The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.
Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.
Изучение механизмов, участвующих в развитии тромбоза и оценки эффективности антитромботических лекарств требует хорошо известны экспериментальные животные модели. Большие модели на животных были первыми, чтобы быть использованы, поскольку они обеспечивают большие сосуды больше похож на человека, чем грызунов 1. Тем не менее, высокая стоимость, большие объекты, необходимые и трудность в манипулировании их генетически являются основными недостатками в их использовании и крупные животные в настоящее время ограничивается конце доклинических исследований сразу предварительные испытания на грызунах дали убедительных результатов 2. С широкой доступности трансгенных и нокаут штаммов и их небольшого размера, что минимизирует количество антитромбоцитарных препаратов, необходимых для тестирования в естественных условиях, мыши используются в основном для тромбоза исследований. Таким образом, несколько моделей тромботических заболеваний были разработаны в мышей 3.
Многие установленные модели тромбоза нарушить интимслой стенки сосуда, с последующим воздействием на суб эндотелиальной внеклеточного матрикса в кровоток индуцировать образование тромбов 4. Тромбы могут возникнуть в результате воздействия коллагена, который вызывает активацию тромбоцитов и / или от воздействия тканевого фактора, который активирует каскад коагуляции 5. Некоторые методы которые затем используют для достижения первоначальной травмы сосудов. Pierangeli др. Разработали механическую модель с разрывом микрохирургии инструмента на бедренную вену 6. Kikushi др. Описал модель, которая состоит в управлении фотографией реактивной соединения (бенгалроза), который накапливается в липидный бислой эндотелиальных клеток с последующим конкретной возбуждения стенки сосуда интересов с зеленым светом (540 нм) 7. Травма может также быть вызвано короткого высокоинтенсивного импульса лазерного излучения 8. Другой метод, во-первых создана на сонной артерии крыссостоит в местном применении хлорида железа (FeCl 3) 9. В этом случае результаты судно денудационные от свободных радикалов, генерируемых FeCl 3, который вызывает перекисное окисление липидов и разрушение эндотелиальных клеток 10. Травма индуцирует экспрессию нескольких молекул адгезии, вызывающих адгезию тромбоцитов и агрегацию, а также лейкоцитов набора. Было показано, что лейкоциты, в частности, нейтрофилы, играют решающую роль в активации каскада свертывания крови, ведущего к тромбозу 11. Этот метод хорошо подходит для воспроизведения каскад коагуляции; Следователи должны иметь в виду, что в этой модели мыши, тромбоз обычно возникает у здоровых сосудов, тогда как тромбоз у человека в основном происходит в больном например. атеросклеротические сосуды.
В этой модели очень прост в реализации и также эффективен у мышей, то теперь в основном используется режим тромбозл для маленького животного в естественных условиях исследования. Кроме того, этот метод дает возможность индуцировать образование тромбов в различных сосудах. Целевые суда могут быть артерий или вен большого диаметра (сонной, бедренной, кава) или малого диаметра (брыжейки, кремастер) 12-14. Совсем недавно, он был также использован на проксимальной средней мозговой артерии разработать модель инсульта 15. Формирование тромбоза может быть непосредственно наблюдается прижизненной микроскопии после флуоресцентного мечения тромбоцитов и лейкоцитов или контролируется путем измерения уменьшение кровотока с датчиком температуры или доплеровского зонда 12,16,17. Некоторые параметры, такие как время окклюзии, время образования тромба или размера тромба может быть исследована. Физиологические различия между судами исследованы привести к значительным изменениям в тромбов, полученного. Таким образом, исследователи, как правило, выбор целевого сосуда в соответствии с параметрами, которые они хотят measuвновь и / или болезнь установки они хотят, чтобы исследовать. Как правило, модели на сонной артерии является более актуальным для исследования атеротромбоза, связанного с инфарктом миокарда или инсульта в то время как исследования по полой вены являются более актуальными для исследования глубокого венозного тромбоза. Доступность различных сосудов также определяет метод, используемый для измерения роста тромба. Например, мезентериальные сосуды легко получить доступ делает эта модель хорошо подходит для прижизненной микроскопом и исследования динамики формирования тромба. Сонной артерии менее доступен, но больше, позволяющие измерения кровотока и обеспечивают отличную модель для изучения окклюзионной тромбоз.
Хлорид железа индуцированных тромбоза модель обеспечила огромный прогресс в понимании этой патологии. Он был использован во многих исследованиях, посвященных роли фактора Виллебранда в формировании тромбоза 18,19. В сочетании с генетической модусовметоды фикации, это позволило выявить многие специфического гена, участвующего в тромботических нарушений. Ламрани др. Например, показали, что стук в гена JAK2 V617F связано с ускоряющим образование неустойчивых сгустка 20. Чжан и др. Исследовали физиологические последствия рецептора тромбоцитов P2Y12 и показали, что трансгенные мыши, избыточно специально этот рецептор тромбоцитов только отображается более быстрое и стабильное образование тромбов в брыжеечной артерии травмированного с FeCl 3 21. Решающая роль тканевого типа активатор плазминогена (ТАП) и урокиназы типа активатора плазминогена (УАП) в процессе деградации фибрина также были исследованы в этом методе 22. Кроме того эта модель также обеспечивает простой и точный способ проверки фибринолитической потенциала многих новых препаратов в естественных условиях. Например, Ван и др. Использовали эту модель для гое доклинические проверка нового рекомбинантного активатора плазминогена, направленные против активированных тромбоцитов 23. Этот метод также включен проверку терапевтических белков, выделенных из слюнных клещей, летучих мышей-вампиров, и комаров или из яда змей с конкретной идентификации цели 24-27. Эти примеры показывают универсальность железа хлорида модели. В этой статье мы сосредоточимся на двух методов и изучения железа хлорида индуцированного тромбоза в двух различных типов судов; брыжеечных сосудов и сонная артерия.
Железа хлорид индуцированных тромбоза модель отлично инструмент исследования. Как показано в этом исследовании, это очень легко реализовать, и при использовании в сочетании с прижизненной микроскопии или доплеровского расходомера, что обеспечивает хорошую мониторинг в реальном вре?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить техническую поддержку от Joy Яо и доктора Карен Alt, а также финансирование из NHMRC и НФЗ.
Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
Iron (III) chloride 40 % (w/v) | VWR | 24212.298 | |
Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
Heating pad | Kirchner | T60 |