Introduction
El estudio de los mecanismos implicados en el desarrollo de la trombosis y la evaluación de la eficacia de los fármacos anti-trombóticos requiere bien establecido modelos animales experimentales. Modelos animales grandes fueron los primeros en ser utilizados ya que proporcionan grandes vasos más similar a los humanos que los roedores 1. Sin embargo, el alto costo, las grandes instalaciones requeridas y la dificultad para manipularlos genéticamente son los principales inconvenientes para su uso y animales grandes ahora se limitan a estudios preclínicos finales una vez que las pruebas preliminares sobre roedores han dado resultados concluyentes 2. Con amplia disponibilidad de cepas transgénicas y knockout y su pequeño tamaño que minimiza la cantidad de fármacos antitrombóticos requeridos para las pruebas in vivo, los ratones se utilizan principalmente para la investigación trombosis. Por lo tanto, se han desarrollado varios modelos de trastornos trombóticos en ratones 3.
Muchos modelos de trombosis establecidos interrumpen las intimuna capa de la pared del vaso, seguido por la exposición de la matriz extracelular sub endotelial para el flujo de sangre induciendo la formación de coágulos de sangre 4. El trombos puede resultar de la exposición del colágeno que desencadena la activación de las plaquetas y / o de la exposición de factor tisular que activa la cascada de coagulación 5. Se emplean a continuación varias técnicas para lograr la lesión inicial buque. Pierangeli et al. Desarrolló un modelo de rotura mecánica con una herramienta de microcirugía en la vena femoral 6. Kikushi et al. Describe un modelo que consiste en la administración de un compuesto reactivo foto (Rosa de Bengala) que se acumula en la bicapa lipídica de las células endoteliales, seguido de la excitación específica de la pared del vaso de interés con luz verde (540 nm) 7. La lesión también puede ser inducida por un corto de alta intensidad del láser de impulsos de iluminación 8. Otra técnica estableció en primer lugar en la arteria carótida de las ratasconsiste en la aplicación tópica de cloruro férrico (FeCl3) 9. En este caso, los resultados de denudación recipiente de radicales libres generados por FeCl 3 que hace que la peroxidación de lípidos y la destrucción de las células endoteliales 10. La lesión induce la expresión de varias moléculas de adhesión de activación adhesión y agregación plaquetaria, así como el reclutamiento de leucocitos. Se ha demostrado que los leucocitos, especialmente neutrófilos, juegan un papel crucial en la activación de la cascada de la coagulación de la sangre que lleva a la trombosis 11. Este método es muy adecuado para reproducir la cascada de la coagulación; los investigadores deben tener en cuenta que, en este modelo de ratón, la trombosis es típicamente inducida en vasos sanos mientras que la trombosis en los seres humanos ocurre principalmente en por ejemplo enfermo. vasos ateroscleróticos.
Como este modelo es muy simple de implementar y también es eficaz en ratones, ahora es el modo de trombosis utilizado principalmentel para pequeños animales en estudios in vivo. Además, esta técnica ofrece la posibilidad de inducir la formación de trombos en una variedad de vasos. Vasos de destino pueden ser arterias o venas de gran diámetro (carótida, femoral, la vena cava) o pequeño diámetro (mesenterio, cremaster) 12-14. Más recientemente, también se utiliza en la arteria cerebral media proximal para desarrollar un modelo de accidente cerebrovascular 15. La formación de trombosis puede ser observada directamente por microscopía intravital después del marcaje fluorescente de plaquetas y leucocitos o monitoreada midiendo la disminución del flujo sanguíneo con una sonda de temperatura o una sonda Doppler 12,16,17. Varios parámetros tales como el tiempo de oclusión, el tiempo de la formación de trombos o tamaño del trombo pueden entonces ser investigadas. Las diferencias fisiológicas entre los vasos investigaron resultado en variaciones significativas en los trombos obtenido. Por lo tanto, los investigadores suelen seleccionar el vaso diana de acuerdo con los parámetros que desean Measure y / o el ajuste que quieren investigar la enfermedad. Típicamente, el modelo de la arteria carótida es más relevante para la investigación en aterotrombosis relacionada con el infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular mientras que los estudios sobre la vena cava son más relevantes para la investigación de la trombosis venosa profunda. La accesibilidad de los diferentes vasos también determina el método utilizado para medir el crecimiento de trombos. Por ejemplo, los vasos mesentéricos son de fácil acceso haciendo que este modelo muy adecuado para la observación microscópica intravital y el estudio de la dinámica de la formación de trombos. La arteria carótida es menos accesible pero más grande que permitan a las mediciones de flujo de sangre y proporcionan un excelente modelo para estudiar la trombosis oclusiva.
El modelo de trombosis inducida por cloruro férrico ha proporcionado enormes progresos en la comprensión de esta patología. Se ha utilizado en muchos estudios centrados en el papel del factor von Willebrand en la formación de trombosis 18,19. Combinado con modificaciones genéticastécnicas ficación, que ha permitido la identificación de muchos genes específicos implicados en los trastornos trombóticos. Lamrani et al. por ejemplo han demostrado que un knock-in del gen JAK2 V617F se asocia con la formación de un coágulo de aceleración de la inestable 20. Zhang et al. Han investigado la implicación fisiológica del receptor plaquetario P2Y12 y demostrado que los ratones transgénicos que sobreexpresan específicamente este receptor en plaquetas solamente, muestran una formación de trombos más rápido y estable en la arteria mesentérica lesionado con FeCl 3 21. El papel crucial de activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA) y del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) en el proceso de degradación de la fibrina también ha sido investigado en este método 22. Además, este modelo también ofrece una manera sencilla y exacta de probar las capacidades de muchos fármacos fibrinolíticos novedosas in vivo. Por ejemplo, Wang et al., Han utilizado este modelo para THcorreo de validación preclínica de una novela del activador del plasminógeno recombinante dirigido contra las plaquetas activadas 23. Este método también permitió la validación de proteínas terapéuticas aisladas a partir de la saliva de garrapatas, murciélagos vampiro, y mosquitos o a partir del veneno de serpientes con la identificación específica del objetivo 24-27. Estos ejemplos demuestran la versatilidad del modelo de cloruro férrico. En este artículo, nos centramos en dos métodos y estudiamos cloruro férrico trombosis inducida en dos tipo de buque diferentes; buque mesentérica y la arteria carótida.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Medical Research Alfred y Comité de Educación del Distrito Electoral Animal Ética (E / 1534/2015 / B). Todas las manipulaciones quirúrgicas se realizaron bajo anestesia total y los animales no experimentan dolor en cualquier etapa. Todos los experimentos descritos son la no recuperación.
1. Preparación
- Cortar bandas delgadas de papel de filtro (1 mm x 2 mm).
- Recién preparar 2 soluciones de cloruro férrico de 4% (w / v) y 6% (w / v) diluido en agua desionizada. Prepare la solución de rodamina 6G 0,3% en PBS, se filtra a través de 0,22 micras.
- Corte un pedazo pequeño (5 mm x 1 cm) de la envoltura de plástico blanco de jeringa.
2. Mesenterio Arteriola formación de trombos Observado por Microscopia intravital
- Pesar un 10-12 semanas de edad C57BL / 6 de tipo salvaje del ratón y en consecuencia anestesiar con una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg), aunque la inyección intraperitoneal. Supervisar la profundidad de la anestesia por la respuesta a los pies, la cola y / o pellizco de piel, la reactividad de pellizco córnea y los párpados, y la ausencia de movimiento bigotes. Si es necesario, inyectar una segunda dosis de ketamina (50 mg / kg) para mantener la anestesia del animal. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Coloca el ratón en una pequeña placa de Petri colocado sobre una almohadilla eléctrica ajustada a 37 ° C.
NOTA: Aunque la inyección IP puede resultar en dolor para los animales, la duración de este malestar será mínimo (menos de 3 segundos). El dolor y las molestias asociadas con las inyecciones se reducirán al mínimo mediante el uso de personal experimentado y competente y tamaño de la aguja apropiada (25 G). Después de todos los procedimientos, la eutanasia de todos los animales utilizando una sobredosis de ketamina y xilazina seguido por dislocación cervical. - Realizar una incisión en la línea media abdominal de aproximadamente 3 cm en la piel y cortar cuidadosamente el peritoneo.
- Coloque el ratón en el lado de la mascotaplato ri, exteriorizar suavemente sus intestinos y se extendió cuidadosamente el mesenterio con 2 bastoncillos de algodón para llevar un recipiente adecuado a la superficie de la placa de Petri. Seque bien con un limpiador delicado.
NOTA: Para limitar el movimiento de los vasos mesentéricos, papaverina puede usarse para inhibir la peristalsis intestinal. - Remojar la cola del ratón en agua caliente para dilatar los vasos e inyectar 30 l de Rodamina 6G (0,3%) en la vena de la cola del ratón con una jeringa de 29 G para etiquetar los leucocitos y las plaquetas.
- Coloque la placa de Petri bajo un microscopio invertido y se centran en la arteriola elegido utilizando el canal de campo claro.
- Remojar una banda de papel de filtro con 6% (w / v) de cloruro de hierro (III) y aplicar el papel de filtro en la arteriola con dos pinzas; la primera en celebrar el papel de filtro, el segundo para presionar suavemente sobre el área de interés. Observar la formación de trombos en el primero 10 seg después de la deposición del papel de filtro.
NOTA: Es muy commpor lo tanto, a dañar la microvasculatura rodeado y la precisión de la deposición del papel de filtro y la presión suavemente es importante limitar este problema. - Observar la formación de trombos por microscopía de fluorescencia (canal TRITC: excitación pico de 557 nm, pico de emisión 576 nm), a través del papel de filtro. Por lo tanto, observar los leucocitos y las plaquetas circulantes que han tenido hasta la Rodamina 6G y su agregación en el trombo es fácil de identificar.
- Toma el papel de filtro después de 1 min de exposición al cloruro de hierro (III) y continuará supervisando la formación del trombo. Lave el recipiente con PBS.
- Observar y registrar la formación dinámica del trombo se destaca con el etiquetado de las plaquetas y leucocitos con la Rodamina 6G. Capturar las imágenes y medir el tamaño del trombo. Las imágenes que aquí se presenta se obtuvieron con un microscopio intravital invertida, aunque un objetivo 4X, en el canal de fluorescencia TRITC.
- Fespués de todos los procedimientos, la eutanasia del animal utilizando una sobredosis de ketamina y xilazina seguido por dislocación cervical.
3. carótida trombo Arteria Formación evaluados por Sangre Medición de Velocidad de Flujo
- Pesar un 10-12 semanas de edad C57BL / 6 de ratón y en consecuencia anestesiar con una mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg), aunque la inyección intraperitoneal. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
- Fijar el ratón bajo un microscopio quirúrgico con cinta adhesiva en las piernas, en una almohadilla eléctrica ajustada a 37 ° C.
- Hacer una pequeña almohada de un limpiador y la cinta bajo la cabeza del ratón para elevar la cabeza ligeramente. Utilice un bucle de hilo con pinzas para sacar el hocico hacia abajo (utilizar dientes superiores). Esto expondrá la región de la arteria carótida para un fácil acceso.
- Realizar una pequeña 5 mm de profundidad de la incisión de la piel directamente debajo de la mandíbula, hasta el esternón.
- Diseccionar la fascia y aislar un fragmento de cualquiera de la arteria carótida común izquierda o hacia la derecha por encima de la bifurcación.
- Introducir cuidadosamente pinzas en-entre la arteria y el nervio para separarlos. No molestar el nervio corriendo cerca de la arteria y evitar tocar demasiado de la arteria carótida como fuere causa daños a la embarcación. Aislar una sección de un menos 5 mm de la arteria.
- Seque el área de la arteria correctamente con limpiaparabrisas para evitar que cualquier líquido interfiere con el FeCl3.
- Ponga la pequeña pieza de plástico blanco debajo de la parte aislada de la carótida común por lo que el FeCl3 no sumergirse en los tejidos circundantes. Para este propósito, utilizar un segundo fórceps para llevar la pieza a la primera uno luego lentamente deslice el papel de plástico debajo de la arteria.
- Remojar un trozo de papel de filtro con 4% (w / v) o 6% (w / v) de cloruro férrico y lo coloca todo alrededor de la arteria.
- Después de 3 minutos de exposición, despegar el papel de filtro, enjuagar con PBS y seque el área wlimpiaparabrisas i.
- Coloque la sonda de flujo Doppler en todo el buque en la zona lesionada y empezar a grabar los cambios en el flujo. En la carótida común saludable de ratones adultos, el flujo es por lo general alrededor de 1 ml / min. ¡Precaución! el contacto de la sonda con cloruro férrico dañará la sonda por lo que cualquier contacto debe evitarse. Los datos presentados en este documento se obtuvieron con un metro Transonic System Inc. Flow, TS420 módulo perivascular equipado con una sonda de flujo Doppler Nano 0.5 PBS.
NOTA: La concentración de cloruro férrico puede modificar la cinética de la formación de trombos resultantes en diferentes momentos de oclusión. Por lo tanto, la exposición a un 6% (w / v) de cloruro férrico da una oclusión más rápida que la exposición al 4% (w / v) de cloruro férrico. - Después de todos los procedimientos, la eutanasia de todos los animales mediante una sobredosis de ketamina y xilazina seguido por dislocación cervical y limpiar cuidadosamente la sonda Doppler.
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Representative Results
El fluorescente observación microscopía intravital del mesenterio revelará la acumulación de Rodamina 6G etiquetado plaquetas y leucocitos lo largo de la pared de los vasos lesionados por FeCl3. La formación progresiva de un trombo parcial se supervisa en un recipiente mesenterio 200 micras (Figura 1). Un trombo aparece lentamente y es claramente identificable después de la primera minutos de exposición a FeCl 3 (Figura 1, t = 60 seg). 40 seg después de la eliminación del papel de filtro empapado con FeCl 3, la trombosis progresa rápidamente y es finalmente presente en la pared de toda la sección buque observado (Figura 1, t = 100 seg).
Figura 1:. El crecimiento del trombo Observado por Microscopia intravital fluorescente en un buque Mesenterio imágenes fueron tomadas a los 15 seg, 60seg y 100 seg después de la deposición del papel de filtro empapado con 6% (w / v) FeCl solución 3. El papel de filtro se retiró después de 60 seg de exposición. Los leucocitos y las plaquetas se marcaron a través de pre-inyección de Rodamina 6G (0,5% w / v). Las flechas rojas indican plaquetas / leucocitos agregados. Barra de escala 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Un trombo intra-carótida es inducida por la aplicación de un papel de filtro empapado en FeCl solución 3 alrededor de una arteria carótida aislada y los cambios en el flujo de sangre aguas abajo de la lesión se registra con una sonda de flujo Doppler (Figura 2). Un flujo constante de sangre en general alrededor de 1,1 ml min se mide en la arteria carótida no lesionados /. Después de una exposición de 3 min de la vasija con un papel de filtro empapado en 4% (w / v) FeCl solución 3, un trombo oclusivo es Obtained con un tiempo de oclusión de 13 min y 30 seg después del comienzo de la exposición. Después de una exposición de 3 min con un papel de filtro empapado en 6% (w / v) FeCl 3, un trombo oclusivo se obtiene con un tiempo de oclusión de 9 min y 30 seg después del comienzo de la exposición.
Figura 2. Representante Grabaciones de flujo sanguíneo a través de la arteria carótida después de FeCl 3 Lesión. El flujo de sangre se midió con una sonda de flujo Doppler colocada en la arteria carótida justo aguas abajo del papel de filtro empapado con 4% (w / v) o 6% ( w / v) FeCl 3. El papel de filtro se retiró después de 3 minutos de exposición. Como el flujo de sangre de control se obtuvo mediante la medición de la arteria carótida saludable.
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Discussion
El modelo de trombosis inducida por cloruro férrico es una excelente herramienta de investigación. Como se muestra en este estudio, es extremadamente fácil de implementar y cuando se utiliza en combinación con microscopía intravital o medidor de flujo Doppler, que proporciona un buen seguimiento en tiempo real de la formación de trombos. Ajuste del tiempo de exposición y la concentración de FeCl 3, sino que también ofrece la posibilidad de producir ya sea trombos no oclusivos o oclusivos.
Sin embargo, este método también tiene algunas limitaciones. En la arteria carótida, el principal inconveniente es que, aunque el tiempo de oclusión efectivamente puede ser modificado, la reproducibilidad de la modelo sigue siendo demasiado débil para controlar con precisión el tamaño del trombo y la tasa de crecimiento 10. Varios grupos han trabajado en una estandarización del modelo de 28,29. Owens et al. sugirieron que el tiempo de oclusión fiable y reproducible puede obtenerse con la práctica y por la reducción de todos los factores de variación tales como la edad delos ratones, los antecedentes genéticos de los ratones, la anestesia utilizada, la técnica para la exposición de cloruro férrico y la concentración de la solución de cloruro férrico 28. La sonda Doppler en sí también tiene algunas limitaciones con un cierto grado de la señal de fondo presente que puede afectar a la determinación de la oclusión. El flujo de sangre también puede ser alterada por la formación de trombos inestable.
En el recipiente de mesentérica, la reproducibilidad puede verse afectada por el tamaño de la embarcación que varía más de las arterias carótidas y la presencia de grasa que puede disminuye la extensión de la lesión. Se ha informado de que los trombos obtenido difiere de acuerdo con el tamaño de la lesión pared del vaso que puede contener al endotelio vertimiento o también afectan a las células musculares lisas de la capa de medios de comunicación 30. El modelo de irradiación láser constituye una buena alternativa del modelo de cloruro férrico que proporciona una mejor reproducibilidad 8. Sin embargo, se limita a los pequeños vasos que son lo suficientemente transparente para permitir la penetración del láser. Cabe también se dio cuenta de que en este modelo, las células endoteliales se destruyen después de la aplicación de cloruro férrico y por lo tanto no es adecuado para estudios sobre el papel de las células endoteliales. Sin embargo, es posible sustituir el cloruro férrico por ionóforo de calcio para obtener una lesión más débil, restringido a la activación del endotelio 31.
Otra limitación de este modelo es que no es adecuado para estudiar la evolución a largo plazo de la enfermedad. Para cumplir este requisito, Boulaftali et al. Han desarrollado cámaras de los pliegues cutáneos dorsal que permiten el seguimiento de la misma trombo durante varias semanas 32. Esta técnica es especialmente adecuado para examinar los efectos de los fármacos trombolíticos de acuerdo con la madurez de trombos. En este estudio, el envejecimiento coágulo se encontró a deteriorar la acción lítica de una forma recombinante de tissue activador del plasminógeno, que actualmente es el estándar de oro de los fármacos trombolíticos para uso humano.
A pesar de algunos inconvenientes que deben ser tomados en consideración, el modelo FeCl3 es relevante para el estudio de la trombosis humano. La composición de los trombos obtenido se ha analizado en la sección histológica y la presencia de plaquetas, fibrina y células rojas de la sangre han sido identificados en los trombos intra-carótida 33. Además, puesto que se supone trastorno aterotrombótico ser iniciado por la oxidación de las lipoproteínas, la inducción de la lesión del vaso, aunque una reacción oxido-reducción del modelo de FeCl 3 es más probable para imitar la fisiopatología de la enfermedad humana que un mecánico, foto-química o con láser inducida por la lesión 34.
El trombo formado aunque cloruro férrico también se ha descrito para ser sensible a tanto anticoagulante y drogas anti-plaquetas. La heparina y clopidogrel, por ejemplo, han sido representanteorted para extender el tiempo de oclusión de trombos formados en la arteria carótida 29. La administración de una forma recombinante de hirudina ha prolongado significativamente el tiempo de la formación de trombos en la microvasculatura 17 mesenterio. Por lo tanto, el modelo de cloruro férrico ofrece excelentes perspectivas en la trombosis y es una herramienta de gran importancia para la validación preclínica de nuevos trombolíticos, anticoagulantes y antiagregantes plaquetarios.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo técnico de la Alegría Yao y el Dr. Karen Alt, así como la financiación de la NHMRC y NHF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40% (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
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