Summary
תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.
Abstract
ניתן לתכנות מחדש תאים סומטיים לתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) על ידי לאלץ את הביטוי של ארבעה גורמי שעתוק (אוקטובר-4, סוקס-2, KLF-4, ו- c-Myc), הביע בדרך כלל על ידי תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) . בשל הדמיון שלהם עם hESCs, iPSCs הפך כלי חשוב לרפואת רגנרטיבית מטופל ספציפי פוטנציאלית, הימנעות סוגיות אתיות הקשורות לhESCs. כדי להשיג תאים מתאימים ליישום קליני, iPSCs ללא transgene צריך להיות שנוצר כדי למנוע הפעלה מחדש transgene, ביטוי גנים שהשתנה ובידול מוטעה. יתר על כן, שיטת תכנות מחדש יעילה והזולה ביותר היא צורך להפיק iPSCs מספיק למטרות טיפוליות. בהתחשב בצורך הזה, גישת פלסמיד episomal שילוב הלא-יעילה היא הבחירה עדיפה לגזירת iPSC. כיום סוג התא הנפוץ ביותר בשימוש למטרות תכנות מחדש הוא fibroblasts, הבידוד של אשר דורש ביופסית רקמה, אניהליך כירורגי nvasive עבור המטופל. לכן, דם היקפי אדם מייצג את הרקמה נגישה ביותר ולפחות פולשנית לדור iPSC.
במחקר זה, פרוטוקול חסכוני ויראלית ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב דווח לדור של iPSCs מתאי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לאחר צנטריפוגה דם השלמה וללא הפרדת שיפוע צפיפות.
Introduction
בשנת 2006, הקבוצה של שיניה יאמאנאקה 1 הוכיחה בפעם הראשונה שתאים סומטיים מעכברים ובני האדם מבוגרים יכולים להיות מומרים למדינת pluripotent על ידי ביטוי חוץ רחמי של ארבעה גורמי תכנות מחדש (אוקטובר-4, סוקס-2, KLF-4, ו ג-Myc), יצירת התאים שנקרא המושרה pluripotent הגזע (iPSCs) 2. iPSCs מטופל ספציפי דומה מאוד בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) במונחים של מורפולוגיה, הפצה והיכולת להתמיין לסוגי תאי שלוש-נבט (המזודרם, האנדודרם והאאקטודרם) ואילו חסרי דאגות האתיות הקשורות לשימוש בhESCs ועקיף דחייה חיסונית אפשרית 3. לפיכך, iPSCs מופיע כאחד מהמקורות החשובים ביותר של תאי חולה ספציפי למחקר בסיסי, הקרנת סמים, דוגמנות מחלה, הערכה של רעילות, ומטרות רפואת רגנרטיבית 4.
כמה גישות שימשו במשך דור iPSC: וקטורי שילוב נגיפיים(רטרו-וירוס 5, lentivirus 6), ויראלי וקטורי שילוב-עישון (אדנווירוס 7), סנדאי וירוס 8, transposons BAC 9, וקטורי episomal 10, חלבונים 11 או משלוח RNA 12. למרות שהשימוש בשיטות תיווך וירוס יכול להוביל לתכנות מחדש יעילות גבוהה, וקטורים ויראליים להשתלב בגנום של תאי מארח וmutagenesis insertional האקראי ולכן פוטנציאל, שינוי קבוע של ביטוי גנים, והפעלה מחדש של transgenes הושתק במהלך התמיינות לא ניתן לשלול 13.
כדי להפוך iPSCs בטוח יותר לרפואת רגנרטיבית, נעשו מאמצים כדי להפיק iPSCs ללא שילוב של DNA אקסוגני לתוך הגנום תאי. למרות וקטורים ויראליים excisable וtransposons פותחו, זה עדיין לא ברור אם רצפים קצרים וקטור, שבהכרח יישארו בתאי transduced לאחר כריתה, וtransposase ביטוי, יכולים לגרום לשינוי בתאular לתפקד 13. למרות היעילות הגבוהה תכנות מחדש שלה, וירוס סנדאי מייצג גישה יקרה ולהגיע דרך חששות רישוי עם החברה שפיתחה מערכת זו יש הפוטנציאל להגביל יישומה במחקרי translational. יתר על כן, את הצורך בהקדמה ישירה של חלבונים ו- RNA דורש משלוח מרובה של תכנות מחדש מולקולות עם המגבלות טכניות הטבועות זו מציגה, ויעילות תכנות מחדש כוללת היא נמוכה מאוד 14. ראוי לציין, שיטות שילוב הלא-נגיפיות-חופשיות וחסכוניות המבוססות על השימוש בפלסמידים episomal דווחו בהצלחה לתכנות מחדש של fibroblasts עור 15. באופן ספציפי, בעבודה הנוכחית החלטנו להשתמש בפלסמידים episomal מסחריים זמינים ללא אינטגרציה, כפי שדווח בעבר 10,15.
עד כה, fibroblasts העור מייצג את סוג תא התורם הפופולרי ביותר 5. עם זאת, מקורות תא אחרים היו succesתכנות מחדש sfully לiPSCs כולל קרטינוציטים 16, בתאי גזע mesenchymal מח עצם 17, תאי סטרומה שומן 18, שיער הזקיקים 19, ותאי עיסת שיניים 20. הבידוד של תאים אלה דורש פרוצדורות כירורגיות, וכמה שבועות יש צורך במבחנה הרחבת תא כדי להקים תרבות תא ראשונית.
לאור זאת, הבחירה של מתחיל סוג התא היא קריטית וחשוב באותה מידה להיות מסוגל לייצר iPSCs מרקמות נגישים ופחות פולשני כמו דם. שני תאי mononuclear דם טבורי (CBMNCs) 21,22 והיקפי mononuclear דם תאים (PBMNCs) 14,22-24 מייצגים מקורות מתאימים של תאים לגזרה של iPSCs.
למרות היעילות של תכנות מחדש PBMNC המבוגר היא 20-50 פעמים נמוכה מזה של 22 CBMNCs, הם נשארים סוג התא הנוח ביותר למטרה דגימה. בלמעשה, יש דגימת PBMNC את היתרון של להיות פולשנית, ובנוסף, תאים אלה אינם דורשים הרחבה רבה במבחנה לפני ניסויי תכנות מחדש. עד כה, פרוטוקולים שונים דיווחו כי PBMNCs לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות אפשר להקפיא ולהפשיר ימים לכמה חודשים לאחר ההקפאה ומורחבת לכמה ימים לפני תכנות מחדש לiPSCs 22,23. עם זאת, ככל שאנו מודעים לא דווחנו תארו תכנות מחדש של PBMNCs ממעיילי אפים קפואים. חשוב לציין, מעילי אפים קפואים שנאספו ללא הפרדת שיפוע צפיפות מייצגים את דגימות דם הנפוצות ביותר מאוחסנות בbiobanks בקנה מידה הגדול ממחקרי אוכלוסייה, ובכך מייצג את בריכה נגישה של חומר לייצור iPSC שימנע איסוף דגימה נוסף.
במסמך זה אנו מדווחים לראשונה את הדור של iPSCs הנגיפי-חופשי ממעיילי אפים קפואים אנושיים, המבוסס על פרוטוקול שתואר קודם לכן 22. בבנוסף, iPSCs נוצרו מPBMNCs הקפוא מתקבל לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות, כפרוטוקול בקרה לתוצאות PBMNC שיפוע שאינו צפיפות מטוהרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMNCs) היו מבודדים מדגימות דם היקפיים אנושיות של תורמים בריאים לאחר שנחתמו הסכמה ואישור הוועדה האתית של מחוז הדרום טירול הודיעה. ניסויים נערכו בהתאם לעקרונות לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי. כל הנתונים נאספו ונותחו באופן אנונימי.
1. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMNCs)
- PBMNCs מתקבל ממעיילי אפים לאחר צנטריפוגה הדם המלאה, ללא הפרדת שיפוע צפיפות.
- לאסוף 8 מ"ל של דם היקפי ורידים לנתרן ציטרט נאגר צינור פלסטיק, וחנות ב RT (25 מעלות צלזיוס). דם תהליך בתוך 12 שעות לאחר איסוף.
- צנטריפוגה הצינור XG ב 2000 במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס בהרוטור דלי מתנדנד, מיתוג-מבלמי צנטריפוגות.
- לאסוף את המעיל באפי מעונן (השכבה בין שלב הפלזמה העליון ותחתוןשלב המכיל את רוב אריתרוציטים), המכיל את החלק המועשר PBMNC (500 μl) לתוך צינור cryovial.
- Resuspend 500 μl של מעיל באפי עם 500 μl של מדיום הקפאת 2x המכיל FBS 90% ו -20% DMSO, על מנת לקבל נפח כולל של 1 מיליליטר עם 10% ריכוז DMSO.
- להקפיא את הבקבוקון במכל הקפאה מבוקר שיעור ב -80 ° C. תאי חנות בחנקן נוזלי לתקופות ארוכות יותר.
- PBMNCs מתקבל לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות
- לאסוף 12 מיליליטר של דם היקפי ורידים לנתרן ציטרט נאגר צינור פלסטיק, וחנות ב RT. דם תהליך בתוך 12 שעות לאחר איסוף.
- לדלל את הדם עם PBS סטרילי כדי לנפח סופי של 35 מיליליטר.
- לאט ובזהירות, שכבה 35 מיליליטר של דם מדולל ב -15 מיליליטר של תמיסת polysucrose (המשמשת להפרדת שיפוע צפיפות) (p = 1.077) בצינור חרוטי 50 מיליליטר (יחס 3: 1).
- צנטריפוגה הצינור ב 800 XG במשך 30 דקות ב RT בהרוטור דלי מתנדנד, מיתוג-מבלמי צנטריפוגות.
- לשאוב את הפלזמה המכילה העליונה, שלב צהוב וזורקים אותו. זהירות, להעביר את שכבת הביניים הלבנה האטומה המכילה PBMNCs לצינור חרוטי 50 מיליליטר חדש.
- להביא נפח הכולל עד 30 מיליליטר עם PBS סטרילי וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT.
- בטל supernatant ו resuspend התאים עם 30 מיליליטר של PBS. לספור את מספר תאי קיימא, המבוסס על הדרת trypan הכחולה 25.
- PBMNCs צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב RT, לשאוב supernatant וזורקים אותו.
- Resuspend התא גלולה בכמות מתאימה של מדיום הקפאה המכיל 90% FBS ו 10% DMSO, על מנת לקבל ריכוז של 5 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- Aliquot 1 מיליליטר לבקבוקון (כ 5 x 10 6 תאים / מיליליטר) ולהקפיא את הבקבוקון שבשליטת שיעור הקפאת מיכל ב-- 80 מעלות צלזיוס. תאי חנות בחנקן נוזלי לתקופות ארוכות יותר.
2. הפשרה וציפוי של PBMNCs (יום 0)
- PBMNCs מתקבל ממעיילי אפים לאחר צנטריפוגה הדם המלאה, ללא הפרדת שיפוע צפיפות.
- כדי להפעיל את הפרוטוקול באמצעות PBMNCs ממעיילי אפים קפואים, להפשיר 1 בקבוקון של תאים באמבט מים ב 37 ° C ולדלל את המעיל באפי עם PBS סטרילי כדי נפח סופי של 2 מיליליטר.
- העבר את המעיל באפי בדילול לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר, להוסיף 10 מיליליטר של חיץ תמוגה התא אדום ודגירה של 10 דקות ב RT.
- כדי להכין 500 מיליליטר של חיץ תמוגה התא אדום, להוסיף 0.5 גרם של סודה לשתיית אשלגן, 4.145 גרם של אמוניום כלוריד, של 0.5 M פתרון EDTA 500 מיליליטר של מים ultrapure, pH 7.2-7.4 100 μl.
- להביא נפח הכולל עד 50 מיליליטר עם PBS סטרילי וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT.
- בטל supernatant ולשטוף את הכדור עם 50 מיליליטר של PBS סטרילי, צנטריפוגות המעיל באפי ב XG 300 עבור 10 דקות ב RT.
- Resuspend התאים1 מיליליטר של מדיום PBMNC, כפי שתואר לעיל 22, מורכב מ: IMDM ושל בשר חזיר F-12 (יחס 1: 1), תרכיז שומנים 1% מהאינסולין-transferrin-סלניום-Ethanolamine (ITS-X), 1% מכימיים מוגדרים (CDL), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 0.005% של חומצת L-אסקורבית, 0.5% מסרום שור אלבומין (BSA), 1-Thioglycerol (ריכוז 200 מיקרומטר הסופי), תאי גזע פקטור SCF (100 ng / ml), Interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), Erythropoietin EPO (2 U / ml), (100 מיקרוגרם / מיליליטר גורם גדילה IGF-1 (40 ng / ml), Dexamethasone (1 מיקרומטר) דמוי אינסולין והולו-transferrin ).
- העבר אותם לאחד היטב צלחת 12 גם עם משטח תרבית רקמה סטנדרטי טופל, ללא ציפוי, בצפיפות של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה humidified במשך 48 שעות, עד לשלב הבינוני השינוי (ראה סעיף 3).
- PBMNCs מתקבל לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות
- כדי להפעיל את הפרוטוקול באמצעות PBMNCs הקפוא לאחרהפרדת צפיפות שיפוע, הפשרת בקבוקון 1 של תאים באמבט מים ב 37 ° C, להעביר את התאים לתוך 5 מיליליטר של מדיום PBMNC. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב RT.
- Resuspend תאי 1 מיליליטר של מדיום PBMNC ולהעביר אותם לאחד היטב צלחת 12 גם, בצפיפות של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה humidified במשך 48 שעות, עד לשלב הבינוני השינוי (ראה סעיף 3).
3. תרבות והרחבת PBMNCs (יום 2-13)
- לאסוף PBMNCs בתרבות השעיה, בעזרת פיפטה עם טיפ 1 מיליליטר, בצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT.
- בטל supernatant וresuspend התאים 1 מיליליטר של מדיום PBMNC הטרי.
- להעביר את התאים לתוך היטב 1 של צלחת 12-היטב עם משטח תרבית רקמה סטנדרטי טופל, ללא ציפוי, ודגירתם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה humidified.
4. Transfection של PBMNCs עם Episomal פלסמידים (14 יום)
הערה: בצע את הבידוד של ארבעה פלסמידים episomal ללא intergation המסחריים, נושא את הגנים pluripotency באמצעות ערכה מסחרית לטיהור פלסמיד ולהעריך את האיכות של פלסמידים המטוהרים באמצעות ניתוח agarose ג'ל, על פי הוראות היצרן.
- לאסוף PBMNCs בצינור חרוטי 15 מ"ל ולספור את מספר תאי קיימא (על בסיס הרחקת trypan הכחולה) 25.
- צנטריפוגה 2 x 10 6 תאים ב XG 300 עבור 10 דקות ב RT.
- Resuspend 2 x 10 6 תאים בתמהיל transfection המכיל מאגר של Resuspension T 100 μl ו1 מיקרוגרם של כל ה- DNA פלסמיד (פלסמיד אחד נשא OCT3 / 4 וshRNA נגד p53, Sox2 ביצוע פלסמיד אחד וKLF4, אחדפלסמיד שנשא L-MYC וLIN28, ופלסמיד אחד נשא EGFP, כדי לבדוק את יעילות transfection).
- לשאוב את תערובת transfection המכילה את התאים לתוך קצה μl 100 ולהכניס את פיפטה עם המדגם אנכי לתוך הצינור, מלא עם 3 מיליליטר של אלקטרוליטי מאגר E2, הוצב בתחנת פיפטה של מכונה electroporation, על פי הוראות יצרן.
- תאים ביעילות electroporate באמצעות התכנית הבאה: 1,650 V, 10 אלפיות שניים, 3 פעימות.
- Resuspend תאי electroporated (2 x 10 6 תאים) לתוך 2 מיליליטר של מדיום PBMNC מחומם מראש, והוסיף 0.25 מ"מ נתרן וטיראט (NAB) ולספור את מספר תאי קיימא לאחר פרוטוקול electroporation (על בסיס הרחקת trypan הכחולה) 25.
- להעביר את התאים לתוך היטב אחד של צלחת 6-גם ללא ציפוי, נער בעדינות את צלחת דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה humidified.
- היום לאחר electroporation, count מספר תאי GFP החיובי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 8-10 שדות אקראיים, על מנת להעריך את יעילות transfection.
- לשמור על תאי transfected ללא פיצול במשך 3 ימים, עד ציפוים על MEFs (ראה סעיף 6).
- להחליף 2 מיליליטר של מדיום PBMNCs הטרי, בתוספת 0.25 מ"מ NAB כל יומיים.
5. להכין מאכלים עם מזין תאים לCo-התרבות (יום 16)
- מעיל הבארות של צלחת 6-היטב עם 1 מיליליטר של מטריצת קרום במרתף במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס וצלחת fibroblasts העכבר העובריים (MEFs) בצפיפות של 2 x 10 5 תאים / היטב עם 2 מיליליטר של 10% FBS כלול DMEM (מדיום MEF) יום אחד לפני passaging PBMNCs electroporated על מזין תאי MEF.
6. PBMNCs ציפוי transfected על MEFs (יום 17-19)
- לאסוף PBMNCs בתרבות השעיה, בעזרת פיפטה עם טיפ 1 מיליליטר, בצינור חרוטי 15 מיליליטר וPBMNCs צנטריפוגות transfected ב XG 300 עבור 10 דקותב RT.
- בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 2 מיליליטר של מדיום PBMNC הטרי, בתוספת 0.25 מ"מ NAB.
- צלחת התאים על 6 היטב צלחת מצופה MEF דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה humidified.
- לאחר יומיים, לשאוב את המדיום ולהחליף אותו עם 2 מיליליטר של מדיום iPSC המורכב מנוקאאוט DMEM (KO-DMEM), 20% החלפת KO-סרום (KOSR), 1 מ"מ NEAAs, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 20 מ"מ L- גלוטמין, 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, 10 FGF ng / ml (bFGF הבסיסי) ו0.25 מ"מ NAB.
- להחליף 2 מיליליטר של מדיום iPSC טרי בכל יום ולבדוק את התאים יומיים.
שים לב: ביום על 22-25, המושבות הראשונות של iPSCs צריכה להיות גלויות.
המשובטים (iPSCs) 7. קטיף והרחבה של גזע תאים המושרה pluripotent (יום 30-35)
הערה: בערך 30-35 ימים לאחר transfection, מושבות iPSC צריכה להיות מוכנות לקטיף וreplating. יעילות תכנות מחדש צריכה להיות אסתיהזדווגו כאחוז ממספר מושבות iPSC / מספר כולל של תאי electroporated, כפי שדווחו בעבר 26.
- היום לפני passaging מושבות iPSC, להכין את מזין MEF בצלחת 12-היטב (1.25 x 10 5 תאים / טוב).
- לשאוב בינוני וMEF לשנות עם 1 מ"ל של מדיום iPSC עם 10 ng / ml bFGF ו -10 מיקרומטר Y-27632. ידני לנתח עם מושבה אחת מחט בכל פעם תחת מיקרוסקופ לנתח בקטיף-מכסה המנוע כדי להשיג רשת, לאסוף גושים קטנים על ידי pipetting ולהעביר אותם באופן אישי כל אחד לאחד היטב צלחת 12 גם מצופה MEFs.
- מעבר ולהרחיב את כל צלחת 12 גם לצלחת 6-גם ביחס 1: 2, ולאחר מכן כל צלחת 6-גם ביחס 1: 4 להתפשטות נוספת. לנתח ולהרחיב iPSCs ידני ל2-3 הקטעים הראשונים (כפי שתואר ביסודיות בשלב 7.2), ולאחר מכן להשתמש הליך ניתוק אנזים (להתחיל מצעד 7.4).
- לפרוטוקול ניתוק אנזים, coloni iPSC נקיes ידי aspirating חלקים מובחנים, תחת מיקרוסקופ לנתח בקטיף-מכסה המנוע.
- דגירה iPSCs עם 1 מיליליטר של IV collagenase (1 מ"ג / מיליליטר) במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- לשאוב את פתרון האנזים, לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של KO-DMEM ולאסוף את המושבות בצינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 100 XG במשך 2 דקות ב RT.
- לשאוב supernatant, resuspend המושבות ב 2 מיליליטר של מדיום iPSC עם 10 ng / ml bFGF ו -10 מיקרומטר Y-27632 וצלחת אותם על צלחת 6-גם מצופה MEF (יחס 1: 4).
8. אפיון iPSCs (בין 5-15 מעברים)
- אלקליין phosphatase מכתים
- תרבות מושבות iPSC במשך 3-5 ימים במדיום iPSC עם 10 bFGF ng / ml.
- למתחיל פרוטוקול מכתים phosphatase אלקליין, לשטוף iPSCs פעם עם PBS ולאחר מכן לתקן אותם עם 1 מיליליטר של PFA 4% במשך 20 דקות ב RT.
- שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS, להסיר PFA שייר.
- תאי כתם קבוע באמצעותערכה מסחרית אלקליין מכתים phosphatase לפי הוראות היצרן.
- Immunofluorescence
- תרבות מושבות iPSC במשך 3-5 ימים במדיום iPSC עם 10 bFGF ng / ml.
- כדי להתחיל assay immunofluorescence, לשטוף iPSCs פעם עם PBS ולאחר מכן לתקן אותם עם 1 מיליליטר של PFA 4% במשך 20 דקות ב RT.
- שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS, להסיר PFA שייר.
- פנק את iPSCs קבוע עם 1 מיליליטר של permeabilization / חסימת תמיסה המכילה 4% בסרום עז, BSA 0.1%, 0.1% Triton X-100 ושל 0.05% אזיד הנתרן (NaN 3) במשך שעה 1 ב RT.
- לשאוב את פתרון חסימת דגירה התאים הקבועים עם נוגדנים עיקריים בBSA 3% ו 0.05% NaN 3 O פתרון / N ב 4 ° C (לבדוק את שולחן החומר לרשימת נוגדן ראשוני והציע גורם לדילול נוגדן).
- למחרת, לשטוף iPSCs שלוש פעמים עם PBS, אז דגירה התאים עם אלקסה פלואוריד 488 עיזים אנטי עכבר וAlexa פלורידהנוגדנים נגד ארנב 555 עיזים uor, בדילול 1: 1,000 בBSA 3% ו 0.05% NaN פתרון 3, עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס.
- להכתים את הגרעינים עם DAPI (1μg / מיליליטר) במשך 10 דקות ב RT בחושך, ואחריו שלוש כביסה זמן עם PBS.
- בידול של iPSCs בגופי embryoid (EBS)
- תרבות מושבות iPSC ל5-6 ימים במדיום iPSC עם 10 bFGF ng / ml.
- להסיר חלקים מובחנים ממושבות iPSC ידי aspirating, תחת מיקרוסקופ לנתח בקטיף-מכסה המנוע.
- דגירה iPSCs עם 1 מיליליטר של IV collagenase (1 מ"ג / מיליליטר) במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- לשאוב את פתרון האנזים, לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של KO-DMEM ולאסוף את המושבות בצינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 100 XG במשך 2 דקות ב RT.
- לשאוב supernatant ו resuspend המושבות בסרום 2 מיליליטר של EB בינונית מורכב מKO-DMEM, 20% הגדירו את השור עוברי (FBS), 1 מ"מ NEAAs, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 20 מ"מ L-גלוטמין, 0.1 מ"מ46; -mercaptoethanol.
- צלחת מושבות iPSC בהשעיה למשך 6 ימים על 6 צלחות גם קובץ מצורף נמוכות במיוחד, על מנת לאפשר את היווצרותם של גופי spheroidal תלת ממדי embryoid (EBS). לשנות 2 מיליליטר של מדיום EB טרי כל יומיים.
- ביום 7, לאסוף EBS וצלחת אותם על צלחות 6-היטב מצופה ג'לטין 0.1% ב 2 מיליליטר של EB בינונית ולשמור EBS בבידול במשך 20 ימים.
- לשנות 2 מיליליטר של מדיום EB טרי כל יומיים.
- qRT-PCR לניתוח ביטוי גנים
- תרבות מושבות iPSC ל5-6 ימים במדיום iPSC עם 10 bFGF ng / ml.
- לחלץ RNA המוחלט מPBMNCs, iPSCs או EBS באמצעות 1 מיליליטר של מגיב המסחרי בהתאם להוראות יצרן.
- להעריך ריכוז RNA וטהרה בשיטות מתאימות כגון שימוש בספקטרופוטומטר (RNA באיכות גבוהה עם 260/280 ו260 / 230 יחסים> 1.8) 27.
- בדוקשלמות RNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם ל( RQI RNA באיכות גבוהה> 9.5) פרוטוקול של יצרן 28.
- בצע תגובת שעתוק לאחור על 1 מיקרוגרם של RNA הכולל באמצעות ערכת טרנסקריפטאז מסחרית על פי הוראות יצרן.
- הכן את תערובות qPCR המכילים 5 ng של תבנית cDNA, 7.5 μl SYBR גרין Supermix, 2 μl 5 מיקרומטר פריימרים (קדימה: μl ולהפוך 1: μl 1) ו -6 μl של RNase / ללא מים DNase עבור כל תגובה 29.
- בצע את qRT-PCR באמצעות התכנית הבאה: צעד denaturation ראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחרי 40 מחזורים מחולקים לצעד denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות וצעד חישול וסיומת פריימר על 60 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות 29.
- לנרמל את הביטוי של גנים אחרים באמצעות GAPDH כגן משק 28 (ראה פריימרים מפורטים בטבלה 1).
- qPCRלהדרת transgene
- תמצית ה- DNA מPBMNCs או iPSCs באמצעות 1 מיליליטר של חיץ תמוגה המכיל 50 מ"מ טריס, 100 mM EDTA, 100 מ"מ NaCl, 1% נתרן Dodecyl סולפט (SDS) ו -20 מיקרוגרם / מיליליטר proteinase ק
- הוסף נפח שווה (1 מיליליטר) של 100% isopropanol, לערבב על ידי היפוך שלוש פעמים על מנת לאפשר למשקעי DNA וצנטריפוגות ב 10,000 XG במשך 5 דקות על RT.
- בטל supernatant, לשטוף את כדור DNA עם 1 מיליליטר של 70% אתנול ו צנטריפוגות ב 10,000 XG במשך 5 דקות על RT. לשאוב ולזרוק supernatant ו resuspend זה בRNase / ללא מים DNase.
- להעריך ריכוז ה- DNA וטוהר בשיטות מתאימות כגון שימוש בספקטרופוטומטר (RNA באיכות גבוהה עם 260/280 ו260 / 230 יחסים> 1.8) 27.
- הכן את תערובות qPCR המכילות 5 ng של תבנית ה- DNA, 7.5 μl SYBR גרין Supermix, 2 μl 5 מיקרומטר פריימרים (קדימה: μl ולהפוך 1: μl 1) ו -6 ו# 181; L של RNase / ללא מים DNase עבור כל תגובה 29.
- לנרמל את הביטוי של גן EBNA-1 פלסמיד episomal הספציפי באמצעות FBX-15 כגן משק 29 (ראה פריימרים מפורטים בטבלה 1).
- קריוטיפ ניתוח
- תרבות מושבות iPSC ל5-6 ימים על גבי צלחת מצופה מטריצת קרום במרתף ללא מזין עם מסחרי מוגדר, ללא בינוני מזין תחזוקה לiPSCs, הבא הוראות יצרן.
- כדי להפעיל את פרוטוקול ניתוח קריוטיפ, לנתק מושבות iPSC עם 1 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, עד לקבלת ניתוק מתא בודד.
- איסוף תאים וצנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות על RT.
- Resuspend iPSCs ב 2 מיליליטר של מדיום שפותח במיוחד עבור תאי culturing לטכניקות אבחון טרום לידתי. iPSCs תא בודד צלחת על כלים מזכוכית מצופה מטריצת קרום במרתף ודגירתם ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </ Sub> חממה.
- לאחר 2-4 ימים, להוסיף 10 μl / קולכיצין מיליליטר ישירות לתרבויות ודגירה של 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה humidified.
- לשאוב את המדיום ודגירת iPSCs ב 1 מיליליטר של פתרון hypotonic (0.6% נתרן ציטרט ו0.13% אשלגן כלורי) במשך 10 דקות ב RT.
- יש לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של 5% פתרון חומצה אצטית ולתקן iPSCs עם מתנול / פתרון חומצה אצטית (יחס 3: 1) במכונה עם טמפרטורה מבוקרת ולחות (28 מעלות צלזיוס, 42% לחות יחסית).
- לטבול ותאי כתם קבוע עם פתרון quinacrine במשך 15-20 דקות ב RT בחושך (להשיג Q-פסים) 30.
- לרכוש metaphases תא תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 100X 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור iPSCs הנגיפי-בחינם על ידי תכנות מחדש של PBMNCs מבודד ממעיילי אפים קפואים לאחר צנטריפוגה דם השלמה והשוואה עם תכנות מחדש של PBMNCs מתקבל לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות מדווחת. איור 1 א מציג ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מפורט. לאחר הפשרה, PBMNCs המבודד, מראה צורה מעוגלת אופיינית, הם הרחיבו במדיום תרבות דם ספציפי במשך 14 ימים (איור 1) ולאחר מכן transfected עם פלסמידים episomal. לאחר 10-15 ימים לאחר transfection, מושבות בהירות מעוגלות קטנות עם שוליים מוגדרים ומורפולוגיה כמו תא-גזע עוברי מתחיל להופיע (איור 1 ג). כ 20-30 ימים לאחר transfection, מושבות iPSC להיות קומפקטיות מאוד, עם קצוות חדים, להגדיל את הגודל שלהם והם מוכנים לקטיף והרחבה (1D איור). לאחר צעדי passaging הראשון (2-3 קטעים),מושבות iPSC לשמור על המצב מובחן שלהם ולהראות מורפולוגיה אנושית טיפוסית עוברי-תאי גזע. במהלך הקטעים הראשונים, מסיק ידני הוא דרך הרחבה יעילה יותר בהשוואה לאנזים דיסוציאציה כדי לבחור מושבות (2A דמויות) מובחן באופן מלא, קומפקטי וצפוף. הגדלה גדולה יותר של מושבות iPSC תערוכות תאים בודדים בתוך המושבות וגבוהה הגרעין לציטופלסמה יחס הוא ציין (איור 2) בקלות רבה יותר. לאחר קטיף מכאני ראשוני, שיבוטים iPSC נבחרו מורחבים עם ניתוק אנזים באמצעות Collagenase IV. לאחר 10-15 קטעים של התרחבות במבחנה, ניתוח ציטוגנטית מתנהל במושבות iPSC. כ -20 metaphases מלפחות שתי תרבויות עצמאיות, בכ רמת להקת 300-400, מנותחים וכל הדגימות להראות karyogram נורמלי (איור 2 ג). תצפית זו מצביעה על כך שiPSCs יציב מבחינה גנטית.
מאחוראה במבחנה הרחבה (5-10 מעברים), iPSCs מאופיינים בביטוי של סמני stemness ופוטנציאל pluripotency. איורים 3 א ', ב' מראה כי iPSCs הם חיובי מכתים phosphatase אלקליין. באמצעות ניתוח qRT-PCR, שאימתנו כי iPSCs לבטא גני pluripotent אנדוגני (SOX-2, OCT3 / 4, NANOG) ברמות גבוהות יותר באופן משמעותי מPBMNCs מתחיל, בעוד שרמות הביטוי של C-MYC אנדוגני וKLF-4 הן דומות לפני ו לאחר תכנות מחדש iPSC (איור 3 ג). לאחר רק 5 קטעים בתרבות, ביטוי של transgenes episomal אקסוגני לא יכול להיות מזוהה בiPSCs, ובכך מעיד על ההפעלה המוצלחת של גני pluripotent אנדוגני. PBMNCs 5 ימים לאחר transfection, עם רמת ביטוי transgene חזקה, הוערך על ידי פריימרים ספציפיים episomal לEBNA-1, המשמש כביקורת חיובית. PBMNCs שמעולם לא נחשפו לפלסמידים שנשאו 4 גני pluripotency אקסוגני, משמש כביקורת שלילית (אלחוטי3D איור). לבסוף, ניתוח immunofluorescence מגלה כי iPSCs להביע סמני pluripotency, כגון OCT3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60, וTRA-1-81 (איור 4).
iPSCs נבדל לגופי embryoid (EBS) באמצעות פרוטוקול התמיינות ספונטני, כפי שמוצג באיור 5 א ', על מנת להעריך במבחנה פוטנציאל pluripotency. ניסויי qRT-PCR עולים כי iPSCs יכול להתמיין לתאים משלוש השכבות הנבט; אכן, EBS מתקבל לאחר 20 ימים של תצוגת בידול עד-רגולציה משמעותית של נציג סמני שושלת של האנדודרם (SOX-7, AFP), המזודרם (CD31, ACTA-2, CDH-5, RunX-1) והאאקטודרם (KTR- 14, TH, GABRR-2) (איור 5). ניתוח מיקרוסקופיה confocal מראה כי תא בודד ניתק אשכולות להכות להביע סמני cardiomyocyte אופייניים כגון Troponin אני (TN-אני) וα-actinin, מאורגן בתבנית sarcomeric ברורה (איור6A). בנוסף, ניתוח immunofluorescence של EBS תערוכות צביעה חיובית לנוירון הספציפי כיתת סמן III β-טובולין (Tuj1), כמו גם לhydroxylase דופאמין העצבי טירוזין הסמן (TH) (איור 6).
איור 1. פרוטוקול עבור הדור של iPSCs מהדם ותאים היקפיים שינויים מורפולוגיים אדם במהלך הפרוטוקול. () תרשים של הפרוטוקול המשמש לייצור iPSCs מתקבל מPBMNCs הקפוא לאחר DGS וPBMNCs מבודד ממעיילי אפים קפואים, באמצעות transfection אחת אי-שילוב פלסמידים episomal. (ב) נציג תמונות של מתרבים PBMNCs מתקבל מDGS ומעילי אפים לאחר הפשרה והתרחבות בתרבות במשך 14 ימים, לפני שtransfected. בר סולם 100 מיקרומטר. דוגמאות (C) של מושבות iPSC שבוע לאחר התאים plated על MEFs. בר סולם 500 מיקרומטר. (ד) נציג תמונות של מושבות iPSC ב30-35 ימים לאחר ציפוי מחדש במזין שכבת MEF. בר סולם 500 מיקרומטר. iPSCs = תאי גזע pluripotent המושרה; DGS = צפיפות הפרדת שיפוע; PBMNCs = תאי הדם היקפיים mononuclear; MEFs = fibroblasts העכבר העוברי; גורמי GFS = צמיחה; bFGF = גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי; NAB = נתרן וטיראט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מורפולוגיה וניתוח קריוטיפ. (א) נציג תמונות של מושבות iPSC אחרי 2-3 שלבי passaging ידניים. בר סולם 500 מיקרומטר. הגדלה גדולה יותר של מושבות iPSC (B). בר סולם 200 מיקרומטר. Represe (C)karyograms הנורמלי ntative מiPSCs לאחר 10-15 קטעים של התרחבות במבחנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אפיון iPSC: פעילות phosphatase אלקליין, מחדש ביטוי של גני pluripotency אנדוגני של iPSCs והערכה של השתקת transgene () ונציג תמונות (B) מראים מכתים החיובי עבור phosphatase אלקליין.. בר סולם 500 מיקרומטר. גרף העמודות המציגות את מחדש הביטוי של גני pluripotency אנדוגני (ג) (c-myc, KLF-4, SOX-2, OCT3 / 4 וNANOG) בשני iPSCs מתקבל מDGS ומעילים באפי, באמצעות ניתוח qRT-PCR ( n = 4, מבחן t סטודנט: * p <0.05, § p <0.005 לעומת PBMNCs המקביל). (D) qRT-PCR עם פריימרים ספציפיים episomal (EBNA-1) (ביחס לשליטה פריימרים FBOX15) לא מראה הגנום-אינטגרציה של וקטורי episomal. (N = 4, מבחן t סטודנט: * p <0.001 לעומת מקביל PBMNCs transfection 5 ימים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ניתוח איור 4. Immunofluorescence של סמני pluripotency בתאי גזע עובריים. מכתים immunofluorescence הנציג מראה ביטוי משמעותי של חלבוני pluripotency SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, OCT3 / 4 וSOX-2. גרעינים counterstained עם DAPI. בר סולם 200 מיקרומטר לiPSC DGS () ומעיל iPSC אפים (B). למעייל iPSC אפים (), iPSC DGS בר סולם 100 מיקרומטר (B strong>) ו- (ג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. פרוטוקול להתמיינות של iPSCs וביטוי של שלושה גני שכבת הנבט בEBS מתקבל מiPSCs. (א) ייצוג סכמטי של פרוטוקול גרימת התמיינות ספונטנית של iPSCs מPBMNCs לאחר מעילי DGS והאפים בEBS. ניסויים (ב) qRT-PCR מראים את הביטוי של כל הגנים השכבה שלוש נבט: האנדודרם (SOX-7, AFP), המזודרם (CD31, ACTA-2, CDH-5, RunX-1), והאאקטודרם (KRT-14, TH, GABRR-2) בEBS לאחר 20 ימים של בידול (n = 4, סטודנטים מבחן t: * p <0.05 לעומת מקביל עמית iPSCs). EBS = גופי embryoid."Target =" _ /52885/52885fig5large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ניתוח איור 6. מיקרוסקופיה Confocal של חלבוני לב והעצביים בEBS ביום 20 של בידול המתקבל מPBMNCs לאחר DGS וiPSCs נגזר מעילים באפי. (א) נציג תמונות (הקרנה מקסימלי של ערימת תמונת confocal) לחלבונים sarcomeric לב α-actinin וTroponin אני (TN-I) בתא בודד מנותק להכות אזורים (סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר) ו- (ב) לנוירון הספציפי כיתת סמן III β-טובולין (Tuj1) וhydroxylase טירוזין הסמן העצבי דופאמין (TH) (בסולם בר 20 מיקרומטר). גרעינים counterstained עם DAPI. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר שלנתון זה.
| פריימר | רצף | ||
| FW C-MYC | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 " | ||
| rev c-myc | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 " | ||
| KLF-4 FW | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 " | ||
| KLF-4 rev | 5'- AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 " | ||
| SOX-2 FW | 5'- GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 " | ||
| rev SOX-2 | 5'- TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3 | ||
| OCT3 / 4 FW | 5'- GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 " | ||
| OCT3 rev / 4 | 5'- CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 " | ||
| NANOG FW | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 " | ||
| rev NANOG | 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 " | ||
| SOX-7 FW | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 " | ||
| rev SOX-7 | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 " | ||
| FW AFP | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 " | ||
| rev AFP | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 " | ||
| CD31 FW | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 " | ||
| rev CD31 | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 " | ||
| ACTA-2 FW | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 " | ||
| ACTA-2 rev | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 " | ||
| CDH-5 FW | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 " | ||
| CDH-5 rev | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 " | ||
| RunX-1 FW | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 " | rev RunX-1 | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 " |
| FW KRT-14 | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 " | ||
| rev KRT-14 | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 " | ||
| TH FW | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 " | ||
| rev TH | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 " | ||
| GABBR-2 FW | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 " | ||
| GABBR-2 rev | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 " | ||
| EBNA-1 FW | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 " | ||
| rev EBNA-1 | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 " | ||
| FBX-15 FW | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 " | ||
| FBX-15 FW | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 " | ||
| FW GAPDH | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 " | ||
| rev GAPDH | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 " |
טבלת 1: רשימה של פריימרים qRT-PCR רצפי פריימר המשמשים להערכה של ביטוי גני pluripotency אנדוגני, השתקת transgene וביטוי של שלושה סמני שכבת נבט..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבר, הדרך היחידה להשיג תאי גזע pluripotent אדם נושאים מוטציה גנטית מסוימת היה לגייס הורים עוברים אבחון גנטי טרום השרשה וליצור תאי גזע עובריים מblastocysts הושלכה 31,32. שימוש בגישה תכנות מחדש, חוקרים יכולים כעת ליצור iPSCs מחולים נושאים כמעט כל גנוטיפ. האפשרות להתחיל משורת תאי חולה ספציפי ומקור נגיש מאוד חשוב שכן הוא מאפשר חקירה של הפתופיזיולוגיה של הפרעות וזיהוי הבא של גישות טיפוליות חדשניות.
במחקר הנוכחי, ששלבנו גישת פלסמיד 15 עם שיטה כבר מיושמת לייצר iPSCs מPBMNCs הקפוא בעבר לאחר הפרדת שיפוע צפיפות 22 וiPSCs-וירוס בחינם שנוצר בהצלחה מPBMNCs מעיל באפי קפוא. השימוש במעיילים באפי במקום להפריד PBMNCs שיפוע צפיפות כלOWS לנו להפחית עלויות, זמן עבודה ופעולות באופן ידני עבור מפעילים במהלך עיבוד מדגם. ההגדרה של פרוטוקול בעלות נמוכה באמצעות PBMNCs ממעיילי אפים קפואים היא חיונית ללימודים עם מספר גבוה של משתתפים ולאוספי מדגם במחקרים רב-מרכזיים. חשוב לציין, את היכולת לייצר iPSCs ממעיילי אפים קפואים מאפשרת גישה לbiosamples קפוא רב כבר מאוחסן בבנקי דם, באמצעות שיטה פשוטה, זמן חסכוני ולא כל כך רב לאיסוף דגימה.
שיטת אינדוקציה זה עשויה להיות שימושי עבור הגזירה של iPSCs ללא אינטגרציה חולה ספציפי, שבו מושבות מאופיינות בהעדר transgene episomal לאחר כמה רק קטעים (≥5 מעברים), בשני חומרים מתחילים. למרבה הפלא, ראינו שכל מושבות iPSC נבחרו מתקבלות משני הסוגים של תכונות pluripotency מתחילות תצוגת חומר דומות והשימור של דמיון תאי ומולקולרי לhESCs, אינדיקהטינג גזירה iPSC מוצלחת ושחזור של הפרוטוקול עולה בקנה אחד.
iPSCs יתר על כן, יש לנו נוצרו בהצלחה יותר מ 10 פיברובלסטים עור אדם ו -3 שורות תאי סטרומה mesenchymal לב (שניהם מתורמים וחולים במחלות שריר לב ושלד בריאים) בשיטה זו (מידע לא מוצג), ובכך מצביע על כך שהפרוטוקול המתואר יכול לשמש לתכנות מחדש המוצלח של סוגי תאים שונים. עם זאת, הבחירה של דם כחומר מוצא היא יתרון לעומת fibroblasts, במיוחד כאשר בהתחשב בכך שההרחבה נרחבת של fibroblasts במבחנה עשויה להשפיע על היעילות של תכנות מחדש, המבוססת על מספרם ושגשוגם שיעור מעבר פיברובלסטים 33,34. הפרוטוקול שלנו מאפשר גם הדור של iPSCs ללא transgene ממעיילי אפים קפואים לאחר זמן תרבות מינימאלי, ובכך להקטין בכ 3-4 שבועות את הזמן הדרוש לגזירה של iPSCs בהשוואה למקורות אחרים, כגון אינטרנט אלחוטיbroblasts. יתר על כן, מחקרים שנעשה לאחרונה גילו כי iPSCs תאים שמקורם בדם להציג חתימה אפיגנטיים שדומה יותר hESCs מאלה המתקבלים מתאי גזע mesenchymal (MSC) / fibroblasts 14,35.
למרות של הדור המוצלח של iPSCs ממעיילי אפים קפואים, כמה מגבלות צריכים להילקח בחשבון בפרוטוקול זה. לפני תכנות מחדש אינדוקציה, ההגברה של PBMNCs ממעיילי אפים קפואים יכולה לייצג שלב קריטי של הפרוטוקול. האיכות של חומר מוצא יכולה מאוד להשפיע על הבחירה והבידוד של PBMNCs, על מנת להשיג מספרים סלולריים מספיקים להליך תכנות מחדש (לפחות 2 x 10 6 תאים לelectroporation). זה בעיקר בשל שונות ביולוגיות פנימיות של הדגימות, אלא גם לבעיות טכניות. ואכן, ההגברה של PBMNCs ממעיילי אפים קפואים היא פחות יעילה בהשוואה לPBMNCs מתקבל מהפרדת שיפוע צפיפות, בשל דה חזקהpendence על השתנות מפעיל ידנית. על מנת לשפר את שחזור והיעילות של ההגברה PBMNC ממעיילי אפים קפואים ללא הפרדת שיפוע צפיפות, השימוש במערכות אוטומטיות מומלץ לאסוף שברי מעיל באפי. למרות שזה קשה יותר כדי להרחיב את מספר מספיק של PBMNCs ממעיילים באפי מאשר PBMNCs לאחר הפרדת שיפוע צפיפות, את היעילות של תכנות מחדש (% על .001-0.0005) של שני חומרים מתחילים להשוות, על פי יעילות תכנות מחדש דם שדווח בעבר 14, 23. מאז את יעילות תכנות מחדש היא נמוכה למטרות רפואת רגנרטיבית, השימוש בהשתפר EBNA1 / OriP (מנגיף אפשטיין-באר, EBV) וקטורים episomal עשויים להגדיל את מספר מושבות iPSC לפיתוח טיפול בתא עתיד 22,36. בנוסף, שכבת מזין MEF לדור iPSC ותחזוקה משמשת בפרוטוקול שלנו. על מנת לקבל iPSCs כיתה קלינית, ללא תרבות מזין יכולה להיות Alteשיטת rnative למחקרים נוספים.
לסיכום, פרוטוקול זה מייצג שיטה תקפה ליצור iPSCs ממקור תא מטופל נגיש בקלות עם היתרון הגדול של שימוש במערכת שאינה אינטגרטיבית שעלולים לשמש לגזירה של iPSCs כיתה קלינית, לא רק עבור מודלים מחלה אבל גם לרפואת עתיד אישית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
