철 염화물에 의한 경동맥 및 장간막 용기에 혈전증 마우스 모델
Summary
The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.
Abstract
Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.
Introduction
혈전증의 개발 및 항 혈전 약제의 효과의 평가에 관련된 메카니즘의 연구는 또한 실험 동물 모델을 확립 요구한다. 설치류가 1보다 인간에게 더 큰 용기가 제공 유사한 큰 동물 모델을 사용하는 제했다. 그러나 높은 비용이 요구되는 더 큰 시설을 조작하는데 어려움이 유전자의 사용에 큰 단점이며, 설치류에 예비 시험이 결정적인 결과 2 주어진 일단 큰 동물은 지금 늦은 전임상 연구로 제한됩니다. 생체 내 테스트에 필요한 혈전 약물의 양을 최소화하는 유전자 및 녹아웃 균주 및 작은 크기의 넓은 가용성, 생쥐는 주로 혈전증 연구에 사용된다. 따라서, 혈전 성 질환의 몇몇 모델 생쥐 3에 개발되어왔다.
대부분의 설립 혈전증 모델은 intim을 방해혈전 (4)의 형성을 유도하는 혈액 흐름에 서브 내피 세포 외 기질의 노출 뒤에 혈관 벽의 층. 혈전은 /과 응고 캐스케이드 (5)를 활성화 조직 인자의 노출 또는 혈소판 활성화를 트리거 콜라겐 노출 될 수 있습니다. 몇 가지 기술이어서 초기 혈관 손상을 달성하기 위해 사용된다. Pierangeli는 외. 대퇴부 정맥 6 미세 도구 기계적 파괴 모델을 개발 하였다. Kikushi 등은. 녹색 등 (540 ㎚) 7 관심의 혈관 벽의 특정 여기 뒤에 내피 세포의 지질 이중층에 축적 사진 반응성 화합물 (로즈 벵갈)의 관리에있다 모델을 설명했다. 상처는 짧은 고강도의 펄스 레이저 조명 (8)에 의해 유도 될 수있다. 또 다른 기술은 먼저 쥐의 경동맥에 설립염화 제이철의 국소 적용 (50ml을) 구에있다. 이 경우, FeCl3를 생성 유리기로부터 용기 삭박 결과는 내피 세포 (10)의 지질 과산화 및 파괴를 야기한다. 부상 백혈구 모집뿐만 아니라 혈소판 부착 및 응집을 유발 여러 부착 분자의 발현을 유도한다. 이것은 백혈구, 특히 호중구, 혈전증 11 이어지는 혈액 응고 캐스케이드의 활성화에 결정적인 역할을한다는 것을 증명되었다. 이 방법은 잘 응고 캐스케이드를 재현 적합하다; 연구자들은 인간의 혈전증은 주로 병에 걸린 예에서 발생되는 반면,이 마우스 모델에서, 혈전증은 일반적으로 건강한 혈관에 유도되어, 명심해야합니다. 동맥 경화성 혈관.
이 모델은 구현하기 매우 간단하고 또한 마우스에서 효과적이기 때문에, 지금 주로 사용 혈전증 모드생체 내 연구에서 작은 동물을위한 L. 또한,이 기술은 용기의 다양한 혈전의 형성을 유도 할 가능성을 제공한다. 대상 선박은 동맥 또는 큰 직경 (경동맥, 대퇴, 대정맥) 또는 작은 직경 (장간막, cremaster) 12-14의 정맥이 될 수 있습니다. 최근에, 또한 스트로크 (15)의 모델을 개발하기 위해 근위 중뇌 동맥에 사용 하였다. 혈전 형성이 직접 혈소판 및 백혈구의 형광 표지 한 후 현미경으로 관찰하여 생체 내에 또는 온도 프로브 또는 도플러 프로브 12,16,17과 혈류의 감소를 측정함으로써 모니터링 될 수있다. 이러한 폐색 시간, 혈전 형성 시간이나 혈전 크기와 같은 여러 파라미터는 조사 될 수있다. 혈관 사이의 생리적 차이가 얻은 혈전에 상당한 변화에서 결과를 조사 하였다. 따라서, 연구자들은 일반적으로 그들이 measu 원하는 매개 변수에 따라 상기 타겟 용기를 선택다시 및 / 또는 조사하려는 설정 질병. 일반적으로 경동맥의 모델은 대정맥에 대한 연구가 깊은 정맥 혈전증에 대한 연구에 대한 관련성 반면 심근 경색 또는 뇌졸중에 관한 죽상 혈전증에 대한 연구에 더 관련이있다. 다른 혈관의 접근성 또한 혈전 성장을 측정하는 데 사용되는 방법을 결정한다. 예를 들어, 장간막 혈관은 생체 내에 현미경 관찰 및 혈전 형성의 역학 연구를위한이 모델이 적합하다 액세스하기 쉽다. 경동맥 적게 액세스 가능하지만 혈류 측정 크다 및 폐쇄성 혈전을 연구 우수한 모델을 제공한다.
염화 제이철 유도 혈전증 모델이 병리의 이해에 엄청난 진전을 제공하고 있습니다. 이는 혈전 형성 (18,19)에 폰 빌레 브란트 인자의 역할에 초점을 여러 연구에 사용되었다. 유전 MODI와 결합문법을 없애는 기술은 또한 혈전 성 질환에 관여하는 많은 유전자의 특정 식별을 허용했다. Lamrani 등은. 예컨대 JAK2 V617F 유전자의 녹아웃에 혈병이 불안정 (20)의 가속 형성과 연관되어 있음을 보여 주었다. 장 등이. P2Y12 혈소판 수용체의 생리 학적 의미를 조사 혈소판 특이 수용체를 과발현하는 형질 전환 마우스 만, FeCl3를 21 부상 장간막 동맥에서보다 신속하고 안정적인 혈전 형성을 표시 것을 증명 하였다. 조직 – 형 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)과 섬유소 분해 공정에서 키나아제 형 플라스 미노 겐 활성제 UPA ()의 중요한 역할은이 방법 (22)에서 조사되고있다. 또한,이 모델은 또한, 생체 내에서 많은 신규 한 약품의 섬유소 용해 능력을 시험하는 간단하고 정확한 방법을 제공한다. 예를 들어, 왕 등 알. 일이 모델을 사용하고 있습니다활성화 된 혈소판 (23)에 대해 목표로 새로운 재조합 플라스 미노 겐 활성제의 전자 전임상 유효성 검사. 이 방법은 진드기, 뱀파이어 박쥐, 및 모기의 타액이나 대상 24 ~ 27의 특정 식별과 뱀의 독에서 분리 된 치료 용 단백질의 유효성 검사를 활성화. 이러한 예 염화철 모델의 다양성을 증명한다. 이 문서에서 우리는 두 가지 방법에 초점을 두 개의 서로 다른 선종에 염화 제이철 유도 혈전증을 연구; 장간막 혈관 및 경동맥.
Protocol
Representative Results
Discussion
염화철 유도 혈전증 모델은 우수한 연구 도구이다. 본 연구에서 나타난 바와 같이, 그 구현이 매우 용이하고, 생체 내에 현미경 또는 도플러 유량계와 조합하여 사용될 때, 혈전 형성의 좋은 실시간 모니터링을 제공한다. 노출 시간과의 FeCl3의 농도를 조정, 또한 비 또는 폐쇄성 혈전 폐색 하나를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다.
그러나,이 방법은 몇 가지 제한 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 NHMRC와 NHF의 기술 기쁨 야오 박사 카렌 Alt 키의 지원뿐만 아니라 자금을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40 % (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
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