Ferric क्लोराइड प्रेरित कैरोटिड धमनी और अन्त्रपेशी पोत पर घनास्त्रता माउस मॉडल

Summary

The FeCl₃ induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Abstract

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

Introduction

घनास्त्रता के विकास और विरोधी थ्रोम्बोटिक दवाओं के प्रभाव के मूल्यांकन में शामिल तंत्र के अध्ययन में अच्छी तरह से प्रयोगात्मक पशु मॉडल की स्थापना की आवश्यकता है। वे कृन्तकों ¹ से मनुष्य के लिए बड़े जहाजों और अधिक समान उपलब्ध कराने के रूप में बड़े पशु मॉडल में इस्तेमाल किया जा करने के लिए पहले किए गए। बहरहाल, उच्च लागत, आवश्यक बड़ा सुविधाओं और उन्हें जोड़ तोड़ करने में कठिनाई आनुवंशिक रूप से उनके उपयोग के लिए प्रमुख कमियां हैं और कृन्तकों पर प्रारंभिक परीक्षणों निर्णायक परिणाम ² दे दिया है एक बार बड़े जानवरों अब देर से पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैं। इन विवो परीक्षण के लिए आवश्यक antithrombotic दवाओं की मात्रा को कम करता है कि ट्रांसजेनिक और पीटा उपभेदों और उनके छोटे आकार की व्यापक उपलब्धता के साथ, चूहे मुख्य रूप से घनास्त्रता अनुसंधान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसलिए, थ्रोम्बोटिक विकारों के कई मॉडल चूहों ³ में विकसित किया गया है।

कई स्थापित घनास्त्रता मॉडल intim बाधितरक्त के थक्के ⁴ के गठन के उत्प्रेरण रक्त के प्रवाह को उप एन्दोथेलिअल बाह्य मैट्रिक्स के लोगों तक पहुंचाने के द्वारा पीछा पोत दीवार की एक परत,। थ्रोम्बी / और जमावट झरना ⁵ को सक्रिय करता है जो ऊतक कारक के जोखिम से या प्लेटलेट्स सक्रियण चलाता है जो कोलाजेन के जोखिम से परिणाम हो सकता है। कई तकनीकों तो प्रारंभिक पोत चोट हासिल करने के लिए कार्यरत हैं। Pierangeli एट अल। ऊरु नस ⁶ पर एक microsurgery के उपकरण के साथ एक यांत्रिक व्यवधान मॉडल विकसित किया है। Kikushi एट अल। हरी बत्ती (540 एनएम) ⁷ के साथ ब्याज की पोत दीवार के विशिष्ट उत्तेजना के द्वारा पीछा endothelial कोशिकाओं के लिपिड bilayer में जम जाता है, जो एक तस्वीर प्रतिक्रियाशील यौगिक (गुलाब बंगाल) के प्रशासन में होते हैं, जो एक मॉडल का वर्णन किया। चोट भी एक छोटी उच्च तीव्रता नाड़ी लेजर रोशनी ⁸ द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। एक और तकनीक सबसे पहले चूहों के मन्या धमनी पर स्थापितफेरिक क्लोराइड की सामयिक आवेदन (FeCl ₃₎ ⁹ में होते हैं। इस मामले में, FeCl ₃ द्वारा उत्पन्न मुक्त कण से पोत अनाच्छादन परिणामों जो endothelial कोशिकाओं ¹⁰ में लिपिड peroxidation और विनाश का कारण बनता है। चोट ल्यूकोसाइट्स भर्ती के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्लेटलेट आसंजन और एकत्रीकरण को ट्रिगर कई आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। यह ल्यूकोसाइट्स, विशेष रूप से न्यूट्रोफिल, थ्रोम्बोसिस ¹¹ के लिए अग्रणी रक्त जमावट झरना की सक्रियता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि प्रदर्शन किया गया है। इस विधि को अच्छी तरह से जमावट झरना पुन: पेश करने के लिए अनुकूल है; जांचकर्ताओं मानव में थ्रोम्बोसिस मुख्य रूप से रोगग्रस्त जैसे में होने वाली है, जबकि इस माउस मॉडल में, थ्रोम्बोसिस आम तौर पर स्वस्थ वाहिकाओं में प्रेरित किया है कि, ध्यान में रखना चाहिए। अथेरोस्लेरोटिक वाहिकाओं।

इस मॉडल को लागू करने के लिए बहुत आसान है और यह भी चूहों में प्रभावी है, यह अब ज्यादातर इस्तेमाल थ्रोम्बोसिस विधा हैvivo अध्ययन में छोटे पशु के लिए एल। इसके अलावा, इस तकनीक के जहाजों की एक किस्म में थ्रोम्बी के गठन को प्रेरित करने के लिए संभावना प्रदान करता है। लक्ष्य वाहिकाओं धमनियों या बड़े व्यास (मन्या, ऊरु, वेना कावा) या छोटे व्यास (अन्त्रपेशी, cremaster) ^12-14 की नसों हो सकता है। हाल ही में, यह भी स्ट्रोक ¹⁵ का एक मॉडल विकसित करने के लिए समीपस्थ मध्य मस्तिष्क धमनी पर इस्तेमाल किया गया था। थ्रोम्बोसिस गठन सीधे प्लेटलेट और leukocytes के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के बाद intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया या एक तापमान जांच या एक डॉपलर जांच ^12,16,17 के साथ रक्त प्रवाह में कमी को मापने के द्वारा नजर रखी जा सकती है। ऐसे रोड़ा समय, thrombus गठन के समय या थक्का आकार के रूप में कई मापदंडों तो जांच की जा सकती है। जहाजों के बीच शारीरिक मतभेद प्राप्त थ्रोम्बी में महत्वपूर्ण बदलाव में परिणाम की जांच की। इसलिए, जांचकर्ताओं आमतौर पर वे measu करना चाहते मापदंडों के अनुसार लक्ष्य पोत का चयनफिर से और / या वे जांच करना चाहते हैं स्थापित करने की बीमारी। आमतौर पर, मन्या धमनी पर मॉडल वेना कावा पर अध्ययन गहरी शिरापरक घनास्त्रता पर अनुसंधान के लिए और अधिक प्रासंगिक हैं जबकि रोधगलन या स्ट्रोक से संबंधित atherothrombosis पर अनुसंधान के लिए और अधिक प्रासंगिक है। विभिन्न जहाजों की पहुंच भी थक्का विकास को मापने के लिए इस्तेमाल किया विधि निर्धारित करता है। उदाहरण के लिए, mesenteric जहाजों intravital सूक्ष्म अवलोकन और thrombus गठन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए इस मॉडल को अच्छी तरह से अनुकूल बनाने का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं। कैरोटिड धमनी कम सुलभ लेकिन सक्रिय करने के लिए रक्त के प्रवाह माप बड़ा है और पूर्णावरोधक थ्रोम्बोसिस अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करते हैं।

फेरिक क्लोराइड प्रेरित घनास्त्रता मॉडल इस विकृति की समझ में जबरदस्त प्रगति प्रदान की गई है। यह थ्रोम्बोसिस गठन ^18,19 में वॉन Willebrand कारक की भूमिका पर ध्यान केंद्रित कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। आनुवंशिक मोदी के साथ संयुक्तfication तकनीक, यह थ्रोम्बोटिक विकारों में शामिल कई विशिष्ट जीन की पहचान की अनुमति दी गई है। Lamrani एट अल। उदाहरण के लिए JAK2 ^V617F जीन की एक दस्तक में अस्थिर थक्का ²⁰ की एक त्वरक गठन के साथ जुड़ा हुआ है कि पता चला है। झांग एट अल। P2Y12 प्लेटलेट रिसेप्टर के शारीरिक निहितार्थ जांच की और प्लेटलेट्स में विशेष रूप से इस रिसेप्टर overexpressing ट्रांसजेनिक चूहों केवल FeCl ₃ ²¹ से घायल mesenteric धमनी में एक और अधिक तेजी से और स्थिर thrombus गठन प्रदर्शित कि प्रदर्शन किया है। ऊतक प्रकार plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) और आतंच गिरावट प्रक्रिया में Urokinase प्रकार plasminogen उत्प्रेरक (संप्रग) की महत्वपूर्ण भूमिका को भी इस विधि ^{से 22} में जांच की गई है। इसके अलावा यह मॉडल भी vivo में कई उपन्यास दवाओं के fibrinolytic क्षमता का परीक्षण करने का एक सरल और सटीक तरीका प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, वैंग एट अल। वीं के लिए इस मॉडल का इस्तेमाल किया हैसक्रिय प्लेटलेट्स ²³ के खिलाफ लक्षित एक उपन्यास पुनः संयोजक plasminogen उत्प्रेरक का ई क्लिनिक पूर्व सत्यापन। इस विधि को भी लगे निशान, पिशाच चमगादड़, और mosquitos की लार से या लक्ष्य ^24-27 की विशिष्ट पहचान के साथ सांप के जहर से अलग चिकित्सीय प्रोटीन का सत्यापन सक्षम होना चाहिए। ये उदाहरण फेरिक क्लोराइड मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन। इस अनुच्छेद में, हम दो तरीकों पर ध्यान केंद्रित करने और दो अलग अलग पोत प्रकार पर फेरिक क्लोराइड प्रेरित थ्रोम्बोसिस अध्ययन; mesenteric पोत और मन्या धमनी।

Protocol

जानवरों को शामिल सभी प्रयोगों अल्फ्रेड मेडिकल रिसर्च एंड एजुकेशन एरिया पशु आचार समिति (ई / 1534/2015 / बी) द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी शल्य जोड़तोड़ पूर्ण संज्ञाहरण के तहत किया गया और जानवरों के किसी भी चरण …

Representative Results

Rhodamine 6G का संचय खोलेगा अन्त्रपेशी के फ्लोरोसेंट intravital माइक्रोस्कोपी अवलोकन FeCl 3 से घायल पोत दीवार के साथ प्लेटलेट्स और ल्यूकोसाइट्स लेबल। एक आंशिक थक्का के प्रगतिशील गठन एक 200 माइक्रोन अन्त्रपेशी पोत <…

Discussion

फेरिक क्लोराइड प्रेरित घनास्त्रता मॉडल एक उत्कृष्ट अनुसंधान उपकरण है। इस अध्ययन में दिखाया गया है, इसे लागू करने के लिए बेहद आसान है और intravital माइक्रोस्कोपी या डॉपलर प्रवाहमापी के साथ संयोजन में इस्तेम…

Materials

Whatman chromatography paper	GE Healthcare	3030917
Iron (III) chloride 40 % (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Inverted microscope	Olympus	IX81
Digital black-and-white camera	Olympus	XM10
Doppler flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow probe	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine (Rampun)	Bayer	75313
Petri dish	Sarstedt	82.1472
Insulin syringe (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Cotton tipped applicators	BSN medical	211827A
Dynek dysilk sutures	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Heating pad	Kirchner	T60