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Summary

The FeCl₃ induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Abstract

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

Introduction

O estudo dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento de trombose e a avaliação da eficácia de fármacos anti-trombóticos bem estabelecida requer modelos animais experimentais. Grandes modelos animais foram os primeiros a ser utilizado uma vez que proporcionam grandes vasos mais semelhantes aos seres humanos do que roedores ^1. No entanto, de alto custo, as instalações maiores necessários e da dificuldade em manipulá-las geneticamente são os principais inconvenientes para a sua utilização e animais de grande porte são agora limitados a estudos pré-clínicos final uma vez ensaios preliminares em roedores têm dado resultados conclusivos ^2. Com a disponibilidade de largura de estirpes transgénicas e knockout e seu pequeno tamanho que minimiza a quantidade de drogas antitrombóticas necessárias para os ensaios in vivo, os ratinhos são utilizados principalmente para a investigação trombose. Portanto, vários modelos de doenças trombóticas tem sido desenvolvido em murganhos ^3.

Muitos modelos de trombose estabelecidos perturbar os intimuma camada da parede do vaso, seguido pela exposição da matriz extracelular sub-endotelial para o fluxo sanguíneo induzindo a formação de coágulos sanguíneos ^4. Os trombos podem resultar da exposição de colagénio, que provoca activação de plaquetas e / ou a partir da exposição do factor tecidual que activa a cascata de coagulação ^5. Várias técnicas são então utilizados para realizar a lesão inicial navio. Pierangeli et ai. Desenvolveram um modelo de ruptura mecânica com uma ferramenta de microcirurgia na veia femoral ^6. Kikushi et ai. Descreveu um modelo que consiste na administração de um composto reactivo foto (Rosa de Bengala) que se acumula na bicamada lipídica de células endoteliais, seguido por excitação específica da parede do vaso de interesse com luz verde (540 nm) ^7. A lesão, também pode ser induzida por uma alta intensidade de iluminação curto pulso de laser ^8. Outra técnica, em primeiro lugar estabelecido na artéria carótida de ratosconsiste na aplicação tópica de cloreto férrico _(FeCl3) ^9. Neste caso, os resultados denudação vaso de radicais livres gerados por FeCl _3, que faz com que a peroxidação lipídica e destruição de células endoteliais ^10. A lesão induz a expressão de várias moléculas de adesão que desencadeiam a adesão e agregação de plaquetas, bem como o recrutamento de leucócitos. Demonstrou-se que os leucócitos, principalmente os neutrófilos, desempenham um papel crucial na activação da cascata de coagulação do sangue levando a trombose ^11. Este método está bem adaptado para reproduzir a cascata de coagulação; os investigadores devem ter em mente que, neste modelo de ratinho, a trombose é tipicamente induzido em vasos saudáveis ​​enquanto a trombose em seres humanos está ocorrendo principalmente na ex doente. vasos ateroscleróticos.

Como este modelo é muito simples de implementar e é também eficaz em camundongos, é agora o modo de trombose usado na maior partel para pequenos animais em estudos in vivo. Além disso, esta técnica oferece a possibilidade de induzir a formação de trombos numa variedade de vasos. Navios-alvo pode ser artérias ou veias de grande diâmetro (carótida, femoral, veia cava) ou de pequeno diâmetro (mesentério, cremaster) ^12-14. Mais recentemente, foi também utilizado na artéria cerebral média proximal para desenvolver um modelo de acidente vascular cerebral ^15. A formação da trombose pode ser directamente observada por meio de microscopia intravital após marcação fluorescente de plaquetas e leucócitos ou monitorizada medindo a diminuição do fluxo sanguíneo com uma sonda de temperatura ou uma sonda Doppler ^12,16,17. Vários parâmetros, tais como tempo de oclusão, o tempo de formação de trombos ou tamanho do trombo pode então ser investigados. As diferenças fisiológicas entre os vasos investigado resultado em variações significativas na trombos obtido. Portanto, os pesquisadores geralmente selecionar o vaso-alvo de acordo com os parâmetros que eles querem measure e / ou a configuração que deseja investigar a doença. Normalmente, o modelo na artéria carótida é mais relevante para a pesquisa sobre aterotrombose relacionada ao infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral enquanto que estudos sobre a veia cava são mais relevantes para a pesquisa sobre trombose venosa profunda. A acessibilidade dos diferentes vasos também determina o método utilizado para medir o crescimento do trombo. Por exemplo, os vasos mesentéricos são de fácil acesso tornando este modelo adequado para observação microscópica intravital e o estudo da dinâmica de formação de trombos. A artéria carótida é menos acessível, mas maior, permitindo medições de fluxo de sangue e fornecer um excelente modelo para estudar a trombose oclusiva.

O modelo de trombose induzida cloreto férrico tem prestado um enorme progresso na compreensão desta patologia. Ele tem sido usado em muitos estudos que incidem sobre o papel do factor de von Willebrand na formação da trombose ^18,19. Combinado com modi genéticatécnicas ficação, permitiu a identificação de muitos genes específicos envolvidos em doenças trombóticas. Lamrani et ai. por exemplo, demonstraram que um knock-in do gene JAK2 ^V617F está associada com uma formação acelerada de coágulo instável ^20. Zhang et ai. Investigaram a implicação fisiológica do receptor P2Y12 de plaquetas e demonstraram que os ratinhos transgénicos que sobre-expressam este receptor especificamente em plaquetas somente, apresentou uma formação de trombo mais rápida e estável na artéria mesentérica feridos com FeCl ₃ ^21. O papel crucial de activador do plasminogénio tipo tecido (tPA) e uroquinase-tipo do activador de plasminogénio (uPA) no processo de degradação de fibrina, também tem sido investigada neste método ^22. Além disso, este modelo também fornece um modo simples e preciso de testar as capacidades fibrinolíticas de muitas drogas novas in vivo. Por exemplo, Wang et al. Usaram este modelo de the validação pré-clínica de um romance ativador do plasminogênio recombinante dirigido contra plaquetas ativadas ^23. Este método também permitiu a validação de proteínas terapêuticas isoladas a partir da saliva de morcegos vampiros, carrapatos e mosquitos, ou a partir do veneno de serpentes de identificação específico do alvo ^24-27. Estes exemplos demonstram a versatilidade do modelo de cloreto férrico. Neste artigo, vamos nos concentrar em dois métodos e estudar cloreto férrico trombose induzida em dois tipo de navio diferente; vaso mesentérico e artéria carótida.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Alfred Pesquisa Médica e da Educação Comissão de Ética Animal Precinct (E / 1534/2015 / B). Todas as manipulações cirúrgicas foram realizadas sob anestesia geral e os animais não apresentaram dor em qualquer fase. Todas as experiências descritas são não-recuperação. 1. Preparação Cortar bandas finas de papel de filtro (1 mm x 2 mm). Recentemente preparar duas soluções de cloreto férrico, de …

Representative Results

A observação de microscopia intravital fluorescente do mesentério irá revelar a acumulação de Rodamina 6G marcado plaquetas e leucócitos ao longo da parede do vaso lesionado por FeCl 3. A formação progressiva de um trombo é monitorizado parcial num recipiente de 200 um mesentério (Figura 1). Um trombo aparece lentamente e é claramente identificável após o primeiro minuto de exposição à FeCl 3 (Figura 1, t = 60 segundos). 40 segundos após a remoç?…

Discussion

O modelo de trombose cloreto férrico induzida é uma excelente ferramenta de pesquisa. Como se mostra neste estudo, é extremamente fácil de implementar e, quando utilizado em combinação com a microscopia intravital ou medidor de fluxo de Doppler, que fornece uma boa monitorização em tempo real de formação de trombos. Ajustando o tempo de exposição e a concentração do FeCl _3, como também oferece a possibilidade de produzir ou trombos oclusivos ou não-oclusivos.

No en…

Materials

Whatman chromatography paper	GE Healthcare	3030917
Iron (III) chloride 40 % (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Inverted microscope	Olympus	IX81
Digital black-and-white camera	Olympus	XM10
Doppler flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow probe	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine (Rampun)	Bayer	75313
Petri dish	Sarstedt	82.1472
Insulin syringe (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Cotton tipped applicators	BSN medical	211827A
Dynek dysilk sutures	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Heating pad	Kirchner	T60