Ferric Chloride-induceret Trombose Mouse Model på Arteria carotis og mesenterium Vessel

Summary

The FeCl₃ induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Abstract

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

Introduction

Studiet af de mekanismer, der er involveret i udviklingen af ​​trombose og evaluering af effektiviteten af ​​anti-trombotiske lægemidler kræver veletableret eksperimentelle dyremodeller. Store dyremodeller var de første til at blive brugt, da de giver store skibe mere ligner mennesker end gnavere ^1. Men høje omkostninger, de større nødvendige faciliteter og vanskeligheden ved at manipulere dem er genetisk er store ulemper for deres brug og store dyr er nu begrænset til sene prækliniske studier, når foreløbige test på gnavere har givet afgørende resultater ^2. Med bred tilgængelighed af transgene og knockout stammer og deres lille størrelse, der minimerer mængden af antitrombotiske lægemidler kræves for in vivo testning mus hovedsageligt bruges til trombose forskning. Derfor har flere modeller af trombotiske lidelser er udviklet i mus ^3.

Mange etablerede trombose modeller forstyrre Intimet lag af karvæggen, efterfulgt af udsættelse af det sub endotel ekstracellulære matrix til blodgennemstrømningen inducere dannelsen af blodpropper ^4. Tromberne kan skyldes eksponering af kollagen, som udløser blodplader aktivering eller / og fra eksponering af vævsfaktor som aktiverer koagulationskaskaden ^5. Adskillige teknikker anvendes derpå til at nå det oprindelige fartøj skade. Pierangeli et al. Udviklet en mekanisk sprængning model med en mikrokirurgi værktøj på den femorale vene ^6. Kikushi et al. Beskrev en model, som består i administration af et billede reaktiv forbindelse (Rose Bengal), der akkumuleres i lipiddobbeltlaget af endotelceller, efterfulgt af det specifikke excitation af karvæggen af interesse med grønt lys (540 nm) ^7. Skaden kan også induceres af en kort høj intensitet puls laserbelysning ^8. En anden teknik for det første fastsat på halspulsåren hos rotterbestår i topisk påføring af ferrichlorid _(FeCl3) ^9. I dette tilfælde er de fartøj blotlægning resultater fra frie radikaler genereret af _FeCl3 som forårsager lipidperoxidation og destruktion af endotelceller ^10. Skaden inducerer ekspression af flere adhæsionsmolekyler udløser blodpladeadhæsion og aggregering såvel som leukocytter rekruttering. Det er blevet påvist, at leukocytter, især neutrofiler, spiller en afgørende rolle i aktiveringen af blodkoaguleringskaskaden fører til thrombose ^11. Denne metode er velegnet til at reproducere koagulationskaskaden; efterforskere skal huske på, at i denne musemodel, er trombose typisk induceret i sunde fartøjer mens trombose hos mennesker primært forekommer i syge f.eks. atherosclerotiske fartøjer.

Da denne model er meget enkel at implementere og er også effektiv i mus, er det nu det mest brugt trombose tilstandl for lille dyr in vivo studier. Desuden er denne teknik giver mulighed for at inducere dannelsen af ​​tromber i forskellige typer beholdere. Target fartøjer kan være arterier eller vener med stor diameter (carotis, femorale, vena cava) eller lille diameter (mesenterium, cremaster) ^12-14. For nylig blev det også anvendt på den proksimale arteria cerebri media at udvikle en model for slagtilfælde ^15. Den trombose dannelse kan være direkte observeret af intravital mikroskopi efter fluorescerende mærkning af blodplader og leukocytter eller overvåges ved at måle blodgennemstrømningen faldet med en temperaturføler eller en Doppler probe ^12,16,17. Adskillige parametre såsom okklusion tid, thrombedannelse tid eller trombe størrelse kan derefter undersøges. De fysiologiske forskelle mellem fartøjer undersøgte resultat i betydelige variationer i tromber opnået. Derfor efterforskere vælge normalt målkarret i henhold til de parametre, som de ønsker at measure og / eller sygdommen indstilling de ønsker at undersøge. Typisk model på halspulsåren er mere relevant for forskning i aterotrombose relateret til myokardieinfarkt eller slagtilfælde mens undersøgelser af vena cava er mere relevante for forskning i dyb venetrombose. Tilgængeligheden af ​​de forskellige fartøjer bestemmer også den metode, der anvendes til at måle trombe vækst. For eksempel, er let at få adgang gør denne model velegnet til intravital mikroskopisk observation og undersøgelse af dynamikken i trombedannelse de mesenteriske fartøjer. Halspulsåren er mindre tilgængeligt men større muliggør blod flowmålinger og giver en fremragende model til at studere okklusiv thrombose.

Ferrichlorid induceret thrombosemodel har tilvejebragt enorme fremskridt i forståelsen af ​​denne patologi. Det har været anvendt i mange undersøgelser, der fokuserer på den rolle, von Willebrand faktor i trombose dannelse ^18,19. Kombineret med genetisk modifikation teknikker, har det kunnet pege på mange specifikke gen involveret i trombotiske lidelser. Lamrani et al. for eksempel har vist, at en knock-in for JAK2 ^V617F-genet er associeret med en accelererende dannelse af ustabile koagel ^20. Zhang et al. Har undersøgt den fysiologiske konsekvenser af P2Y12 blodplade-receptoren og viste, at transgene mus, der overudtrykker specifikt denne receptor i blodplader kun, udviste en mere hurtig og stabil thrombedannelse i mesenterialarterie såret med _FeCl3 ^21. Den afgørende rolle, Tissue-plasminogenaktivator (tPA) og urokinase-plasminogenaktivator (uPA) i fibrin nedbrydningsprocessen er også blevet undersøgt i denne fremgangsmåde ^22. Endvidere denne model giver også en enkel og nøjagtig måde at teste de fibrinolytiske kapacitet i mange nye lægemidler in vivo. For eksempel har Wang et al. Brugt denne model til the præklinisk validering af en hidtil ukendt rekombinant plasminogenaktivator målrettet mod aktiverede blodplader ^23. Denne metode også gjort det muligt validering af terapeutiske proteiner isoleret fra spyt af flåter, vampyr flagermus, og myg eller fra giften af slanger med specifik identifikation af målet ^24-27. Disse eksempler viser alsidigheden af ​​den ferrichlorid model. I denne artikel har vi fokus på to metoder og studere ferrichlorid induceret trombose på to forskellige skibstype; mesenteriske fartøj og halspulsåren.

Protocol

Alle forsøg med dyr blev godkendt af Alfred Medical Research og Uddannelse Precinct Animal Ethics Committee (E / 1534/2015 / B). Alle kirurgiske manipulationer blev udført i fuld bedøvelse og dyrene ikke oplever smerte på noget tidspunkt. Alle beskrevne forsøg er ikke-inddrivelse. 1. Fremstilling Skære tynde bånd af filterpapir (1 mm x 2 mm). Frisk forberede 2 opløsninger af ferrichlorid på 4% (vægt / volumen) og 6% (vægt / volumen) fortyndet i deioniseret van…

Representative Results

Den fluorescerende intravital mikroskopi observation af mesenteriet vil afsløre akkumuleringen af rhodamin 6G mærkede blodplader og leukocytter langs karvæggen såret af FeCl3. Den gradvise dannelse af en delvis trombe overvåges i en 200 um mesenteriet fartøj (figur 1). En thrombe langsomt vises, og er klart identificerbare efter det første minut af eksponering for FeCl3 (figur 1, t = 60 sek). 40 sekunder efter fjernelse af filtrerpapiret gennemvædet med <su…

Discussion

Ferrichlorid induceret thrombosemodel er et fremragende forskningsværktøj. Som vist i denne undersøgelse, er det ekstremt let at implementere og når de anvendes i kombination med intravital mikroskopi eller Doppler flowmeter, det giver en god overvågning i realtid af thrombedannelse. Justering af tid eksponering og koncentrationen af _FeCI3, det giver også mulighed for at producere enten ikke-okklusive eller okklusive tromber.

Men denne fremgangsmåde har også nogle begræns…

Materials

Whatman chromatography paper	GE Healthcare	3030917
Iron (III) chloride 40 % (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Inverted microscope	Olympus	IX81
Digital black-and-white camera	Olympus	XM10
Doppler flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow probe	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine (Rampun)	Bayer	75313
Petri dish	Sarstedt	82.1472
Insulin syringe (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Cotton tipped applicators	BSN medical	211827A
Dynek dysilk sutures	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Heating pad	Kirchner	T60