Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

गैर समेकित करने Episomal प्लास्मिड का उपयोग करते हुए जमे हुए बफी कोट से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Published: June 5, 2015 doi: 10.3791/52885
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 1, 1
1Center for Biomedicine, European Academy Bozen/Bolzano (EURAC), 2Laboratory of Medical Genetics, Fondazione IRCCS Ca´ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 3Del E. Webb Center for Neuroscience, Aging & Stem Cell Research, Sanford-Burnham Medical Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) नैदानिक ​​अनुप्रयोगों और बुनियादी अनुसंधान के लिए रोगी विशेष के ऊतकों का एक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ, हम गैर समेकित करने episomal प्लास्मिड का उपयोग कर वायरल से मुक्त IPSCs में जमे हुए Buffy कोट से प्राप्त मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) reprogram करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

दैहिक कोशिकाओं चार प्रतिलेखन कारक (अक्टूबर-4, सॉक्स -2, KLF-4, और सी-Myc) की अभिव्यक्ति के लिए मजबूर द्वारा प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) में reprogrammed किया जा सकता है, आम तौर पर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से (hESCs) व्यक्त । कारण hESCs के साथ उनकी समानता के लिए, IPSCs hESCs के साथ जुड़े नैतिक मुद्दों से परहेज संभावित रोगी-विशिष्ट पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गए हैं। नैदानिक ​​आवेदन के लिए उपयुक्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, transgene मुक्त IPSCs transgene पुनर्सक्रियन, बदल जीन अभिव्यक्ति और पथभ्रष्ट भेदभाव से बचने के लिए उत्पन्न होने की जरूरत है। इसके अलावा, एक अत्यंत कुशल और सस्ती reprogramming के विधि चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए पर्याप्त IPSCs प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इस जरूरत को देखते हुए, एक कुशल गैर समेकित करने episomal प्लाज्मिड दृष्टिकोण IPSC व्युत्पत्ति के लिए बेहतर विकल्प है। वर्तमान में reprogramming के उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल सबसे आम प्रकार की कोशिका fibroblasts हैं, अलगाव, जिनमें से एक मैं ऊतक बायोप्सी की आवश्यकता है,रोगी के लिए nvasive शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया। इसलिए, मानव परिधीय रक्त IPSC पीढ़ी के लिए सबसे सुलभ और कम से कम इनवेसिव ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है।

इस अध्ययन में, गैर समेकित करने episomal प्लास्मिड का उपयोग कर एक लागत प्रभावी और वायरल से मुक्त प्रोटोकॉल पूरे रक्त बाद centrifugation और घनत्व ढाल जुदाई के बिना जमे हुए Buffy कोट से प्राप्त मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) से IPSCs की पीढ़ी के लिए सूचना दी है।

Introduction

2006 में, Shinya यामानाका 1 के समूह वयस्क चूहों और इंसानों से दैहिक कोशिकाओं चार reprogramming के कारकों (अक्टूबर-4, सॉक्स -2, KLF-4, और अस्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा एक pluripotent राज्य में परिवर्तित किया जा सकता है कि पहली बार के लिए प्रदर्शन सी-Myc), तथाकथित प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) 2 सृजन। रोगी-विशिष्ट IPSCs बारीकी आकृति विज्ञान, प्रसार और तीन-जनन कोशिका प्रकार (mesoderm, अन्तर्जनस्तर और बाहरी झिल्ली) में अंतर करने की क्षमता के संदर्भ में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) सदृश hESCs और दरकिनार के उपयोग से जुड़े नैतिक चिंताओं की कमी है, जबकि संभव प्रतिरक्षा अस्वीकृति 3। इस प्रकार, IPSCs बुनियादी अनुसंधान, दवा स्क्रीनिंग, रोग मॉडलिंग, विषाक्तता का मूल्यांकन, और पुनर्योजी चिकित्सा प्रयोजनों के लिए 4 रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं के सबसे महत्वपूर्ण स्रोतों में से एक के रूप में दिखाई देते हैं।

कई दृष्टिकोण IPSC पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया है: वायरल को एकीकृत वैक्टर(रेट्रोवायरस 5, lentivirus 6), वायरल गैर समेकित करने वैक्टर (adenovirus 7), सेंडाइ वायरस 8, बीएसी transposons 9, episomal वैक्टर 10, प्रोटीन 11 या आरएनए वितरण 12। वायरस की मध्यस्थता तरीकों का उपयोग उच्च दक्षता reprogramming के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, वायरल वैक्टर मेजबान कोशिकाओं और इसलिए संभावित यादृच्छिक insertional उत्परिवर्तजनन के जीनोम में एकीकृत, भेदभाव के दौरान जीन अभिव्यक्ति, और खामोश transgenes की पुनर्सक्रियन की स्थायी परिवर्तन 13 से बहिष्कृत नहीं किया जा सकता।

पुनर्योजी चिकित्सा के लिए IPSCs सुरक्षित बनाने के लिए, प्रयास सेलुलर जीनोम में बहिर्जात डीएनए के एकीकरण के बिना IPSCs प्राप्त करने के लिए बनाया गया है। उत्पाद शुल्क योग्य वायरल वैक्टर और transposons विकसित किया गया है, यद्यपि यह अनिवार्य रूप से छांटना के बाद transduced कोशिकाओं में रहते हैं, और अभिव्यक्ति transposase जो कम वेक्टर दृश्यों, सेल में परिवर्तन उत्पन्न कर सकता है कि क्या अभी भी स्पष्ट नहीं हैular 13 कार्य करते हैं। इसकी उच्च reprogramming दक्षता के बावजूद, सेंडाइ वायरस translational अध्ययन में अपने आवेदन को सीमित करने की क्षमता है इस प्रणाली विकसित की है कि कंपनी के साथ एक महंगी दृष्टिकोण और पहुंच के माध्यम से लाइसेंस की चिंताओं का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, प्रोटीन और शाही सेना के प्रत्यक्ष परिचय के लिए की जरूरत है इस का परिचय निहित तकनीकी सीमाओं के साथ अणुओं reprogramming के कई डिलीवरी की आवश्यकता है, और समग्र reprogramming दक्षता 14 बहुत कम है। ध्यान से, episomal प्लास्मिड के उपयोग पर आधारित लागत प्रभावी वायरल स्वतंत्र और गैर समेकित करने के तरीकों को सफलतापूर्वक त्वचा fibroblasts के 15 के reprogramming के लिए सूचित किया गया है। पहले से 10,15 रिपोर्ट के रूप में विशेष रूप से, वर्तमान कार्य में हम वाणिज्यिक उपलब्ध एकीकरण मुक्त episomal प्लास्मिड का उपयोग करने का फैसला किया।

तिथि करने के लिए, त्वचा fibroblasts के सबसे लोकप्रिय दाता सेल प्रकार 5 का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अन्य सेल के सूत्रों के उत्तराधिकारी किया गया हैsfully केरेटिनकोशिकाओं 16, अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम सेल 17, वसा stromal कोशिकाओं 18 सहित IPSCs में reprogrammed, हेयर 19 के रोम, और दंत लुगदी कोशिकाओं 20। इन कोशिकाओं के अलगाव शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता है, और कई हफ्तों के एक प्राथमिक सेल संस्कृति की स्थापना के क्रम में इन विट्रो सेल विस्तार के लिए आवश्यक हैं।

इस रोशनी में, सेल प्रकार शुरू करने के चयन के लिए महत्वपूर्ण है और यह इस तरह के खून के रूप में आसानी से सुलभ और कम आक्रामक ऊतकों से IPSCs उत्पादन करने में सक्षम होने के लिए भी उतना ही महत्वपूर्ण है। दोनों गर्भनाल रक्त कोशिकाओं mononuclear (CBMNCs) 21,22 और परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) 14,22-24 IPSCs की व्युत्पत्ति के लिए कोशिकाओं के उपयुक्त स्रोतों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

वयस्क PBMNC reprogramming की दक्षता CBMNCs 22 की तुलना में 20-50 गुना कम है, वे नमूना उद्देश्य के लिए सबसे सुविधाजनक सेल प्रकार रहते हैं। मेंतथ्य यह है, PBMNC नमूना न्यूनतम आक्रामक होने का लाभ है, और इसके अलावा, इन कोशिकाओं reprogramming के प्रयोगों से पहले इन विट्रो में व्यापक विस्तार की आवश्यकता नहीं है। तिथि करने के लिए, अलग प्रोटोकॉल घनत्व ढाल जुदाई के बाद PBMNCs जमे हुए हैं और thawed दिनों कई महीनों के बाद ठंड और IPSCs 22,23 में reprogramming से पहले कुछ दिनों के लिए विस्तारित किया जा सकता है कि सूचना दी है। फिर भी, जहाँ तक हम कोई रिपोर्ट नहीं जमी Buffy कोट से PBMNCs के reprogramming का वर्णन किया है के बारे में पता कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, घनत्व ढाल जुदाई के बिना एकत्र जमी बफी कोट इस प्रकार आगे नमूना संग्रह से बचा जाता है कि IPSC उत्पादन के लिए सामग्री की एक आसानी से सुलभ पूल का प्रतिनिधित्व करने, जनसंख्या अध्ययन से बड़े पैमाने पर biobanks में संग्रहीत सबसे आम रक्त के नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

इस के साथ साथ हम एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 22 के आधार पर, मानव जमी Buffy कोट से पहली बार के लिए वायरल से मुक्त IPSCs की पीढ़ी की रिपोर्ट। मेंइसके अलावा, IPSCs गैर घनत्व ढाल शुद्ध PBMNC परिणामों के लिए एक नियंत्रण प्रोटोकॉल के रूप में, घनत्व ढाल जुदाई के बाद प्राप्त जमी PBMNCs से उत्पन्न किया गया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMNCs) के बाद सूचित सहमति और दक्षिण टायरॉल के प्रांत की नैतिक समिति के अनुमोदन पर हस्ताक्षर किए स्वस्थ दाताओं के मानव परिधीय रक्त के नमूनों से अलग थे। प्रयोगों से हेलसिंकी की घोषणा में व्यक्त सिद्धांतों के अनुसार आयोजित की गई। सभी डेटा एकत्र की है और गुमनाम रूप से विश्लेषण किया गया।

परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear 1. अलगाव (PBMNCs)

  1. PBMNCs घनत्व ढाल जुदाई के बिना, पूरे रक्त बाद centrifugation Buffy कोट से प्राप्त की।
    1. एक सोडियम साइट्रेट में शिरापरक परिधीय रक्त के 8 एमएल लीजिए आर टी (25 डिग्री सेल्सियस) पर प्लास्टिक ट्यूब, और दुकान बफर। संग्रह के बाद 12 घंटे के भीतर प्रक्रिया खून।
    2. स्विचिंग बंद अपकेंद्रित्र ब्रेक, एक झूलते बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    3. बादल छाए रहेंगे buffy कोट (ऊपरी प्लाज्मा चरण और कम के बीच परत लीजिएचरण एक cryovial ट्यूब में समृद्ध PBMNC अंश (500 μl) युक्त,) एरिथ्रोसाइट्स के सबसे युक्त।
    4. 10% DMSO के एकाग्रता के साथ 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा को प्राप्त करने के क्रम में 90% FBS और 20% DMSO युक्त 2x ठंड मध्यम, के 500 μl के साथ buffy कोट के 500 μl Resuspend।
    5. -80 डिग्री सेल्सियस पर एक नियंत्रित दर ठंड कंटेनर में शीशी रुक। लंबी अवधि के लिए तरल नाइट्रोजन में स्टोर कोशिकाओं।
  2. PBMNCs घनत्व ढाल जुदाई के बाद प्राप्त
    1. एक सोडियम साइट्रेट में शिरापरक परिधीय रक्त के 12 मिलीलीटर लीजिए आरटी पर प्लास्टिक ट्यूब, और दुकान बफर। संग्रह के बाद 12 घंटे के भीतर प्रक्रिया खून।
    2. 35 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ खून पतला।
    3. ध्यान से और धीरे-परत एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में (घनत्व ढाल अलग होने के लिए प्रयोग किया जाता) polysucrose समाधान (पी = 1.077) के 15 मिलीलीटर पर पतला रक्त का 35 मिलीलीटर (अनुपात 3: 1)।
    4. आरटी पर 30 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूबएक झूलते बाल्टी रोटर, स्विचिंग बंद अपकेंद्रित्र ब्रेक।
    5. ऊपरी, पीले चरण युक्त प्लाज्मा Aspirate और यह त्यागें। ध्यान से, एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब PBMNCs युक्त अपारदर्शी सफेद interphase परत हस्तांतरण।
    6. बाँझ पीबीएस के साथ 30 मिलीलीटर कुल मात्रा लाने और आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
    7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 30 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend। Trypan नीले बहिष्कार 25 के आधार पर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना।
    8. अपकेंद्रित्र PBMNCs आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और यह त्यागें।
    9. 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 90% FBS और 10% DMSO युक्त ठंड मध्यम का एक उचित मात्रा में सेल गोली Resuspend।
    10. विभाज्य 1 मिलीलीटर प्रति शीशी (लगभग 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) और कम से कंटेनर ठंड एक नियंत्रित दर में शीशी फ्रीज - 80 डिग्री सेल्सियस। लंबी अवधि के लिए तरल नाइट्रोजन में स्टोर कोशिकाओं।

    2. विगलन और PBMNCs के चढ़ाना (0 दिन)

    1. PBMNCs घनत्व ढाल जुदाई के बिना, पूरे रक्त बाद centrifugation Buffy कोट से प्राप्त की।
      1. जमे हुए Buffy कोट से PBMNCs का उपयोग कर प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कोशिकाओं के 1 शीशी पिघलना और 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ buffy कोट पतला।
      2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पतला buffy कोट स्थानांतरण लाल सेल बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ने और आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
      3. लाल, सेल बफर के 500 मिलीलीटर की तैयारी पोटेशियम बाइकार्बोनेट की 0.5 ग्राम, अमोनियम क्लोराइड की 4.145 ग्राम, ultrapure पानी की 500 मिलीलीटर, पीएच 7.2-7.4 0.5 एम EDTA समाधान के 100 μl जोड़ें।
      4. बाँझ पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर कुल मात्रा लाने और आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
      5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बाँझ पीबीएस के 50 मिलीलीटर के साथ गोली धोने, आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर buffy कोट अपकेंद्रित्र।
      6. में कोशिकाओं ResuspendIMDM और हाम के एफ 12 (अनुपात 1: 1), इंसुलिन transferrin-सेलेनियम ethanolamine (आईटीएस-एक्स), रासायनिक का 1% से 1% परिभाषित लिपिड ध्यान लगाओ PBMNC माध्यम से 1 मिलीलीटर, के रूप में पहले से बना है, 22 में वर्णित (सीडीएल), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, एल-एस्कॉर्बिक एसिड की 0.005%, गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) का 0.5%, 1-Thioglycerol (अंतिम एकाग्रता 200 माइक्रोन), सेल फैक्टर एस सी एफ (100 एनजी / एमएल) का तना, इंटरल्युकिन -3 आईएल 3 (10 एनजी / एमएल), एरिथ्रोपीटिन ईपीओ (2 यू / एमएल), इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर आईजीएफ -1 (40 एनजी / एमएल), Dexamethasone (1 माइक्रोन) और Holo-transferrin (100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर )।
      7. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर, कोटिंग के बिना, मानक टिशू कल्चर इलाज सतह के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में उन्हें हस्तांतरण। बदलते मध्यम चरण तक (धारा 3 देखें), 37 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटे के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
    2. PBMNCs घनत्व ढाल जुदाई के बाद प्राप्त
      1. बाद जमे हुए PBMNCs का उपयोग कर प्रोटोकॉल शुरू करने के लिएघनत्व ढाल जुदाई, पिघलना 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कोशिकाओं के 1 शीशी, PBMNC माध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को हस्तांतरण। आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
      2. PBMNC माध्यम से 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर, एक 12 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में उन्हें हस्तांतरण। बदलते मध्यम चरण तक (धारा 3 देखें), 37 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटे के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।

    3. संस्कृति और PBMNCs का विस्तार (दिन 2-13)

    1. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में, 1 मिलीलीटर टिप के साथ एक विंदुक का उपयोग, निलंबन संस्कृति में PBMNCs लीजिए।
    2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा PBMNC माध्यम से 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
    3. कोटिंग के बिना, मानक टिशू कल्चर इलाज सतह के साथ 12 अच्छी तरह से थाली में से 1 कुएँ में कोशिकाओं स्थानांतरण, और एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में उन्हें सेते हैं।

    Episomal plasmids के साथ PBMNCs 4. अभिकर्मक (14 दिन)

    नोट: चार वाणिज्यिक intergation मुक्त episomal plasmids के अलगाव प्रदर्शन करना प्लाज्मिड शुद्धि के लिए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर pluripotency जीन ले जाने और एक agarose जेल विश्लेषण का उपयोग कर शुद्ध प्लास्मिड की गुणवत्ता का आकलन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार।

    1. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में PBMNCs लीजिए और 25 (trypan नीले बहिष्कार के आधार पर) व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती।
    2. अपकेंद्रित्र आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं।
    3. 100 Resuspension बफर टी के μl और प्रत्येक प्लास्मिड डीएनए के 1 माइक्रोग्राम युक्त अभिकर्मक मिश्रण में Resuspend 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं (p53 के खिलाफ OCT3 / 4 और shRNA ले जाने के एक प्लाज्मिड, एक प्लाज्मिड ले जाने Sox2 और KLF4, एकप्लाज्मिड एल MYC और LIN28 ले जाने, और एक प्लाज्मिड) अभिकर्मक दक्षता की जांच करने के लिए, EGFP ले जा।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक 100 μl टिप में कोशिकाओं से युक्त अभिकर्मक मिश्रण Aspirate और electroporation मशीन की पिपेट स्टेशन में रखा इलेक्ट्रोलिटिक बफर E2 की 3 मिलीग्राम से भरा ट्यूब में खड़ी नमूना, साथ पिपेट डालें।
    5. निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग कुशलतापूर्वक Electroporate कोशिकाओं: 1,650 वी, 10 मिसे, 3 दालों।
    6. 0.25 मिमी सोडियम butyrate (एनएबी), उनका कहना है पूर्व गर्म PBMNC मध्यम 2 मिलीलीटर में electroporated कोशिकाओं (2 एक्स 10 6 कोशिकाओं) Resuspend और 25 (trypan नीले बहिष्कार के आधार पर) electroporation प्रोटोकॉल के बाद व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती।
    7. कोटिंग के बिना 6 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में कोशिकाओं स्थानांतरण धीरे थाली रॉक और एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
    8. इलेक्ट्रोपोरेशन, देश के बाद दिनअभिकर्मक दक्षता का आकलन करने के क्रम में, 8-10 यादृच्छिक क्षेत्रों से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या टी।
    9. MEFs (धारा 6 देखें) पर उन्हें चढ़ाना, जब तक 3 दिनों के लिए बंटवारे के बिना ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को बनाए रखने।
    10. ताजा PBMNCs मध्यम 2 मिलीलीटर, प्लस 0.25 मिमी NAB हर दो दिन बदलें।

    5. सह संस्कृति के लिए फीडर कोशिकाओं के साथ व्यंजन तैयार (16 दिन)

    1. कोट 15 मिनट के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 1 एमएल के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं में 37 डिग्री सेल्सियस और FBS निहित 2 मिलीलीटर 10% के साथ अच्छी तरह / 2 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts थाली DMEM (MEF मध्यम) MEF फीडर कोशिकाओं पर electroporated PBMNCs passaging से एक दिन पहले।

    MEFs पर 6. चढ़ाना ट्रांसफ़ेक्ट PBMNCs दिन (17-19)

    1. 10 मिनट के लिए 300 XG पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र ट्रांसफ़ेक्ट PBMNCs में, 1 मिलीलीटर टिप के साथ एक विंदुक का उपयोग, निलंबन संस्कृति में PBMNCs लीजिएआरटी पर।
    2. मिमी NAB सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा PBMNC मध्यम 2 मिलीलीटर में गोली resuspend, प्लस 0.25।
    3. MEF लेपित 6 अच्छी तरह से थाली पर कोशिकाओं की थाली और एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।
    4. दो दिनों के बाद, मध्यम महाप्राण और DMEM (को-DMEM), 20% को-सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR), 1 मिमी NEAAs, 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 20 मिमी पीटकर से बना IPSC मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ की जगह एल Glutamine, 0.1 मिमी β-mercaptoethanol, 10 एनजी / एमएल FGF (बेसिक bFGF) और 0.25 मिमी NAB।
    5. ताजा IPSC मध्यम 2 मिलीलीटर हर दिन बदलें और दैनिक कोशिकाओं की जाँच करें।
      नोट: के बारे में दिन 22-25 में, IPSCs के पहले कालोनियों दिखाई जानी चाहिए।

    7. उठा और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के विस्तार (IPSCs) क्लोन (दिन 30-35)

    नोट: अभिकर्मक के बाद के बारे में 30-35 दिनों में, IPSC कालोनियों उठा और replating के लिए तैयार हो जाना चाहिए। reprogramming दक्षता esti होना चाहिएपहले से 26 के रूप में रिपोर्ट, IPSC कालोनियों / electroporated कोशिकाओं की कुल संख्या की संख्या के प्रतिशत के रूप में mated।

    1. IPSC कालोनियों passaging पहले दिन, एक 12 अच्छी तरह से थाली (1.25 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में MEF फीडर तैयार करते हैं।
    2. महाप्राण MEF मध्यम और 10 एनजी / एमएल bFGF और 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ IPSC माध्यम के 1 एमएल के साथ बदल जाते हैं। मैन्युअल, एक ग्रिड को प्राप्त करने के क्रम में उठा-हुड में विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे एक समय में एक सुई एक कॉलोनी के साथ काटना pipetting द्वारा छोटे गुच्छों को इकट्ठा करने और MEFs के साथ लेपित 12 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक उन्हें हस्तांतरण।
    3. आगे प्रसार के लिए 4: एक अनुपात 1 में फिर, 2 प्रत्येक 6 अच्छी तरह से थाली: पैसेज एक अनुपात 1 में 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक 12 अच्छी तरह से थाली का विस्तार और। काटना और फिर एक एंजाइम हदबंदी प्रक्रिया का उपयोग करें, (के रूप में अच्छी तरह से कदम 7.2 में वर्णित) पहले 2-3 मार्ग के लिए मैन्युअल रूप से IPSCs विस्तार (कदम 7.4 से शुरू)।
    4. एक एंजाइम हदबंदी प्रोटोकॉल के लिए, स्वच्छ IPSC coloniउठा-हुड में विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, विभेदित अंश aspirating द्वारा तों।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए collagenase चतुर्थ के 1 मिलीलीटर (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ IPSCs सेते हैं।
    6. एंजाइम समाधान aspirate KO-DMEM के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कालोनियों इकट्ठा। आरटी पर 2 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र।
    7. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, MEF लेपित 6 अच्छी तरह से थाली पर 10 एनजी / एमएल bFGF और 10 माइक्रोन वाई 27,632 और उन्हें थाली के साथ IPSC मध्यम 2 मिलीलीटर में कालोनियों resuspend (अनुपात 1: 4)।

    IPSCs 8. विशेषता (5-15 मार्ग के बीच)

    1. Alkaline फॉस्फेट धुंधला
      1. संस्कृति 10 एनजी / एमएल bFGF के साथ IPSC माध्यम में 3-5 दिनों के लिए IPSC कालोनियों।
      2. एक alkaline फॉस्फेट धुंधला प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए, पीबीएस के साथ एक बार IPSCs कुल्ला और फिर आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के 1 मिलीलीटर के साथ उन्हें ठीक।
      3. अवशिष्ट पीएफए ​​दूर करने के लिए, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
      4. का उपयोग करते हुए दाग तय कोशिकाओंनिर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक alkaline फॉस्फेट धुंधला किट।
    2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
      1. संस्कृति 10 एनजी / एमएल bFGF के साथ IPSC माध्यम में 3-5 दिनों के लिए IPSC कालोनियों।
      2. एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख शुरू करने के लिए, पीबीएस के साथ एक बार IPSCs धो लें और फिर आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के 1 मिलीलीटर के साथ उन्हें ठीक।
      3. अवशिष्ट पीएफए ​​दूर करने के लिए, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
      4. आरटी पर 1 घंटे के लिए 4% बकरी सीरम, 0.1% बीएसए, 0.1% ट्राइटन X-100 और 0.05% सोडियम azide युक्त समाधान अवरुद्ध permeabilization के 1 मिलीग्राम / (नेन 3) के साथ तय IPSCs समझो।
      5. अवरुद्ध समाधान Aspirate और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक 3% BSA में एंटीबॉडी और 0.05% नेन 3 समाधान हे / एन के साथ तय की कोशिकाओं को सेते (प्राथमिक एंटीबॉडी सूची के लिए सामग्री तालिका की जाँच करें और एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने कारक) का सुझाव दिया।
      6. अगले दिन, तो एलेक्सा Fluor 488 बकरी विरोधी माउस और एलेक्सा Fl के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, पीबीएस के साथ IPSCs तीन बार धोने37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए, 3% BSA और 0.05% नेन 3 समाधान में 1,000: uor 555 बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी, 1 पतला।
      7. पीबीएस के साथ तीन बार धोने के द्वारा पीछा अंधेरे में आरटी पर 10 मिनट के लिए DAPI (1μg / एमएल) के साथ नाभिक दाग।
    3. Embryoid निकायों में IPSCs का भेदभाव (ईबीएस)
      1. संस्कृति 10 एनजी / एमएल bFGF के साथ IPSC माध्यम में 5-6 दिनों के लिए IPSC कालोनियों।
      2. उठा-हुड में विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, aspirating द्वारा IPSC कालोनियों से विभेदित भागों निकालें।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए collagenase चतुर्थ के 1 मिलीलीटर (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ IPSCs सेते हैं।
      4. एंजाइम समाधान aspirate KO-DMEM के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कालोनियों इकट्ठा। आरटी पर 2 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र।
      5. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 2 KO-DMEM के रचित ईबी माध्यम की मिलीलीटर, 20% परिभाषित भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1 मिमी NEAAs, 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 20 मिमी एल glutamine, 0.1 मिमी में कालोनियों resuspend46, -mercaptoethanol।
      6. गोलाकार तीन आयामी embryoid निकायों (ईबीएस) के गठन की अनुमति देने के क्रम में, अल्ट्रा कम लगाव 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर 6 दिनों के लिए निलंबित किया IPSC कालोनियों थाली। ताजा ईबी मध्यम 2 मिलीलीटर हर दो दिन बदलें।
      7. 7 दिन पर, ईबीएस इकट्ठा करने और ईबी मध्यम 2 मिलीलीटर में 0.1% जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर उन्हें थाली और 20 दिनों के लिए भेदभाव में ईबीएस बनाए रखें।
      8. ताजा ईबी मध्यम 2 मिलीलीटर हर दो दिन बदलें।
    4. जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए QRT- पीसीआर
      1. संस्कृति 10 एनजी / एमएल bFGF के साथ IPSC माध्यम में 5-6 दिनों के लिए IPSC कालोनियों।
      2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर PBMNCs, IPSCs या ईबीएस से कुल शाही सेना निकालें।
      3. इस तरह 27 (ए 260 / ए 280 और ए 260 / ए 230 अनुपात> 1.8 के साथ उच्च गुणवत्ता आरएनए) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के उपयोग के रूप में उपयुक्त तरीके से शाही सेना एकाग्रता और पवित्रता का मूल्यांकन करें।
      4. चेकनिर्माता प्रोटोकॉल (उच्च गुणवत्ता शाही सेना RQI> 9.5) 28 के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर शाही सेना अखंडता।
      5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट का उपयोग कर कुल शाही सेना के 1 माइक्रोग्राम पर एक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं।
      6. सीडीएनए टेम्पलेट के 5 एनजी, 7.5 μl SYBR ग्रीन Supermix, 5 माइक्रोन प्राइमरों के 2 μl युक्त qPCR के मिश्रण तैयार करें (आगे: 1 μl और रिवर्स: 1 μl) और प्रत्येक प्रतिक्रिया 29 के लिए RNase / DNase मुक्त पानी के 6 μl।
      7. 45 के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम, 15 सेकंड और प्राइमर annealing और विस्तार चरण के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक विकृतीकरण कदम में विभाजित 40 चक्रों के बाद: निम्न प्रोग्राम का उपयोग कर QRT- पीसीआर सम्पन्न सेकंड 29।
      8. गृह व्यवस्था जीन 28 के रूप में GAPDH का उपयोग अन्य जीनों की अभिव्यक्ति मानक के अनुसार (1 टेबल में सूचीबद्ध प्राइमरों देखें)।
    5. qPCRTransgene बहिष्करण के लिए
      1. 50 मिमी Tris, 100 मिमी EDTA, 100 मिमी NaCl, युक्त lysis बफर के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर PBMNCs या IPSCs से डीएनए निकालने 1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) और 20 माइक्रोग्राम / एमएल Proteinase लालकृष्ण
      2. आरटी पर 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर डीएनए वर्षा और सेंट्रीफ्यूज की अनुमति देने के क्रम में तीन बार, 100% isopropanol के एक बराबर मात्रा (1 मिलीलीटर) जोड़ें उलटा द्वारा मिश्रण।
      3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें आरटी पर 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर 70% इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर के साथ डीएनए गोली धोने। महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें और RNase / DNase मुक्त पानी में यह resuspend।
      4. इस तरह 27 (ए 260 / ए 280 और ए 260 / ए 230 अनुपात> 1.8 के साथ उच्च गुणवत्ता आरएनए) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के उपयोग के रूप में उपयुक्त तरीके से डीएनए एकाग्रता और पवित्रता का मूल्यांकन करें।
      5. (: 1 μl और रिवर्स: 1 μl आगे) और 6 और डीएनए टेम्पलेट के 5 एनजी, 7.5 μl SYBR ग्रीन Supermix, 5 माइक्रोन प्राइमरों के 2 μl युक्त qPCR के मिश्रण तैयार करें# 181; प्रत्येक प्रतिक्रिया 29 के लिए RNase / DNase मुफ्त पानी के एल।
      6. (1 टेबल में सूचीबद्ध प्राइमरों देखें) गृह व्यवस्था जीन के रूप में 29 FBX-15 का उपयोग करते हुए विशिष्ट episomal प्लास्मिड EBNA -1 जीन की अभिव्यक्ति के मानक के अनुसार।
    6. कुपोषण विश्लेषण
      1. संस्कृति निर्माता के निर्देशों का पालन IPSCs के लिए एक वाणिज्यिक परिभाषित, फीडर से मुक्त रखरखाव मध्यम, साथ फीडर से मुक्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित थाली पर 5-6 दिनों के लिए IPSC कालोनियों।
      2. कुपोषण विश्लेषण प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए, एकल कोशिका पृथक्करण प्राप्त करने तक, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ IPSC कालोनियों अलग।
      3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र लीजिए।
      4. एक मध्यम 2 मिलीलीटर में Resuspend IPSCs विशेष रूप से प्रसव पूर्व निदान तकनीक के लिए संवर्धन कोशिकाओं के लिए विकसित की है। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित गिलास व्यंजन पर प्लेट एकल कोशिका IPSCs और, एक 37 डिग्री सेल्सियस में उन्हें सेते 5% सीओ 2 </ उप> इनक्यूबेटर।
      5. 2-4 दिनों के बाद, संस्कृतियों के लिए सीधे 10 μl / एमएल colchicine जोड़ सकते हैं और एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 3 घंटे के लिए सेते हैं।
      6. मध्यम Aspirate और आरटी पर 10 मिनट के लिए एक hypotonic समाधान (0.6% सोडियम साइट्रेट और 0.13% पोटेशियम क्लोराइड) के 1 मिलीलीटर में IPSCs सेते हैं।
      7. 5% एसिटिक एसिड समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला और मेथनॉल / एसिटिक एसिड समाधान के साथ IPSCs तय (अनुपात 3: 1) नियंत्रित तापमान और आर्द्रता के साथ एक मशीन में (28 डिग्री सेल्सियस, 42% आरएच)।
      8. विसर्जित कर दिया और अंधेरे में आरटी पर 15-20 मिनट के लिए Quinacrine समाधान के साथ दाग तय कोशिकाओं 30 (क्यू बैंडिंग प्राप्त करने के लिए)।
      9. 100X बढ़ाई 29 पर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत सेल metaphases मोल।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस अध्ययन में पूरे रक्त centrifugation और घनत्व ढाल जुदाई की सूचना दी है के बाद प्राप्त PBMNCs के reprogramming के साथ तुलना के बाद जमे हुए Buffy कोट से अलग PBMNCs के reprogramming के द्वारा वायरल से मुक्त IPSCs की पीढ़ी के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल। चित्रा 1 ए का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है विस्तृत प्रोटोकॉल। विगलन के बाद, एक ठेठ गोल आकार दिखा पृथक PBMNCs, 14 दिनों के लिए विशिष्ट रक्त संस्कृति मध्यम (चित्रा 1 बी) में विस्तार कर रहे हैं और उसके बाद episomal plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट। 10-15 दिनों के बाद अभिकर्मक, परिभाषित मार्जिन और भ्रूण स्टेम सेल की तरह आकृति विज्ञान के साथ छोटे गोल उज्ज्वल कालोनियों के बाद (चित्रा 1C) प्रदर्शित करने के लिए शुरू करते हैं। लगभग 20-30 दिनों अभिकर्मक के बाद, IPSC कालोनियों, तेज किनारों के साथ, बहुत कॉम्पैक्ट बन उनके आकार बढ़ाने के लिए और उठा और विस्तार (चित्रा -1) के लिए तैयार हैं। पहले passaging के चरणों (2-3 अंश) के बाद,IPSC कालोनियों उनके undifferentiated राज्य को बनाए रखने और एक ठेठ मानव भ्रूण स्टेम सेल आकृति विज्ञान दिखा। पहला अंश के दौरान, पुस्तिका उठा कॉम्पैक्ट, पूरी तरह से समान और कसकर बांध कालोनियों (आंकड़े 2A) का चयन करने के क्रम में हदबंदी एंजाइम की तुलना में एक अधिक कुशल विस्तार तरीका है। IPSC कालोनियों की बड़ी बढ़ाई कालोनियों के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं से पता चलता है और कोशिका द्रव्य अनुपात करने के लिए उच्च नाभिक और अधिक आसानी से (चित्रा 2 बी) मनाया जाता है। प्रारंभिक यांत्रिक चुनने के बाद, चयनित IPSC क्लोन Collagenase चतुर्थ का उपयोग कर एंजाइम हदबंदी के साथ विस्तार कर रहे हैं। इन विट्रो विस्तार के 10-15 मार्ग के बाद, सितोगेनिक क विश्लेषण IPSC कालोनियों पर आयोजित किया जाता है। कम से कम दो स्वतंत्र संस्कृतियों, पर लगभग 300-400 बैंड स्तर से लगभग 20 metaphases, विश्लेषण कर रहे हैं और सभी नमूनों एक सामान्य karyogram (चित्रा -2) दिखा। इस अवलोकन IPSCs आनुवंशिक रूप से स्थिर हैं कि पता चलता है।

पिछाड़ीईआर में इन विट्रो विस्तार (5-10 मार्ग), IPSCs stemness मार्करों की अभिव्यक्ति और उनके pluripotency क्षमता के लिए विशेषता है। आंकड़े 3 ए, बी IPSCs alkaline फॉस्फेट धुंधला के लिए सकारात्मक रहे हैं कि दिखा। QRT- पीसीआर विश्लेषण का उपयोग करना, हम IPSCs अंतर्जात pluripotent जीन व्यक्त सत्यापित किया है कि (sox -2, OCT3 / 4, NANOG) शुरू करने PBMNCs की तुलना में काफी ऊंचे स्तर पर, अंतर्जात सी-MYC और KLF-4 की अभिव्यक्ति के स्तर से पहले इसी तरह के हैं और जब तक IPSC reprogramming के बाद (चित्रा -3 सी)। संस्कृति में केवल 5 मार्ग के बाद, बहिर्जात episomal transgenes की अभिव्यक्ति इस प्रकार अंतर्जात pluripotent जीन का सफल सक्रियण, यह दर्शाता है IPSCs में नहीं पाया जा सकता। EBNA-1 के लिए episomal विशिष्ट प्राइमरों द्वारा मूल्यांकन मजबूत transgene अभिव्यक्ति के स्तर के साथ 5 दिनों अभिकर्मक के बाद PBMNCs, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। 4 बहिर्जात pluripotency जीन ले जाने प्लास्मिड उजागर करने के लिए नहीं कर रहे हैं कि PBMNCs, फाई (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैंgure 3 डी)। अंत में, immunofluorescence विश्लेषण IPSCs ऐसे OCT3 / 4, sox -2, SSEA-4, टीआरए-1-60, और टीआरए-1-81 (चित्रा 4) के रूप में pluripotency मार्करों, व्यक्त कि पता चलता है।

उनके इन विट्रो pluripotency क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए आदेश में यह आंकड़ा 5 ए में दिखाया गया है IPSCs, embryoid निकायों (ईबीएस) एक सहज भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करने में भेदभाव कर रहे हैं। QRT- पीसीआर प्रयोगों IPSCs तीन रोगाणु परतों की कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम हैं कि पता चलता है; दरअसल, ईबीएस (अन्तर्जनस्तर (sox-7, एएफपी), mesoderm (CD31, ACTA -2, CDH-5, RUNX -1) और बाह्य त्वक स्तर के वंश मार्करों प्रतिनिधि के भेदभाव प्रदर्शन महत्वपूर्ण अप-विनियमन के 20 दिनों के बाद प्राप्त KTR- 14 वें, GABRR-2) (चित्रा 5 ब)। Confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण एकल कोशिका की धड़कन समूहों ऐसे Troponin मैं (TN-आई) और α-Actinin के रूप में विशिष्ट cardiomyocyte मार्करों व्यक्त अलग पता चलता है कि एक स्पष्ट sarcomeric पैटर्न में संगठित (चित्रा6A)। इसके अलावा, ईबीएस के immunofluorescence विश्लेषण न्यूरॉन विशिष्ट मार्कर तीसरी श्रेणी β ट्यूबिलिन (TUJ1) के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए डोपामिनर्जिक neuronal मार्कर tyrosine hydroxylase (ध) (चित्रा 6B) के लिए एक सकारात्मक धुंधला से पता चलता है।

चित्र 1
प्रोटोकॉल के दौरान मानव परिधीय रक्त और सेल morphological परिवर्तन से IPSCs की पीढ़ी के लिए चित्रा 1. प्रोटोकॉल। (ए) प्रोटोकॉल का चित्र एक भी अभिकर्मक का उपयोग कर, महानिदेशकों और PBMNCs जमी Buffy कोट से अलग होने के बाद जमे हुए PBMNCs से प्राप्त IPSCs उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया के episomal प्लास्मिड गैर एकीकृत। (बी) ट्रांसफ़ेक्ट किया जा रहा है, इससे पहले 14 दिनों के लिए संस्कृति में विगलन और विस्तार के बाद महानिदेशकों और बफी कोट से प्राप्त PBMNCs proliferating के प्रतिनिधि छवियाँ। स्केल बार 100 माइक्रोन। कोशिकाओं pl हैं IPSC कालोनियों के (सी) उदाहरण एक सप्ताह के बादMEFs पर पैदा। स्केल बार 500 माइक्रोन। (डी) एक MEF फीडर परत पर फिर से चढ़ाना के बाद 30-35 दिनों में IPSC कालोनियों के प्रतिनिधि छवियाँ। स्केल बार 500 माइक्रोन। IPSCs = प्रेरित स्टेम सेल; डीजीएस = घनत्व ढाल जुदाई; PBMNCs = परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear; MEFs = माउस भ्रूण fibroblasts; GFS = वृद्धि कारकों; bFGF के बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक =; NAB = सोडियम butyrate। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. आकृति विज्ञान और कुपोषण विश्लेषण। (ए) 2-3 पुस्तिका passaging के कदम के बाद IPSC कालोनियों के प्रतिनिधि छवियाँ। स्केल बार 500 माइक्रोन। (बी) IPSC कालोनियों की बड़ी बढ़ाई। स्केल बार 200 माइक्रोन। (सी) represeइन विट्रो विस्तार के 10-15 अंश के बाद IPSCs से ntative सामान्य karyograms। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. IPSC लक्षण वर्णन: alkaline फॉस्फेट गतिविधि, IPSCs और transgene के मुंह बंद करने के मूल्यांकन की अंतर्जात pluripotency जीन की फिर से अभिव्यक्ति (ए) और alkaline फॉस्फेट के लिए सकारात्मक धुंधला दिखा रहा है (बी) के प्रतिनिधि छवियाँ।। स्केल बार 500 माइक्रोन। QRT- पीसीआर विश्लेषण का उपयोग महानिदेशकों और बफी कोट से प्राप्त दोनों IPSCs में (सी) अंतर्जात pluripotency जीन की फिर से अभिव्यक्ति दिखा बार ग्राफ (सी-MYC, KLF-4, sox -2, OCT3 / 4 और NANOG), ( एन = 4, छात्र टी परीक्षण: * पी <0.05) इसी PBMNCs बनाम पी <0.005 §। (FBOX15 प्राइमरों को नियंत्रित करने के रिश्तेदार episomal विशिष्ट प्राइमरों (EBNA-1) () के साथ डी) QRT- पीसीआर episomal वैक्टर का कोई जीनोम एकीकरण से पता चलता है। (एन = 4, छात्र टी परीक्षण: * पी ​​<0.001 PBMNCs 5 दिन अभिकर्मक इसी बनाम)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Pluripotency प्रोटीन SSEA-4, टीआरए-1-60, टीआरए-1-81, OCT3 / 4 और SOX -2 के महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति दिखा भ्रूण स्टेम कोशिकाओं pluripotency मार्करों के चित्रा 4. immunofluorescence विश्लेषण। प्रतिनिधि immunofluorescence धुंधला। नाभिक DAPI साथ counterstained कर रहे हैं। स्केल बार IPSC महानिदेशकों (ए) और IPSC बफी कोट (बी) के लिए 200 माइक्रोन। IPSC बफी कोट (ए), IPSC महानिदेशकों के लिए स्केल बार 100 माइक्रोन (बी > मजबूत) और (सी)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
IPSCs और ईबीएस में तीन रोगाणु परत जीनों की अभिव्यक्ति के भेदभाव के लिए 5 चित्रा प्रोटोकॉल IPSCs से प्राप्त की। ईबीएस में महानिदेशकों और बफी कोट के बाद PBMNCs से IPSCs की सहज भेदभाव उत्प्रेरण प्रोटोकॉल (ए) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) QRT- पीसीआर प्रयोगों तीनों जनन परत जीनों की अभिव्यक्ति दिखा रहा है: अन्तर्जनस्तर (sox-7, एएफपी), mesoderm (CD31, ACTA -2, CDH-5, RUNX-1), और बाहरी झिल्ली (KRT-14, * पी <0.05 IPSCs समकक्ष इसी बनाम): वें, GABRR -2) ईबीएस में भेदभाव के 20 दिनों (एन = 4, छात्र टी परीक्षण के बाद। ईबीएस = embryoid निकायों।/52885/52885fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
महानिदेशकों और बफी कोट व्युत्पन्न IPSCs के बाद PBMNCs से प्राप्त भेदभाव के दिन 20 पर ईबीएस में हृदय और neuronal प्रोटीन के 6 चित्रा confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण। (ए)-Actinin α हृदय sarcomeric प्रोटीन के लिए प्रतिनिधि छवियों (confocal छवि ढेर के अधिकतम प्रक्षेपण) और Troponin मैं (TN-आई) एकल कोशिका में क्षेत्रों (पैमाने बार 10 माइक्रोन) और (बी) न्यूरॉन विशिष्ट मार्कर तीसरी श्रेणी β ट्यूबिलिन (TUJ1) के लिए और डोपामिनर्जिक neuronal मार्कर tyrosine hydroxylase (ध) (पैमाने की धड़कन अलग ) 20 माइक्रोन बार। नाभिक DAPI साथ counterstained कर रहे हैं। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

भजन की पुस्तक अनुक्रम
सी-MYC परिवार कल्याण 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC -3 '
सी-MYC फिरना 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA -3 '
KLF-4 परिवार कल्याण 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG -3 '
KLF-4 फिरना 5'- AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG -3 '
SOX-2 परिवार कल्याण 5'- GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG -3 '
SOX -2 फिरना 5'- TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG -3
OCT3 / 4 परिवार कल्याण 5'- GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG -3 '
OCT3 / 4 फिरना 5'- CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC -3 '
NANOG परिवार कल्याण 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT -3 '
NANOG फिरना 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT -3 '
SOX-7 परिवार कल्याण 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG -3 '
SOX-7 फिरना 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT -3 '
एएफपी परिवार कल्याण 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 '
एएफपी फिरना 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG -3 '
CD31 के परिवार कल्याण 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC -3 '
CD31 फिरना 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA -3 '
ACTA-2 परिवार कल्याण 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA -3 '
ACTA -2 फिरना 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT -3 '
CDH -5 परिवार कल्याण 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG -3 '
CDH-5 फिरना 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA -3 '
RUNX-1 परिवार कल्याण CCCTAGGGGATGTTCCAGAT -3 ' RUNX -1 फिरना TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA -3 '
KRT-14 परिवार कल्याण 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT -3 '
KRT-14 फिरना 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT -3 '
गु परिवार कल्याण 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT -3 '
वें फिरना 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG -3 '
GABBR-2 परिवार कल्याण 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA -3 '
GABBR -2 फिरना 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA -3 '
EBNA-1 परिवार कल्याण 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG -3 '
EBNA -1 फिरना 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT -3 '
FBX-15 परिवार कल्याण 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA -3 '
FBX-15 परिवार कल्याण 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA -3 '
GAPDH परिवार कल्याण 5'-CCACCCATGGCAAATTCC -3 '
GAPDH फिरना 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG -3 '

तालिका 1: QRT- पीसीआर प्राइमरों की सूची अंतर्जात pluripotency जीन अभिव्यक्ति, transgene के मुंह बंद करने और तीन रोगाणु परत मार्करों की अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर दृश्यों।।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अतीत में, एक ही तरीका है एक विशेष आनुवांशिक उत्परिवर्तन ले मानव स्टेम सेल प्राप्त करने के लिए पूर्व आरोपण आनुवंशिक निदान के दौर से गुजर माता-पिता की भर्ती और उनके त्याग blastocysts 31,32 से भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। एक reprogramming के दृष्टिकोण का प्रयोग, शोधकर्ताओं ने अब लगभग किसी भी जीनोटाइप ले जाने रोगियों से IPSCs उत्पन्न कर सकते हैं। संभावना एक मरीज को विशेष सेल लाइन से शुरू करने के लिए और यह विकारों के pathophysiology और उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण के बाद पहचान की एक जांच की अनुमति देता है के बाद से एक आसानी से सुलभ स्रोत बहुत महत्वपूर्ण है।

वर्तमान अध्ययन में, हम पहले से ही जमे हुए buffy कोट PBMNCs से पहले से घनत्व ढाल जुदाई 22 के बाद जमे हुए PBMNCs से IPSCs और सफलतापूर्वक उत्पन्न वायरस मुक्त IPSCs का उत्पादन करने के लिए लागू एक विधि के साथ एक प्लाज्मिड दृष्टिकोण 15 संयुक्त। बजाय घनत्व ढाल अलग हो PBMNCs सभी की बफी कोट का उपयोगहमें नमूना प्रसंस्करण के दौरान ऑपरेटरों के लिए लागत, समय काम और मैनुअल के चरणों को कम करने OWS। जमे हुए Buffy कोट से PBMNCs का उपयोग कर एक कम लागत प्रोटोकॉल का सेट-अप के लिए प्रतिभागियों का ऊंचा संख्या के साथ अध्ययन के लिए और बहु ​​केंद्र अध्ययन में नमूना संग्रह के लिए आवश्यक है। महत्वपूर्ण बात है, जमे हुए Buffy कोट से IPSCs उत्पादन करने की क्षमता का नमूना संग्रह के लिए एक सरल, लागत प्रभावी और नहीं तो समय लेने वाली विधि का उपयोग कर, पहले से ही रक्त बैंकों में जमा कई जमे हुए biosamples के लिए उपयोग की अनुमति देता है।

इस प्रेरण विधि कालोनियों दोनों सामग्री शुरू में, केवल कुछ अंश (≥5 मार्ग) के बाद episomal transgene की अनुपस्थिति की विशेषता है जहां रोगी विशेष के एकीकरण से मुक्त IPSCs, की व्युत्पत्ति के लिए उपयोगी हो सकता है। उल्लेखनीय है, कि हम सभी चयनित IPSC कालोनियों शुरू सामग्री प्रदर्शन तुलनीय pluripotency सुविधाओं के दोनों प्रकार के और hESCs के लिए सेलुलर और आणविक समानता का संरक्षण, इंडिका से प्राप्त मनायाting के एक सफल IPSC व्युत्पत्ति और प्रोटोकॉल के अनुरूप एक reproducibility के।

10 से अधिक मानव त्वचा तंतुप्रसू और इस विधि (नहीं दिखाया डेटा) का उपयोग (स्वस्थ दाताओं और हृदय और कंकाल की मांसपेशी के रोगों के साथ रोगियों से दोनों) 3 हृदय mesenchymal stromal सेल लाइनों से इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक उत्पन्न किया है IPSCs, इस प्रकार का सुझाव है कि वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के सफल reprogramming के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, सामग्री शुरू करने के रूप में रक्त के चुनाव को विशेष रूप से इन विट्रो में fibroblasts की व्यापक विस्तार तंतुप्रसू बीतने संख्या और प्रसार दर 33,34 पर आधारित, reprogramming की क्षमता को प्रभावित कर सकता है कि जब विचार, fibroblasts की तुलना में लाभदायक है। हमारी प्रोटोकॉल भी इस प्रकार के बारे में 3-4 सप्ताह के द्वारा इस तरह फाई के रूप में अन्य स्रोतों की तुलना में IPSCs की व्युत्पत्ति के लिए आवश्यक समय को कम करने, कम से कम एक संस्कृति समय के बाद जमे हुए Buffy कोट से transgene मुक्त IPSCs की पीढ़ी की अनुमति देता हैbroblasts। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से रक्त कोशिका व्युत्पन्न IPSCs अधिक बारीकी से mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) / fibroblasts 14,35 से प्राप्त उन लोगों की तुलना में hESCs जैसा एक epigenetic हस्ताक्षर प्रदर्शित करने वाले का पता चला।

जमे हुए Buffy कोट से IPSCs के सफल पीढ़ी के बावजूद, कुछ सीमाएँ इस प्रोटोकॉल में विचार किया जाना चाहिए। प्रेरण reprogramming इससे पहले, जमे हुए Buffy कोट से PBMNCs के प्रवर्धन प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करेगा। शुरू सामग्री की गुणवत्ता की जोरदार reprogramming प्रक्रिया के लिए (electroporation के लिए कम से कम 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं) पर्याप्त सेल नंबर प्राप्त करने के लिए, PBMNCs का चयन और अलगाव को प्रभावित कर सकते हैं। यह ज्यादातर नमूनों की आंतरिक जैविक परिवर्तनशीलता के कारण, लेकिन यह भी तकनीकी मुद्दों के लिए है। दरअसल, जमे हुए Buffy कोट से PBMNCs के प्रवर्धन की वजह से एक मजबूत डे के लिए घनत्व ढाल जुदाई, से प्राप्त PBMNCs की तुलना में कम कुशल हैपुस्तिका ऑपरेटर परिवर्तनशीलता पर pendence। घनत्व ढाल जुदाई के बिना reproducibility और जमे हुए Buffy कोट से PBMNC प्रवर्धन की दक्षता बढ़ाने के लिए आदेश में, स्वचालित प्रणाली के उपयोग को दृढ़ता से buffy कोट को भिन्न इकट्ठा करने के लिए सिफारिश की है। यह घनत्व ढाल जुदाई के बाद PBMNCs की तुलना में Buffy कोट से PBMNCs के लिए पर्याप्त संख्या में विस्तार करने के लिए और अधिक कठिन है, दो सामग्री शुरू की reprogramming की दक्षता (लगभग .001-.0005%) रक्त reprogramming दक्षता के अनुसार, तुलनीय है इससे पहले, 14 सूचना दी 23। Reprogramming दक्षता पुनर्योजी चिकित्सा प्रयोजनों के लिए कम है, सुधार EBNA1 / OriP के उपयोग (एपस्टीन-बार वायरस से, EBV) episomal वैक्टर भविष्य सेल थेरेपी विकास 22,36 के लिए IPSC कालोनियों की संख्या में वृद्धि हो सकती है। इसके अतिरिक्त, IPSC पीढ़ी और रखरखाव के लिए एक MEF फीडर परत हमारे प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है। नैदानिक ​​ग्रेड IPSCs प्राप्त करने के लिए, एक फीडर से मुक्त संस्कृति एक Alte हो सकता हैआगे की पढ़ाई के लिए rnative विधि।

अंत में, इस प्रोटोकॉल संभावित नैदानिक ​​ग्रेड IPSCs, रोग मॉडलिंग के लिए ही नहीं बल्कि की व्युत्पत्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक गैर एकीकृत प्रणाली का उपयोग कर के महान लाभ के साथ एक आसानी से सुलभ रोगी सेल स्रोत से IPSCs उत्पन्न करने के लिए एक वैध विधि का प्रतिनिधित्व करता है यह भी एक भविष्य व्यक्तिगत दवा के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube Terumo VF-054SBCS07
Ammodium chloride Sigma-Aldrich A9434
Potassium bicarbonate Sigma-Aldrich 60339
EDTA disodium powder Sigma-Aldrich E5134 0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium  GE Healthcare Life Sciences 17-5442-02 Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)  Gibco 21056-023 No phenol red
Ham's F-12 Mediatech 10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) Gibco 51500-056  1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate Gibco 11905031 1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 300-07 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) 
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) PeproTech 200-03 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) PeproTech 100-11 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO) R&D Systems  287-TC-500 2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D2915 1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin R&D Systems  2914-HT 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II Gibco 11269016 Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1 StemCell Technologies 5850 Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM Gibco 10829-018
Knockout Serum Replacement Gibco 10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140-050
2-Mercaptoethanol  Gibco 31350-010 0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate Sigma-Aldrich B5887 0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa  R&D Systems  4114-TC 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride Sigma-Aldrich Y0503  10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum Hyclone SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution Merck-Millipore ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced BD Biosciences 354230
Collagenase, Type IV Gibco 17104-019 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007 Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) Global Stem GSC-6201G 1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F Addgene  27077 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK Addgene  27078 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL Addgene  27080 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP Addgene  27082 1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit Stemgent 00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody Merck-Millipore MAB4304 1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody Merck-Millipore MAB4360 1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody Merck-Millipore MAB4381 1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-9081 1/500
Anti-Nanog Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-33759 1/500
Anti-Troponin I Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-15368 1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody Sigma-Aldrich A7732 1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody Covance Research Products Inc  MMS-435P-100 1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Calbiochem 657012 1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse  Molecular Probes A-11029 1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit Molecular Probes A-21429 1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate Corning 3471
Trizol Reagent Ambion 15596-018  reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754050 Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 185-5195
Experion Automated Electrophoresis System Bio-Rad 700-7000 Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit Bio-Rad 7007105 Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) Zeiss 495007
NeonTransfection System 100 µl Kit Invitrogen MPK10025 Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System Invitrogen MPK5000 Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 100 कोशिका जीव विज्ञान कोशिका जीव विज्ञान आणविक जीव विज्ञान प्रेरित स्टेम सेल परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear reprogramming episomal प्लास्मिड स्टेम।
गैर समेकित करने Episomal प्लास्मिड का उपयोग करते हुए जमे हुए बफी कोट से प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meraviglia, V., Zanon, A., Lavdas,… More

Meraviglia, V., Zanon, A., Lavdas, A. A., Schwienbacher, C., Silipigni, R., Di Segni, M., Chen, H. S. V., Pramstaller, P. P., Hicks, A. A., Rossini, A. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids. J. Vis. Exp. (100), e52885, doi:10.3791/52885 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter