Jernklorid-indusert tromboser Mouse Model på arteria carotis og mesenterium Vessel

Summary

The FeCl₃ induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Abstract

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

Introduction

Studiet av de mekanismene som er involvert i utviklingen av trombose og evalueringen av effektiviteten av anti-trombotiske midler krever veletablerte eksperimentelle dyremodeller. Store dyremodeller var de første til å bli brukt som de gir store fartøy mer lik for mennesker enn gnagere ^1. Men høye kostnader, større fasiliteter som kreves og vanskeligheten med å manipulere dem genetisk er store ulemper for deres bruk og store dyr er nå begrenset til slutten av prekliniske studier gang foreløpige tester på gnagere har gitt konkluderende resultater ^2. Med store tilgjengeligheten av transgene og knockout stammer og deres lille størrelse som minimerer mengden av antitrombotiske legemidler som kreves for in vivo testing, er mus i hovedsak brukt for trombose forskning. Derfor har flere modeller av blodpropp er utviklet i mus ^tre.

Mange etablerte trombose modeller forstyrre intimet lag av karveggen, etterfulgt av eksponering av under endotelial ekstracellulære matriks til blodstrømmen å indusere dannelsen av blodpropper ^4. Den tromber kan oppstå ved eksponering av kollagen som utløser aktivering av blodplater og / eller fra eksponering av vev faktor som aktiverer koagulasjonskaskaden ^5. Flere teknikker blir så anvendt for å oppnå den første skade fartøyet. Pierangeli et al. Utviklet en mekanisk avbrudd modell med en mikro verktøyet på lårvenen ^6. Kikushi et al., Beskrives en modell som består i administrering av en foto reaktiv forbindelse (Rose Bengal) som akkumuleres i det ytre lipid bilaget av endotelceller, etterfulgt av den spesifikke eksitasjon av karveggen av interesse med grønt lys (540 nm) ^7. Skaden kan også være forårsaket av en kort høy intensitet puls laser belysning ^8. En annen teknikk for det første etablert på halspulsåren hos rotterbestår i at topisk anvendelse av ferriklorid _(FeCl3) ^9. I dette tilfelle, idet fartøyet denudasjon resultatene fra frie radikaler som genereres av _FeCl3 som forårsaker lipidperoksidasjon og ødeleggelse av endotelceller ^10. Skaden induserer ekspresjon av flere adhesjonsmolekyler utløsende blodplateadhesjon og aggregering samt leukocytter rekruttering. Det har blitt demonstrert at leukocytter, særlig neutrofiler, spiller en avgjørende rolle i aktivering av koagulasjonskaskaden som fører til trombose ^11. Denne fremgangsmåte er godt egnet til å reprodusere koaguleringskaskaden; etterforskere må huske på at i denne musemodell, er trombose vanligvis indusert hos friske fartøy mens blodpropp hos mennesker er i hovedsak skjer i syke f.eks. aterosklerotiske fartøy.

Når denne modellen er meget enkel å gjennomføre, og er også effektive i mus, er det nå mest brukt trombose modusl for små dyr in vivo studier. I tillegg har denne teknikken muligheten til å indusere dannelsen av tromber i en rekke fartøyer. Target fartøy kan være arterier eller vener med stor diameter (carotis, femoral, vena cava) eller liten diameter (mesentery, cremaster) ^12-14. Mer nylig ble det også brukt på den proksimale midtre cerebral arterie for å utvikle en modell for slag ^15. Den trombose Formasjonen kan observeres direkte ved intravital mikroskopi etter fluorescerende merking av blodplater og leukocytter eller overvåkes ved måling av blodstrømmen reduseres med en temperatursonde eller en sonde Doppler ^12,16,17. Flere parametre som okklusjon tid, trombedannelse tid eller trombe størrelse kan deretter bli undersøkt. De fysiologiske forskjeller mellom karene undersøkt resultat i betydelige variasjoner i tromber oppnådd. Derfor etterforskere vanligvis velge målet fartøy i henhold til parametrene de ønsker å målere og / eller sykdommen sette de ønsker å undersøke. Vanligvis er modellen på halspulsåren mer relevant for forskning på aterotrombose relatert til hjerteinfarkt eller hjerneslag mens studier på vena cava er mer relevant for forskning på dyp venetrombose. Tilgjengeligheten av de forskjellige fartøyene bestemmer også den metoden som brukes til å måle tromben vekst. For eksempel, den mesenteriske fartøyene er lett tilgjengelige, noe som gjør denne modellen godt egnet for intra mikroskopisk observasjon og studiet av dynamikken i trombedannelse. Halspulsåren er mindre tilgjengelig, men større slik at blodstrømsmåling og gir en utmerket modell for å studere okklusivt trombose.

Den jernklorid indusert trombose modellen har gitt enorm fremgang i forståelsen av denne patologi. Det har blitt brukt i mange studier som fokuserer på rollen til von Willebrand-faktor i trombose formasjonen ^18,19. Kombinert med genetisk modifikasjons- teknikker, har det tillatt identifisering av mange bestemt gen involvert i blodpropp. Lamrani et al. for eksempel har vist at en knock-in av JAK2 ^V617F genet er assosiert med en akselererende dannelse av ustabile blodpropp ^20. Zhang et al. Har undersøkt den fysiologiske implikasjon av P2Y12 blodplate-reseptoren og viste at transgene mus som overuttrykker spesielt denne reseptoren på blodplater bare, viste en raskere og mer stabil trombedannelse i mesenterisk arterie skadet med _FeCl3 ^21. Det avgjørende rolle Tissue-type plasminogen aktivator (tPA) og urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) i fibrin nedbrytningsprosessen er også blitt undersøkt på denne måten ^22. Videre denne modellen gir også en enkel og nøyaktig måte å teste de fibrinolytiske kapasiteten til mange nye legemidler in vivo. For eksempel, har Wang et al. Benyttet denne modellen for the preklinisk validering av en roman rekombinant plasminogenaktivator rettet mot aktiverte plater ^23. Denne metoden har også gjort det mulig for validering av terapeutiske proteiner isolert fra spytt av flått, vampyrflaggermus, og mygg eller fra giften av slanger med spesifikk identifisering av målet ^24-27. Disse eksemplene viser allsidigheten av ferriklorid modell. I denne artikkelen fokuserer vi på to metoder og studere jernklorid indusert trombose på to forskjellige skipstype; mesenterisk fartøy og halspulsåren.

Protocol

Alle forsøk med dyr ble godkjent av Alfred Medical Research and Education Precinct Animal etiske komité (E / 1534/2015 / B). Alle kirurgiske manipulasjoner ble utført under full narkose og dyrene ikke opplever smerte på noe tidspunkt. Alle forsøk som er beskrevet er ikke-utvinning. 1. Forberedelse Skjær tynne bånd av filterpapir (1 mm x 2 mm). Tilbereder to oppløsninger av treverdig jernklorid på 4% (vekt / volum) og 6% (w / v) fortynnet i avionisert vann. Forbe…

Representative Results

Det fluorescerende intravital mikroskopi observasjon av mesenteriet vil avdekke akkumulering av Rhodamine 6G merkede blodplater og leukocytter langs karveggen skadet av FeCl3. Den progressive dannelse av en partiell trombe blir overvåket på en 200 um mesenteriet fartøy (figur 1). En trombe langsomt vises, og er klart identifiserbar etter det første minutt av eksponering for FeCl3 (figur 1, t = 60 sek). 40 sekunder etter fjernelse av filterpapir dynket med …

Discussion

Den jernklorid indusert trombose modellen er et utmerket verktøy for forskning. Som vist i denne studien, er det svært enkelt å implementere og når de brukes i kombinasjon med intramikroskopi eller Doppler strømningsmåler, gir det en god sanntidsovervåking av trombedannelse. Justering av tidseksponering og konsentrasjonen av _FeCl3, og tilbyr også muligheten for å fremstille enten ikke-okklusive eller okklusive tromber.

Imidlertid har denne metoden også noen begrensninger…

Materials

Whatman chromatography paper	GE Healthcare	3030917
Iron (III) chloride 40 % (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Inverted microscope	Olympus	IX81
Digital black-and-white camera	Olympus	XM10
Doppler flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow probe	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine (Rampun)	Bayer	75313
Petri dish	Sarstedt	82.1472
Insulin syringe (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Cotton tipped applicators	BSN medical	211827A
Dynek dysilk sutures	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Heating pad	Kirchner	T60