / o pizzico pelle, reattività da presa cornea e della palpebra, e l'assenza di movimento baffi. Se necessario, iniettare una seconda dose di ketamina (50 mg / kg) per mantenere l'anestesia dell'animale. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Posizionare il mouse in una piccola scatola di Petri posto su una piastra elettrica regolata a 37 ° C.
NOTA: Sebbene iniezione IP può provocare dolore per gli animali, la durata di questo disagio sarà minimo (meno di 3 sec). Il dolore e il disagio associato con iniezioni saranno ridotti al minimo attraverso l'utilizzo di personale esperto e competente e la dimensione ago appropriato (25 G). A seguito di tutte le procedure, eutanasia tutti gli animali con una overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale. - Effettuare una incisione mediana addominale di circa 3 cm nella pelle e tagliare con attenzione il peritoneo.
- Posizionare il mouse sul lato del petpiatto ri, esteriorizzare delicatamente suoi intestini e diffondere accuratamente il mesentere con 2 bastoncini cotonati portare un recipiente adatto alla superficie della piastra di Petri. Asciugare bene con un delicato tergicristallo.
NOTA: Per limitare il movimento dei vasi mesenterici, papaverina può essere utilizzato per inibire la peristalsi intestinale. - Immergere la coda del topo in acqua calda per dilatare i vasi e iniettare 30 ml di rodamina 6G (0,3%) nella vena della coda del topo con una siringa 29 G etichettare leucociti e piastrine.
- Porre la capsula di Petri con un microscopio invertito e concentrarsi sul arteriole scelta utilizzando il canale in campo chiaro.
- Immergere una striscia di carta filtro con 6% (w / v) di ferro (III) cloruro e applicare la carta da filtro in arteriole con due pinze; il primo a tenere la carta da filtro, la seconda per premere delicatamente sulla zona di interesse. Osservare formazione di trombi nel primo 10 sec dopo la deposizione della carta da filtro.
NOTA: E 'abbastanza commsulla ferire microcircolo circondato e la precisione della deposizione della carta da filtro e la pressione delicatamente è quindi importante limitare questo problema. - Osservare formazione di trombi mediante microscopia a fluorescenza (canale TRITC: picco di eccitazione 557 nm, picco di emissione 576 nm), attraverso la carta da filtro. Osservare le leucociti circolanti e piastrine che hanno raccolto la rodamina 6G e la loro aggregazione in trombo è quindi facile da identificare.
- Prendere la carta da filtro dopo 1 minuti di esposizione al ferro (III) cloruro e continuare a monitorare la formazione del trombo. Lavare il recipiente con PBS.
- Osservare e registrare la formazione dinamica del trombo evidenziata con l'etichettatura di piastrine e leucociti con rodamina 6G. Catturare le immagini e misurare le dimensioni del trombo. Le immagini qui presentati sono stati ottenuti con un microscopio intravitale invertito, anche se un obiettivo 4x, nel canale di fluorescenza TRITC.
- Fopo tutte le procedure, eutanasia dell'animale utilizzando un'overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale.
3. carotide trombo Formazione valutata dal Sangue di velocità del flusso di misura
- Pesano 10-12 settimane vecchio maschio C57BL / 6 del mouse e anestetizzare conseguenza con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) se iniezione intraperitoneale. Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Fissare il mouse sotto un microscopio operatorio utilizzando nastro adesivo su gambe, su una piastra elettrica regolata a 37 ° C.
- Fare un piccolo cuscino di un tergicristallo e il nastro sotto la testa del mouse per elevare la testa leggermente. Utilizzare un anello di filo con le pinze per tirare il muso verso il basso (utilizzare denti superiori). Questo esporrà la regione della carotide per un facile accesso.
- Eseguire Small 5 mm di profondità di incisione della pelle direttamente sotto la mascella, fino allo sterno.
- Sezionare la fascia e isolare un frammento di una carotide comune sinistra o destra sopra della biforcazione.
- Introdurre con cautela una pinzetta in-tra l'arteria e il nervo per separarli. Non disturbare il coraggio correndo vicino all'arteria ed evitare di toccare troppo della carotide come può provoca danni alla nave. Isolare una sezione di un almeno 5 mm dell'arteria.
- Essiccare l'area dell'arteria correttamente tergicristalli per evitare che qualsiasi liquido interferisce con il FeCl 3.
- Mettere il piccolo pezzo di plastica bianca sotto la parte isolata del carotide comune in modo che il FeCl 3 non immergere nei tessuti circostanti. A questo scopo, utilizzare una seconda pinza per portare il pezzo al primo poi lentamente scorrere la carta plastica sotto l'arteria.
- Immergere un pezzo di carta da filtro con il 4% (w / v) o 6% (w / v) di cloruro ferrico e posizionarlo tutto intorno all'arteria.
- Dopo 3 minuti di esposizione, togliere la carta da filtro, risciacquare con PBS e asciugare la zona wtergicristalli esima.
- Posizionare la sonda Doppler intorno alla nave al zona lesa e iniziare a registrare i cambiamenti nel flusso. Nella carotide comune di topi adulti sani, il flusso è generalmente circa 1 ml / min. Attenzione! contatto della sonda con cloruro ferrico danneggerà la sonda in modo che qualsiasi contatto deve essere evitato. I dati qui presentati sono stati ottenuti con un metro Transonic System Inc. Flow, modulo perivascolare TS420 dotato di una sonda di mandata Nano Doppler 0,5 PBS.
NOTA: La concentrazione di cloruro ferrico può modificare la cinetica di formazione di trombi conseguente diversi tempi di occlusione. Così, un'esposizione al 6% (w / v) di cloruro ferrico dà un'occlusione veloce di esposizione al 4% (w / v) di cloruro ferrico. - A seguito di tutte le procedure, eutanasia tutti gli animali con una overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale e pulire accuratamente la sonda Doppler.
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Representative Results
La fluorescenza intravitale osservazione al microscopio del mesentere rivelerà l'accumulo di rodamina 6G etichettato piastrine e dei leucociti lungo la parete del vaso feriti da FeCl 3. La formazione progressiva di un trombo parziale è monitorato in un recipiente mesentere 200 micron (Figura 1). Un trombo appare lentamente ed è chiaramente identificabile dopo il primo minuto di esposizione a FeCl 3 (figura 1, t = 60 sec). 40 secondi dopo la rimozione della carta da filtro imbevuta con FeCl 3, trombosi progredisce ed è infine presente sulla parete dell'intero tratto di vaso osservato rapidamente (Figura 1, t = 100 sec).
Figura 1:. Trombo crescita osservata da fluorescente intravitale microscopia in un vaso Mesentere immagini sono state scattate a 15 sec, 60sec e 100 sec dopo la deposizione della carta da filtro imbevuta con il 6% (w / v) FeCl soluzione 3. La carta da filtro è stato rimosso dopo 60 secondi di esposizione. Leucociti e piastrine sono state marcate con pre-iniezione di rodamina 6G (0,5% w / v). Le frecce rosse indicano piastrine / leucociti aggregati. Bar Scala 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Un trombo intra-carotidea è indotta mediante l'applicazione di un filtro di carta imbevuta di soluzione FeCl 3 attorno ad un isolato carotide ei cambiamenti nel flusso sanguigno a valle della lesione viene registrato con una sonda di flusso Doppler (Figura 2). Un costante flusso di sangue nel complesso circa 1,1 ml / min è misurata in arteria carotide non feriti. Dopo 3 minuti di esposizione del vaso con carta da filtro imbevuta di 4% (w / v) FeCl soluzione 3, un trombo occlusivo è obtained un tempo di occlusione di 13 min e 30 sec dopo l'inizio dell'esposizione. Dopo 3 minuti di esposizione con una carta da filtro imbevuta di 6% (w / v) FeCl 3, un trombo occlusivo si ottiene un tempo di occlusione di 9 min e 30 sec dopo l'inizio dell'esposizione.
Figura 2. Rappresentante Recordings del flusso sanguigno attraverso l'arteria carotidea dopo FeCl 3 Injury. Il flusso sanguigno è stata misurata con una sonda flusso Doppler posta sulla carotide appena a valle della carta da filtro imbevuta con 4% (w / v) o 6% ( w / v) FeCl 3. La carta da filtro è stato rimosso dopo 3 minuti di esposizione. Come un flusso di sangue di controllo è stato ottenuto misurando la carotide sano.
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Discussion
Il cloruro ferrico trombosi indotta modello è uno strumento di ricerca eccellente. Come mostrato in questo studio, è estremamente facile da implementare e quando usato in combinazione con la microscopia intravitale o Doppler flussimetro, fornisce un buon controllo in tempo reale di formazione di trombi. Regolazione del tempo di esposizione e la concentrazione di FeCl 3, offre anche la possibilità di produrre trombi o non-occlusive o occlusive.
Tuttavia, questo metodo ha anche alcune limitazioni. Nel carotide, il principale svantaggio è che anche se il tempo di occlusione può efficacemente essere modificato, la riproducibilità del modello resta troppo debole per controllare con precisione le dimensioni del trombo e tasso di crescita 10. Diversi gruppi hanno lavorato su una standardizzazione del modello 28,29. Owens et al. suggerito che il tempo di occlusione affidabile e riproducibile può essere ottenuto con la pratica e riducendo tutti i fattori di variazione quali l'età dii topi, il background genetico dei topi, l'anestesia utilizzato, la tecnica per l'esposizione di cloruro ferrico e la concentrazione della soluzione di cloruro ferrico 28. La sonda Doppler si ha anche alcune limitazioni con un certo grado di segnale di fondo presente che può influenzare la determinazione dell'occlusione. Il flusso di sangue può anche essere alterato dalla formazione di trombi instabile.
Sul vaso mesenterico, la riproducibilità può essere influenzata dalle dimensioni del vaso che varia più delle arterie carotidee e la presenza di grasso che può diminuire la portata del pregiudizio. E 'stato riportato che i trombi ottenuti differiscono a seconda delle dimensioni della lesione parete del vaso che può frenare all'endotelio spargimento o anche influenzare le cellule muscolari lisce della tonaca media 30. Il modello di radiazione laser costituisce una buona alternativa del modello cloruro ferrico che fornisce una migliore riproducibilità 8. Tuttavia, è limitata a piccoli vasi che sono abbastanza trasparenti per consentire la penetrazione del laser. Si noti anche che in questo modello, le cellule endoteliali vengono distrutte dopo l'applicazione di cloruro ferrico e non è quindi adatto per studi sul ruolo delle cellule endoteliali. Tuttavia, è possibile sostituire il cloruro ferrico da ionoforo del calcio per ottenere un infortunio debole, limitata all'attivazione dell'endotelio 31.
Un altro limite di questo modello è che non è adatto per studiare l'evoluzione a lungo termine della malattia. Per soddisfare questo requisito, Boulaftali et al. Hanno sviluppato camere di pliche cutanee dorsale che consentono il monitoraggio della stessa trombo per diverse settimane 32. Questa tecnica è particolarmente adatto per esaminare gli effetti dei farmaci trombolitici in funzione della scadenza trombo. In questo studio, l'invecchiamento coagulo è risultato compromettere l'azione litica di una forma ricombinante di tissue attivatore del plasminogeno, che è attualmente il gold standard di farmaci trombolitici per uso umano.
Nonostante alcuni inconvenienti che devono essere presi in considerazione, il modello FeCl 3 è rilevante per lo studio di trombosi umana. La composizione dei trombi ottenuto è stato analizzato su sezioni istologiche e la presenza di piastrine, fibrina e globuli rossi sono stati identificati nel trombi intra-carotidea 33. Inoltre, poiché il disturbo aterotrombotico si presume essere avviato dalla ossidazione delle lipoproteine, inducendo il pregiudizio recipiente se una reazione ossidoriduzione modello FeCl 3 è più probabile che imitare la fisiopatologia della malattia umana di un meccanico, fotochimica o laser indotta lesioni 34.
Il trombo formata però cloruro ferrico è stato anche descritto come sensibile sia anticoagulanti e farmaci anti-piastrinici. Eparina e Clopidogrel ad esempio sono stati reported per estendere il tempo di occlusione di trombi formata nella carotide 29. La somministrazione di una forma ricombinante di Hirudin ha prolungato in modo significativo il tempo di formazione di trombi sulla mesentere microcircolo 17. Pertanto, il modello di cloruro ferrico offre eccellenti spunti di trombosi ed è uno strumento di grande rilevanza per la validazione preclinica di nuovi trombolitica, anticoagulanti e farmaci anti-piastrinici.
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Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto tecnico da Joy Yao e il Dr. Karen Alt, così come i finanziamenti del NHMRC e NHF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40% (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
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