Summary
Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) representerer en kilde til pasientspesifikke vev for kliniske applikasjoner og grunnforskning. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å omprogrammere humane perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) fra fryste buffy coats inn virusfritt iPSCs med ikke-integrerende episomale plasmider.
Abstract
Somatiske celler kan omprogrammeres til indusert pluripotente stamceller (iPSCs) ved å tvinge ekspresjon av fire transkripsjonsfaktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, og c-myc), vanligvis uttrykt av humane embryonale stamceller (hESCs) . På grunn av deres likhet med hESCs har iPSCs blitt et viktig redskap for potensiell pasient-spesifikke regenerativ medisin, unngå etiske problemstillinger knyttet til hESCs. For å oppnå celler som er egnet for klinisk anvendelse, transgene fritt iPSCs må genereres for å unngå transgenet reaktive, forandret genekspresjon og villedet differensiering. Videre er en svært effektiv og billig metode for omprogrammering er nødvendig for å utlede tilstrekkelig iPSCs for terapeutiske formål. Gitt dette behovet, er en effektiv ikke-integrere episomal plasmid tilnærming til å foretrekke valg for IPSC avledning. Dag den vanligste celletype som brukes til reprogrammerings formål er fibroblaster, isolering av noe som krever vevsbiopsi, en Invasive kirurgisk prosedyre for pasienten. Derfor representerer human perifer blod den mest tilgjengelige og minst invasiv vev for IPSC generasjon.
I denne studien er en kostnadseffektiv og virusfritt protokoll ved bruk av ikke-integrerende episomale plasmider rapportert for generering av iPSCs fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) oppnådd fra frosne buffy coats etter sentrifugering av fullblod og uten densitetsgradient separasjon.
Introduction
I 2006, gruppen av Shinya Yamanaka en demonstrert for første gang at somatiske celler fra voksne mus og mennesker kan konverteres til en pluripotent tilstand ved ektopisk uttrykk for fire omprogrammering faktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, og c-Myc), genererer de såkalte Induced Pluripotent stamceller (iPSCs) 2. Pasientspesifikke iPSCs ligner menneskelige embryonale stamceller (hESCs) tett i form av morfologi, spredning og evne til å differensiere i hvilke typer tre-bakterie celle (mesoderm, endoderm og ektoderm) mens mangler etiske bekymringer knyttet til bruk av hESCs og forbi mulig immunawisning tre. Dermed iPSCs fremstå som en av de viktigste kildene til pasientspesifikke celler for grunnforskning, narkotika screening, sykdom modellering, vurdering av toksisitet, og regenerativ medisin formål 4.
Flere tilnærminger har vært brukt i IPSC generasjon: virale integrere vektorer(Retrovirus 5, lentivirus 6), viral ikke-integrere vektorer (adenovirus 7), Sendai-virus 8 BAC transposoner 9, episomale vektorer 10, proteiner 11 eller RNA levering 12. Selv om bruken av virus-mediert metoder kan føre til høy effektivitet omprogrammering, virale vektorer som integreres i genomet til vertsceller og dermed potensialet tilfeldig insertional mutagenese, kan permanent endring av genekspresjon, og reaktivering av dempede transgener under differensiering ikke utelukkes 13.
For å gjøre iPSCs tryggere for regenerativ medisin, har man forsøkt å utlede iPSCs uten integrering av eksogent DNA i celle genomer. Selv excisable virale vektorer og transposoner har blitt utviklet, er det fortsatt uklart om korte vektorsekvenser, som uunngåelig forblir i transduserte celler etter fjerning, og transposase uttrykk, kan indusere endringer i celleular fungere 13. Til tross for sin høye omprogrammering effektivitet, representerer Sendai virus en kostbar tilnærming og nå gjennom lisensiering bekymringer med selskapet som utviklet dette systemet har potensial til å begrense sin søknad i translasjonsforskning studier. Videre er behovet for direkte innføring av proteiner og RNA krever flere levering av omprogrammering molekyler med de iboende tekniske begrensninger Dette innfører, og samlet omprogrammering effektivitet er meget lav 14. Av notatet, har kostnadseffektive virusfrie og ikke-integrere metoder basert på bruk av episomale plasmider blitt rapportert for omprogrammering av hudfibroblaster 15. Spesielt i dette arbeidet har vi besluttet å bruke kommersielt tilgjengelige integreringsfritt episomale plasmider, som tidligere rapportert 10,15.
Til dags dato, hudfibroblaster representerer den mest populære donor celletype 5. Imidlertid har andre cellekilder vært takkonstruksjonensfully omprogrammeres til iPSCs inkludert keratinocytter 16, benmarg stamceller 17, adipose stromaceller 18, hårsekker 19, og tannpulpa celler 20. Isoleringen av disse cellene krever kirurgiske prosedyrer, og flere uker er nødvendig for in vitro celle-ekspansjon for å etablere en primær cellekultur.
I lys av dette, er utvalget av starter celletype kritisk og det er like viktig å kunne produsere iPSCs fra lett tilgjengelige og mindre invasive vev som blod. Begge ledningen blod mononukleære celler (CBMNCs 21,22) og perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) 14,22-24 representerer egnede kilder til celler for avledning av iPSCs.
Selv om effektiviteten av voksen PBMNC omprogrammering er 20 til 50 ganger lavere enn for CBMNCs 22, de forblir den mest praktiske celletypen for prøvetaking formål. IFaktisk har PBMNC sampling fordelen av å være minimalt invasiv, og i tillegg har disse cellene ikke kreve omfattende utvidelse in vitro før omprogrammering eksperimenter. Hittil har forskjellige protokoller rapportert at PBMNCs etter tettshetsgradient separasjon kan fryses og tines dager til flere måneder etter frysing og utvidet for noen dager før omprogrammering inn iPSCs 22,23. Likevel, så langt vi kjenner ingen rapporter har beskrevet omprogrammering av PBMNCs fra frosne buffy strøk. Viktigere, frosne buffy strøk samles uten tettshetsgradient separasjon representerer de mest vanlige blodprøver som er lagret i stor skala biobanker fra befolkningsstudier, og representerer således en lett tilgjengelig pool av materiale for IPSC produksjon som unngår ytterligere prøvetaking.
Heri rapporterer vi for første gang generering av virusfrie iPSCs fra humane frosne buffy coats, basert på en tidligere beskrevet protokoll 22. IDessuten ble iPSCs generert fra frosne PBMNCs oppnådd etter tetthetsgradient separasjon, som en kontrollprotokoll for de ikke-tetthetsgradient rensede PBMNC resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) ble isolert fra humane perifere prøver av friske donorer etter signert informert samtykke og godkjenning av Etisk komité i provinsen Sør-Tyrol blod. Forsøkene ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Alle data ble samlet inn og analysert anonymt.
1. Isolering av perifere mononukleære blodceller (PBMNCs)
- PBMNCs hentet fra buffy strøk etter fullblod sentrifugering, uten densitetsgradient separasjon.
- Samle 8 ml venøst perifert blod inn i et bufret natriumsitrat plastrør, og oppbevares ved romtemperatur (25 ° C). Prosessen blod innen 12 timer etter innsamling.
- Sentrifuger røret ved 2000 xg i 15 min ved 4 ° C i en svingende spannrotor, utkoblingen sentrifuger bremsene.
- Samle skyet buffy coat (laget mellom det øvre plasmafasen og den nedrefasen som inneholder det meste av erytrocytter), som inneholder den anrikede PBMNC fraksjon (500 mL) i en kryoampulle rør.
- Resuspender 500 ul av buffy coat med 500 ul av 2x iskaldt medium inneholdende 90% FBS og 20% DMSO for å oppnå et totalvolum på 1 ml med 10% DMSO-konsentrasjon.
- Fryse beholderen i en kontrollert hastighet frysebeholder ved -80 ° C. Lagercellene i flytende nitrogen i lengre perioder.
- PBMNCs oppnådd etter tettshetsgradient separasjon
- Samle 12 ml venøs perifert blod inn i en natrium citratbufret plastrør, og oppbevar ved RT. Prosessen blod innen 12 timer etter innsamling.
- Fortynn blod med steril PBS til et sluttvolum på 35 ml.
- Forsiktig og langsomt, lag 35 ml fortynnet blod på 15 ml polysucrose løsning (benyttet for tettshetsgradient separasjon) (p = 1,077) i et 50 ml konisk rør (forhold 3: 1).
- Sentrifuger røret ved 800 xg i 30 minutter ved romtemperatur ien svingende bøtte rotor, bytte-off sentrifuger bremser.
- Aspirer øvre, gul fase inneholder plasma og kast den. Nøye, overføre ugjennomsiktig hvit inter lag som inneholder PBMNCs til en ny 50 ml konisk tube.
- Bring totalt volum til 30 ml med sterilt PBS og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved RT.
- Kast supernatanten og resuspender cellene med 30 ml PBS. Tell antall levedyktige celler, basert på trypan blå eksklusjon 25.
- Sentrifuger PBMNCs ved 300 xg i 10 min ved RT, Aspirer supernatanten og kast den.
- Resuspender cellepelleten i en passende mengde av frysemedium inneholdende 90% FBS og 10% DMSO for å oppnå en konsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml.
- Aliquot 1 ml per ampulle (ca. 5 x 10 6 celler / ml) og fryse hetteglasset i en kontrollert hastighet frysebeholder ved - 80 ° C. Lagercellene i flytende nitrogen i lengre perioder.
2. Tining og plating av PBMNCs (DAY 0)
- PBMNCs hentet fra buffy strøk etter fullblod sentrifugering, uten densitetsgradient separasjon.
- For å starte protokollen med PBMNCs fra frosset buffy coats, tine en ampulle med celler i et vannbad ved 37 ° C og fortynne buffy coat med sterilt PBS til et sluttvolum på 2 ml.
- Overfør fortynnet buffy coat inn i et 50 ml konisk rør, tilsett 10 ml av røde cellelyseringsbuffer og inkuber i 10 min ved RT.
- For å fremstille 500 ml av røde cellelyseringsbuffer, tilsett 0,5 g kalium-bikarbonat, 4,145 g ammoniumklorid, 100 ul 0,5 M EDTA-oppløsning til 500 ml ultrarent vann, pH 7,2-7,4.
- Bring totalt volum til 50 ml med sterilt PBS og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved RT.
- Kast supernatanten og vask pelleten med 50 ml steril PBS, sentrifuger buffy coat ved 300 xg i 10 min ved RT.
- Resuspender cellene i1 ml PBMNC medium, som tidligere beskrevet 22, sammensatt av: IMDM og Hams F-12 (ratio 1: 1), 1% av Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamine (ITS-X), 1% av kjemisk definerte Lipid Concentrate (CDL), 1% penicillin / streptomycin, 0,005% L-askorbinsyre, 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 1-tioglycerol (sluttkonsentrasjon 200 uM), stamcellefaktor SCF (100 ng / ml), Interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), Erytropoietin EPO (2 U / ml), insulin-lignende vekstfaktor IGF-1 (40 ng / ml), Deksametason (1 uM) og holo-transferrin (100 ug / ml ).
- Overføre dem til en brønn av en 12-brønns plate med standard vevskultur behandlede overflate, uten belegg, ved en tetthet på 2 x 10 6 celler / ml. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator i 48 timer, helt til den endrede medium trinnet (se punkt 3).
- PBMNCs oppnådd etter tettshetsgradient separasjon
- For å starte protokollen bruker frosne PBMNCs ettertetthetsgradient separasjon, tines en ampulle med celler i et vannbad ved 37 ° C, overføres cellene i 5 ml PBMNC medium. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved RT.
- Suspender cellene i 1 ml medium PBMNC og overføre dem til en brønn av en 12-brønns plate ved en densitet på 2 x 10 6 celler / ml. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator i 48 timer, helt til den endrede medium trinnet (se punkt 3).
3. Kultur og Utvidelse av PBMNCs (DAY 2-13)
- Samle PBMNCs i suspensjonskultur under anvendelse av en pipette med en 1 ml spiss, i et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved RT.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml friskt medium PBMNC.
- Overfør cellene inn i en brønn av 12-brønns plate med standard vevskultur behandlede overflate, uten belegg, og inkuber dem ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
4. Transfeksjon av PBMNCs med episomal Plasmider (DAY 14)
Merk: Utfør isolering av de fire kommersielle intergation fritt episomale plasmider, bærer pluripotency gener bruker et kommersielt kit for plasmid rensing og vurdere kvaliteten på de rensede plasmider ved hjelp av en agarosegel analyse, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Samle PBMNCs i 15 ml konisk rør og telle antallet levedyktige celler (på basis av trypan blå eksklusjon) 25.
- Sentrifuger 2 x 10 6 celler ved 300 xg i 10 min ved RT.
- Gjensuspender 2 x 10 6 celler i transfeksjon blanding inneholdende 100 ul buffer Resuspensjon T og 1 mikrogram av hver plasmid-DNA (et plasmid som bærer OCT3 / 4 og shRNA mot p53, et plasmid som bærer SOX2 og KLF4, ettplasmid som bærer L-myc og LIN28, og en plasmid som bærer EGFP, for å kontrollere transfeksjonseffektiviteten).
- Aspirer transfeksjon blanding inneholdende cellene i en 100 mL spiss og sett pipette med prøven vertikalt inn i røret, som er fylt med 3 ml av elektrolytisk buffer E2 som er lagt inn i pipetten stasjonen av elektroporering maskin, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Effektivt electroporate celler med følgende program: 1650 V, 10 ms, 3 pulser.
- Suspender elektroporerte celler (2 x 10 6 celler) i 2 ml forvarmet PBMNC medium, tilsette 0,25 mM natriumbutyrat (NaB) og telle antall levedyktige celler etter elektroporering protokollen (på basis av trypan blå eksklusjon) 25.
- Overfør cellene inn i en brønn i en 6-brønns plate uten belegg, rist plate og inkuberes cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
- Dagen etter elektroporering lant antall GFP-positive celler under fluorescensmikroskopi 8-10 tilfeldig felt, for å vurdere transfeksjonseffektiviteten.
- Opprettholde de transfekterte celler uten splitting i 3 dager, før plating dem på MEFs (se punkt 6).
- Erstatt 2 ml frisk PBMNCs medium, pluss 0,25 mm NAB hver dag.
5. Forbered Retter med mater-celler for Co-kulturen (DAY 16)
- Belegge brønnene i en 6-brønns plate med en ml av basalmembranmassen i 15 minutter ved 37 ° C og plate mus embryonale fibroblaster (MEFs) ved en densitet på 2 x 10 5 celler / brønn med 2 ml 10% FBS inne DMEM (MEF medium) en dag før aging de elektroporerte PBMNCs på MEF mater-celler.
6. plating Transfekterte PBMNCs bort på MEFs (DAY 17-19)
- Samle PBMNCs i suspensjonskultur, ved hjelp av en pipette med 1 ml spissen, i 15 ml konisk rør og sentrifuger transfektert PBMNCs ved 300 xg i 10 minved RT.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml frisk PBMNC medium, pluss 0,25 mM NaB.
- Plate cellene bort på MEF-belagt seks godt plate og inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO 2 i en fuktet inkubator.
- Etter to dager, aspirer medium og erstatte den med 2 ml IPSC medium sammensatt av knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KO-Serum Replacement (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% Penicillin / streptomycin, 20 mm L- glutamin, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml FGF (bFGF basic) og 0,25 mM NaB.
- Erstatt 2 ml frisk IPSC medium hver dag og sjekke cellene daglig.
Merk: På om dagen 22-25, bør de første koloniene av iPSCs være synlig.
7. Plukke og utvidelse av Induced Pluripotent stamceller (iPSCs) Clones (DAY 30-35)
Merk: På ca 30-35 dager etter transfeksjon, bør IPSC kolonier være klar for plukking og replating. Omprogrammering effektivitet bør være estiparret som prosentandelen av antall kolonier IPSC / totalt antall elektroporerte celler, som tidligere rapportert 26.
- Dagen før aging IPSC kolonier forberede MEF mater i en 12-brønns plate (1,25 x 10 5 celler / brønn).
- Aspirer MEF medium og endres med 1 ml IPSC medium med 10 ng / ml bFGF og 10 uM Y-27632. Manuelt dissekere med en nål en koloni på hver gang under disseksjonsmikroskop i plukk-hette for å oppnå et gitter, samle mindre klumper ved pipettering og overføre dem enkeltvis til hver brønn av en 12-brønners plate belagt med MEFs.
- Passasje og utvide hver 12-brønns plate til en 6-brønns plate i et forhold på 1: 2, og deretter hver seks-brønns plate i et forhold på 1: 4 for ytterligere formering. Dissekere og utvide iPSCs manuelt for de første 2-3 passasjer (så grundig beskrevet i trinn 7.2), og deretter bruke et enzym dissosiasjon prosedyre (start fra trinn 7.4).
- For et enzym dissosiasjon protokollen, rent IPSC colonies ved å aspirere differensierte porsjoner, under dissekere mikroskop i plukking-hette.
- Inkuber iPSCs med 1 ml IV kollagenase (1 mg / ml) i 10 minutter ved 37 ° C.
- Aspirer enzymoppløsning, skylles cellene med 1 ml av KO-DMEM og samle koloniene i et 15 ml konisk rør. Sentrifuger ved 100 xg i 2 min ved RT.
- Aspirer supernatanten, resuspender koloniene i 2 ml IPSC medium med 10 ng / ml bFGF og 10 uM Y-27632 og plate dem på MEF-belagte 6-brønns plate (forhold 1: 4).
8. Karakterisering av iPSCs (Mellom 5-15 Passages)
- Alkalisk fosfatase Farging
- Kultur de IPSC koloniene i 3-5 dager i IPSC medium med 10 ng / ml bFGF.
- For å starte en alkalisk fosfatase-farging protokollen, skyll iPSCs en gang med PBS, og deretter feste dem med en ml av 4% PFA i 20 minutter ved RT.
- Vask cellene tre ganger med PBS for å fjerne rester av PFA.
- Flekke fast celler ved hjelpen kommersiell alkalisk fosfatase farging kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Immunofluorescence
- Kultur de IPSC koloniene i 3-5 dager i IPSC medium med 10 ng / ml bFGF.
- Slik starter du en immunfluorescens assay, vaske iPSCs gang med PBS og deretter fikse dem med 1 ml 4% PFA i 20 min ved RT.
- Vask cellene tre ganger med PBS for å fjerne rester av PFA.
- Behandle faste iPSCs med 1 ml permeabilization / blokkeringsløsning inneholdende 4% geiteserum, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 og 0,05% natriumazid (NaN3) i 1 time ved RT.
- Aspirer blokkeringsløsning og inkuber de fikserte celler med primære antistoffer i 3% BSA og 0,05% NaN 3 løsning O / N ved 4 ° C (se tabell materiale for primært antistoff listen og antydet antistoff fortynningsfaktor).
- Den neste dagen, vaske iPSCs tre ganger med PBS, deretter inkuberes cellene med Alexa Fluor 488 geit anti-mus og Alexa Fluor 555 geite-anti-kanin-antistoffer, ble fortynnet 1: 1000 i 3% BSA og 0,05% NaN 3-løsning, i 1 time ved 37 ° C.
- Flekk kjernene med DAPI (1 ug / ml) i 10 minutter ved romtemperatur i mørket, etterfulgt av vasking tre ganger med PBS.
- Differensiering av iPSCs i embryoid Bodies (EBS)
- Kultur de IPSC koloniene for 5-6 dager i IPSC medium med 10 ng / ml bFGF.
- Fjern differensierte deler fra IPSC kolonier ved å aspirere, under disseksjonsmikroskop i plukking-hette.
- Inkuber iPSCs med 1 ml IV kollagenase (1 mg / ml) i 10 minutter ved 37 ° C.
- Aspirer enzymoppløsning, skylles cellene med 1 ml av KO-DMEM og samle koloniene i et 15 ml konisk rør. Sentrifuger ved 100 xg i 2 min ved RT.
- Aspirer supernatanten og resuspender koloniene i 2 ml EB medium bestående av KO-DMEM, 20% føtalt bovint definert serum (FBS), 1 mM NEAAs, 1% penicillin / streptomycin, 20 mM L-glutamin, 0,1 mM46; merkaptoetanol.
- Plate IPSC kolonier i suspensjon i 6 dager på ultralave feste 6-brønns plater, for å tillate dannelsen av kuleformede tredimensjonale embryoide legemer (EBS). Endre 2 ml frisk EB medium hver dag.
- På dag 7, samle EBS og porsjon dem på 0,1% gelatin belagt 6-brønns plater i 2 ml medium EB og opprettholde EBS i differensiering i 20 dager.
- Endre 2 ml frisk EB medium hver dag.
- QRT-PCR for Gene Expression Analysis
- Kultur de IPSC koloniene for 5-6 dager i IPSC medium med 10 ng / ml bFGF.
- Utdrag total RNA fra PBMNCs, iPSCs eller EBS bruker 1 ml av kommersielle reagenser i samsvar med produsentens anvisninger.
- Evaluere RNA konsentrasjon og renhet ved hjelp av egnede metoder slik som bruk av et spektrofotometer (høy kvalitet RNA med en 260 / A 280 260 og A / A 230-forhold> 1,8) 27.
- SjekkRNA integritet ved hjelp av et kommersielt kit i henhold til produsentens protokoll (høy kvalitet RNA RQI> 9.5) 28.
- Utføre en revers transkripsjonsreaksjon på 1 mikrogram av total RNA ved anvendelse av en kommersielt-revers transkriptase kit ifølge produsentens instruksjoner.
- Forbered qPCR blandinger som inneholder 5 ng cDNA mal, 7,5 mL SYBR GREEN Supermix, 2 ul av fem mikrometer primere (forward: 1 pl og omvendt: 1 pl) og 6 pl RNase / DNase-fritt vann for hver reaksjon 29.
- Utfør QRT-PCR ved bruk av følgende program: en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser oppdelt i et denatureringstrinn ved 95 ° C i 15 sek, og primer-annealing og forlengelsestrinn ved 60 ° C i 45 sek 29.
- Normalisere ekspresjon av andre gener ved hjelp av GAPDH som husholdningsgenet 28 (se primere er oppført i tabell 1).
- qPCRfor Transgene Utelukkelse
- Ekstrahere DNA fra PBMNCs eller iPSCs ved hjelp av 1 ml lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% natriumdodecylsulfat (SDS) og 20 pg / ml proteinase K.
- Legg et like stort volum (1 ml) av 100% isopropanol, blandes ved inversjon tre ganger for å tillate DNA-utfelling og sentrifuger ved 10 000 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, vask DNA-pellet med 1 ml 70% etanol og sentrifuger ved 10 000 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Aspirer og kast supernatanten og resuspender det i RNase / DNase-fritt vann.
- Vurdere DNA-konsentrasjon og renhet ved hjelp av egnede metoder slik som bruk av et spektrofotometer (høy kvalitet RNA med en 260 / A 280 260 og A / A 230-forhold> 1,8) 27.
- Forbered qPCR blandinger som inneholder 5 ng DNA mal, 7,5 mL SYBR GREEN Supermix, 2 mL av fem mikrometer primere (forward: 1 pl og omvendt: 1 pl) og 6 &# 181; l av RNase / DNase-fritt vann for hver reaksjon 29.
- Normalisere ekspresjonen av spesifikke episomale plasmid EBNA-1-genet ved hjelp av FBX-15 som husholdningsgenet 29 (se primere er oppført i tabell 1).
- Karyotype Analyse
- Kultur de IPSC koloniene for 5-6 dager ut mot mater fritt basalmembran matrix belagt plate med en kommersiell definert, mater fritt vedlikehold medium for iPSCs, etter produsentens anvisninger.
- For å starte karyotype-analyse protokoll, løsner IPSC kolonier med 1 ml av celle løsgjøring oppløsningen i 5 minutter ved 37 ° C, inntil det oppnås enkelt-celle dissosiasjon.
- Samle celler og sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved RT.
- Resuspender iPSCs i 2 ml av et medium som er utviklet spesielt for dyrking av celler for prenatal diagnostiske teknikker. Plate encellede iPSCs ut mot basalmembran matriks belagt glass retter og inkuber dem i en 37 ° C, 5% CO 2 </ Sub> inkubator.
- Etter 2-4 dager, tilsettes 10 ul / ml colchicin direkte til kulturene og inkuberes i 3 timer ved 37 ° C, 5% CO2 i en fuktig inkubator.
- Aspirere mediet og inkuberes iPSCs i 1 ml av en hypoton løsning (0,6% natriumsitrat og 0,13% kalium-klorid) i 10 minutter ved RT.
- Skyll-celler med 1 ml av 5% eddiksyreløsning og rette iPSCs med metanol / eddiksyreløsning (forhold 3: 1) i en maskin med kontrollert temperatur og fuktighet (28 ° C, 42% RH).
- Fordype og beis fast celler med Quinacrine løsning for 15-20 min ved RT i mørket (for å få Q-banding) 30.
- Tilegne cellemeta under et fluorescens mikroskop ved 100X forstørrelse 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble en enkel og effektiv protokoll for generering av virusfrie iPSCs ved omprogrammering av PBMNCs isolert fra buffy coats frosne etter sentrifugering av fullblod og sammenligning med omprogrammering av PBMNCs oppnådd etter densitetsgradient separasjon er angitt. Figur 1A viser en skjematisk fremstilling av den detaljerte protokollen. Etter tining de isolerte PBMNCs, som viser en typisk avrundet form, ekspanderes i bestemte blodkulturmedium i 14 dager (figur 1B), og deretter transfektert med episomale plasmider. Etter 10-15 dager etter transfeksjon, små runde lyse kolonier med definerte marginer og embryonal stamcellelignende morfologi begynner å vises (figur 1C). Ca 20-30 dager etter transfeksjon, IPSC koloniene blir svært kompakt, med skarpe kanter, øke sin størrelse og er klare for plukking og ekspansjon (figur 1D). Etter første aging trinn (2-3 passasjer),IPSC kolonier opprettholde sin udifferensiert tilstand og viser en typisk humane embryonale-stamcelle morfologi. I løpet av de første passasjer, er manuell plukking en mer effektiv måte i forhold til ekspansjons enzym dissosiasjon for å velge fullt udifferensierte, kompakt og tett pakket kolonier (figur 2A). Større forstørrelse av IPSC kolonier viser individuelle celler i koloniene og den høye kjernen til cytoplasma ratio er lettere observert (figur 2B). Etter innledende mekanisk plukking, er valgt IPSC kloner utvidet med enzym dissosiasjon bruker Kollagenase IV. Etter 10-15 passasjer av in vitro ekspansjon, er cytogenetisk analyse utført på IPSC kolonier. Rundt 20 metafaser fra minst to uavhengige kulturer, ved omtrent 300-400 båndet nivå, blir analysert og alle prøvene viser en normal karyogram (figur 2C). Denne observasjonen tyder på at iPSCs er genetisk stabil.
After in vitro ekspansjon (5-10 passasjer), er karakterisert iPSCs for ekspresjon av stemness markører og deres pluripotency potensial. Figurene 3A, B viser at iPSCs er positive for alkalisk fosfatase-farging. Bruke QRT-PCR analyse har vi bekreftet at iPSCs uttrykke endogene pluripotente gener (SOX-2, OCT3 / 4, Nanog) ved betydelig høyere nivåer enn start PBMNCs, mens uttrykk nivåer av endogen C-MYC og KLF-4 er lik før og etter IPSC omprogrammering (Figur 3C). Etter bare 5 passasjer i kultur, kan ekspresjon av eksogene episomale transgener ikke påvises i iPSCs, og således indikerer en vellykket aktivering av endogene gener pluripotente. PBMNCs 5 dager etter transfeksjon med sterk transgen ekspresjon nivå, evalueres av episomale spesifikke primere for EBNA-1, blir brukt som positiv kontroll. PBMNCs som aldri blir utsatt for plasmider som bærer de fire eksogene pluripotency gener, anvendes som negativ kontroll (Figur 3D). Endelig viser immunofluorescensanalyse at iPSCs uttrykke pluripotency markører, slik som OCT3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60, og TRA-1-81 (figur 4).
iPSCs blir differensiert i embryoide legemer (EBS) ved hjelp av en spontan differensiering protokoll, slik som vist i figur 5A, for å vurdere deres in vitro pluripotency potensial. QRT-PCR eksperimenter viser at iPSCs er i stand til å differensiere til celler av de tre bakterie lag; Faktisk, EBS oppnådd etter 20 dager med differensiering skjerm betydelig oppregulering av avstamning markører representativt for endoderm (SOX-7, AFP), mesoderm (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1) og ektoderm (KTR- 14, TH, GABRR-2) (figur 5B). Konfokalmikroskopi Analysen viser at encellede dissosiert slo klynger uttrykke typiske cardiomyocyte markører som troponin I (TN-I) og α-Actinin, organisert på en klar sarcomeric mønster (Figur6A). I tillegg immunofluorescensanalyse av EBS viser en positiv farging for neuron-spesifikk markør klasse III β-Tubulin (TUJ1) så vel for det dopaminerge neuronal markør tyrosin hydroksylase (TH) (figur 6B).
Figur 1. Protokoll for generering av iPSCs fra humant perifert blod og celle morfologiske endringer i protokollen. (A) Diagram av protokollen som brukes til å generere iPSCs fra fryste PBMNCs etter DGS og PBMNCs isolert fra buffy coats frosne, ved hjelp av en enkel transfeksjon av ikke å integrere episomale plasmider. (B) Representative bilder av prolifererende PBMNCs hentet fra DGS og buffy strøk etter tining og ekspansjon i kultur i 14 dager, før de blir tilført. Scale bar 100 mikrometer. (C) Eksempler på IPSC kolonier en uke etter at cellene er plrerte på MEFs. Scale bar 500 mikrometer. (D) Representative bilder av IPSC kolonier på 30-35 dager etter re-plating på en MEF mater-lag. Scale bar 500 mikrometer. iPSCs = indusert pluripotente stamceller; DGS = tettshetsgradient separasjon; PBMNCs = perifere mononukleære blodceller; MEFs = mus embryonale fibroblaster; GFS = vekstfaktorer; bFGF = basisk fibroblast vekstfaktor; NaB = natriumbutyrat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. og karyotype analyse. (A) Representative bilder av IPSC kolonier etter 2-3 manuelle aging trinn. Scale bar 500 mikrometer. (B) Større forstørrelse på IPSC kolonier. Scale bar 200 mikrometer. (C) representative normale karyograms fra iPSCs etter 10-15 passasjer av in vitro ekspansjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. IPSC karakteristikk: alkalisk fosfatase-aktivitet, re-ekspresjon av endogene gener pluripotency iPSCs og evaluering av transgene lyddemping (A) og (B) Representative bilder som viser positiv farging for alkalisk fosfatase.. Scale bar 500 mikrometer. (C) Den søylediagram som viser gjen uttrykk for endogene pluripotency gener (C-MYC, KLF-4, SOX-2, OCT3 / 4 og Nanog) i begge iPSCs hentet fra DGS og buffy strøk, ved hjelp QRT-PCR-analyse ( n = 4, Student t-test: * p <0,05, § p <0,005 vs tilsvar PBMNCs). (D) QRT-PCR med episomale-spesifikke primere (EBNA-1) (i forhold til kontroll FBOX15 primere) viser ingen genom-integrering av episomale vektorer. (N = 4, Student t-test: * p <0,001 vs tilsvar PBMNCs 5-dagers transfeksjon). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Immunofluorescensanalyse av embryonale stamceller pluripotency markører. Representant immunfluorescens farging viser betydelig uttrykk for pluripotency proteiner SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, OCT3 / 4 og SOX-2. Atomkjerner er motfarget med DAPI. Scale bar 200 mikrometer for IPSC DGS (A) og IPSC Buffy coat (B). Scale bar 100 mikrometer for IPSC Buffy coat (A), IPSC DGS (B strong>) og (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Protokoll for differensiering av iPSCs og ekspresjon av tre lag bakterie gener i EBS oppnådd fra iPSCs. (A) Skjematisk representasjon av protokollen å indusere differensiering av spontan iPSCs fra PBMNCs etter DGS og buffy coats på EBS. (B) QRT-PCR eksperimenter som viser uttrykk for alle tre bakterie lag gener: endoderm (SOX-7, AFP), mesoderm (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1), og ektoderm (KRT-14, TH, GABRR-2) i EBS etter 20 dager med differensiering (n = 4, Student t-test: * p <0.05 vs tilsvar iPSCs motstykke). EBS = embryoid organer./52885/52885fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Konfokalmikroskopi analyse av hjerte- og nevronale proteiner i EBS på dag 20 av differensiering hentet fra PBMNCs etter DGS og buffy coats-avledet iPSCs. (A) Representative bilder (maksimal projeksjon av konfokalt bildestakk) for hjerte sarcomeric proteiner α-Actinin og troponin I (Tn-I) i enkelt-celle dissosiert slo områder (målestokken 10 um) og (B) for neuron-spesifikk markør klasse III β-Tubulin (TUJ1) og dopaminerge neuronal markør tyrosin hydroksylase (TH) (skala bar 20 mikrometer). Atomkjerner er motfarget med DAPI. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.
| Primer | Sequence | ||
| C-MYC fw | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 ' | ||
| C-MYC rev | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 ' | ||
| KLF-4 fw | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 ' | ||
| KLF-4 rev | 5'- AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 ' | ||
| SOX-2 fw | 5'- GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 ' | ||
| SOX-2 rev | 5'- TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3 | ||
| OCT3 / 4 fw | 5'- GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 ' | ||
| OCT3 / 4 rev | 5'- CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 ' | ||
| Nanog fw | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 ' | ||
| Nanog rev | 5 &# 8242, -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 ' | ||
| SOX-7 fw | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 ' | ||
| SOX-7 rev | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 ' | ||
| AFP fw | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 ' | ||
| AFP rev | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 ' | ||
| CD31 fw | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 ' | ||
| CD31 rev | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 ' | ||
| ACTA-2 fw | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 ' | ||
| ACTA-2 rev | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 ' | ||
| CDH-5 fw | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 ' | ||
| CDH-5 rev | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 ' | ||
| RUNX-1 fw | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 ' | RUNX-en rev | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 ' |
| KRT-14 fw | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 ' | ||
| KRT-14 rev | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 ' | ||
| TH fw | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 ' | ||
| TH rev | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 ' | ||
| GABBR-2 fw | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 ' | ||
| GABBR-2 rev | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 ' | ||
| EBNA-1 fw | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 ' | ||
| EBNA-1 rev | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 ' | ||
| GAPDH fw | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' | ||
| GAPDH rev | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ' |
Tabell 1: Liste over QRT-PCR primere primersekvenser brukes til evaluering av endogen pluripotency genuttrykk, transgen taushet uttrykk for tre bakterie lag markører..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det siste, den eneste måten å få menneskelige pluripotente stamceller som bærer en bestemt genetisk mutasjon var å rekruttere foreldre som gjennomgår pre-implantasjon genetisk diagnose og generere embryonale stamceller fra sine kasserte blastocysts 31,32. Ved hjelp av en omprogrammering tilnærming, kan forskerne nå generere iPSCs fra pasienter som frakter nesten enhver genotype. Muligheten for å starte fra en pasient-spesifikk cellelinje og en lett tilgjengelig kilde er meget viktig da den tillater en undersøkelse av patofysiologien av lidelser og etterfølgende identifisering av nye terapeutiske tilnærminger.
I denne studien har vi kombinert en plasmid tilnærming 15 med en metode som allerede er brukt til å produsere iPSCs fra PBMNCs tidligere frosne etter tettshetsgradient separasjon 22 og hell genererte virusfritt iPSCs fra frosne buffycoat PBMNCs. Bruken av buffy coats istedenfor densitetsgradient separert PBMNCs alleOWS oss å redusere kostnader, arbeidstid og manuelle trinn for operatører under utvalgets behandling. Oppsett av en lav-kost-protokollen med PBMNCs fra frosne buffy strøk er viktig for studier med forhøyet antall deltakere og for eksempelsamlinger i multisenterstudier. Viktigere, evnen til å produsere iPSCs fra frosne buffy coats gir tilgang til en rekke fryste biosamples som allerede er lagret i blodbanker, ved hjelp av en enkel, kostnadseffektiv og ikke så tidkrevende metode for prøvetaking.
Denne induksjonsmetode kan være nyttig for avledning av pasientspesifikke integrasjonsfrie iPSCs, hvor kolonier kjennetegnes ved fravær av episomal transgenet etter bare noen få passasjer (≥5 passasjer), i begge utgangsmaterialer. Bemerkelsesverdig, observerte vi at alle de valgte IPSC koloniene hentet fra begge typer utgangsmaterialet vise sammenlign pluripotency funksjoner og bevaring av cellulære og molekylære likheter til hESCs, indicating en vellykket IPSC avledning og en konsekvent reproduserbarhet av protokollen.
Videre har vi lykkes generert iPSCs fra mer enn 10 menneskelig hud fibroblast og tre hjerte mesenchymale stromal cellelinjer (både fra friske donorer og pasienter med hjerte- og skjelettmuskelsykdommer) ved hjelp av denne metoden (data ikke vist), og dermed tyder på at den beskrevne protokollen kan benyttes for en vellykket omprogrammering av forskjellige celletyper. Imidlertid er valget av blod som utgangsmateriale fordelaktig i forhold til fibroblaster, spesielt tatt i betraktning at omfattende utvidelse av fibroblaster in vitro kan påvirke effektiviteten av omprogrammering, basert på fibroblast passasje nummer og formeringshastigheten 33,34. Vår protokollen tillater også generering av transgene fritt iPSCs fra frosne buffy coats etter en minimal kultur tid, og dermed reduseres med omtrent 3-4 uker, tiden som er nødvendig for utledning av iPSCs sammenlignet med andre kilder, for eksempel fibroblasts. Videre nyere studier viser at blodcelle-avledet iPSCs vise en epigenetisk signatur som mer ligner hESCs enn de innhentet fra mesenchymale stamceller (MSC) / fibroblaster 14,35.
Til tross for den vellykkede generasjonen av iPSCs fra frosne buffy strøk, noen begrensninger som må vurderes i denne protokollen. Før omprogrammering induksjon, kan forsterkningen av PBMNCs fra frosne buffy coats representerer et kritisk trinn i protokollen. Kvaliteten av utgangsmaterialet kan sterkt påvirke utvelgelse og isolering av PBMNCs, for å oppnå tilstrekkelig celletallene for omprogrammering prosedyre (minst 2 x 10 6 celler for elektroporering). Dette er hovedsakelig på grunn av iboende biologiske variasjoner av prøvene, men også tekniske problemer. Faktisk, er forsterkningen av PBMNCs fra frosne buffy coats mindre effektiv enn PBMNCs oppnådd fra tetthetsgradient separasjon, på grunn av de sterkehet på manuell operatør variasjon. For å øke reproduserbarheten og effektiviteten av PBMNC forsterkning av frosne buffy coats uten tetthetsgradient separasjon, er bruk av automatiserte systemer sterkt anbefalt å samle buffy coat fraksjoner. Selv om det er vanskeligere å utvide et tilstrekkelig antall PBMNCs fra buffy coats enn PBMNCs tetthetsgradient etter separasjon, er effektiviteten av reprogrammerings (ca. 0,001 til 0,0005%) av de to utgangsmaterialer sammenlignes, i henhold til blod omprogrammering effektivitet tidligere rapportert 14, 23. Siden omprogrammering virkningsgrad er lav for regenerativ medisin formål, ved bruk av forbedrede EBNA1 / OriP (fra Epstein-Barr virus, EBV) episomale vektorer kan øke antallet av kolonier IPSC for fremtidig utvikling celleterapi 22,36. I tillegg er en MEF matersjikt for IPSC generering og vedlikehold som brukes i vår protokoll. For å oppnå klinisk kvalitet iPSCs, kan en mater fritt kultur være en alternative metode for videre studier.
Som konklusjon, representerer denne protokollen en gyldig metode for å generere iPSCs fra en lett tilgjengelig kilde med pasienten celle den store fordelen av å bruke et ikke-integrerende system som kan potensielt brukes til avledning av klinisk kvalitet iPSCs, ikke bare for sykdom modellering men også for en fremtidig personlig medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
