Summary
诱导多能干细胞（iPS细胞）代表的患者特异性组织为临床应用和基础研究的来源。在这里，我们提出了一个详细的协议来重新编程从冷冻棕黄色大衣将获得使用非整合游离病毒质粒无iPSCs的人外周血单个核细胞（外周血单个核细胞）。
Abstract
体细胞可以通过迫使四个转录因子（Oct-4的，SOX-2，KLF-4，和c-Myc）的表达重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞），通常由人类胚胎干细胞中表达（胚胎干细胞） 。由于它们的相似性与人类胚胎干细胞，iPS细胞已成为潜在的患者特异性再生医学的重要工具，避免了与人类胚胎干细胞相关的伦理问题。为了获得适合于临床应用的细胞，转基因的无iPSCs的需要产生，以避免转基因激活，改变的基因表达和误导分化。此外，高效率的和廉价的重编程方法是必要的，以获得足够的iPSC用于治疗目的。鉴于这种需求，一个高效的非整合附加型质粒的方法是对的iPSC衍生的优选的选择。隔离，其中当前用于重编程的目的是最常见的细胞类型是成纤维细胞，需要组织活检，一个我nvasive外科手术的病人。因此，人外周血代表的iPSC一代最容易和最不侵入性组织。
在这项研究中，使用非整合附加型质粒具有成本效益和病毒 - 自由协议报从后全血离心分离，没有密度梯度分离从冷冻血沉棕黄层获得的人外周血单核细胞（外周血单个核细胞）的iPSCs的产生。
Introduction
在2006年，该基山中伸弥1展示首次从成年小鼠和人类体细胞可以通过四种重编程因子（Oct-4的，SOX-2，KLF-4，和异位表达被转换成多能状态c-Myc的），产生了所谓的诱导多能干细胞（iPS细胞）2。患者特异性的iPSC中的形态，增殖和分化成三胚细胞类型（中胚层，内胚层和外胚层）的能力方面非常类似于人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），而缺乏相关的使用人类胚胎干细胞和旁路的伦理问题可能的免疫排斥反应3。因此，iPS细胞表现为患者特异性的细胞为基础研究，药物筛选，疾病建模，毒性的评价，和再生医学的目的4的最重要来源之一。
几种方法已用于iPSC的生成：病毒整合载体（逆转录病毒5，慢病毒6），病毒非整合载体（腺病毒7），仙台病毒8，BAC座子9，附加型载体10，蛋白质11或RNA递送12。虽然使用病毒介导的方法可导致高效率的重编程，病毒载体整合到宿主细胞，因此潜在随机插入 突变的基因组中，基因表达，和沉默的转基因的再活化的分化过程中的永久改变，不能排除13。
使iPSCs的安全再生医学，已经作出努力来推导的iPSC未经外源DNA整合到细胞基因组中。虽然应纳税病毒载体和转座子被开发出来，它仍然是不清楚短载体序列，这不可避免地留在切除后的转导的细胞，和转座表达，是否可以诱导改变在细胞ular功能13。尽管其高重编程效率，仙台病毒代表一种昂贵的方法，并达到通授权的关注与开发的这个系统必须限制其应用在翻译研究的潜力公司。此外，需要对直接引入蛋白质和RNA的需要多个递送重新编程分子的固有技术局限性此介绍的，和总重编程效率是非常低的14。值得注意的是，具有成本效益的基础上，利用附加型质粒的病毒-自由和非整合的方法已被成功地报道了皮肤成纤维细胞15的再编程。具体而言，在本工作中，我们决定使用市售集成无附加型质粒，如先前报道10,15。
迄今为止，皮肤成纤维细胞代表了最流行 施主小区类型5。然而，其他细胞来源已经更迭sfully重编程为iPS细胞包括角质形成细胞16，骨髓间充质干细胞17，脂肪基质细胞18，毛囊19与牙髓细胞20。这些细胞的分离，需要外科手术，并以建立原代细胞培养，需要在体外细胞扩增几个星期。
有鉴于此，起始细胞类型的选择是至关重要的，但同样重要的是能够从方便和较少侵入性的组织，例如血液产生的iPSC。两个脐带血单核细胞（CBMNCs）21,22和外周血单核细胞（外周血单个核细胞）14,22-24表示细胞为iPS细胞的推导合适来源。
虽然成人PBMNC重编程的效率比CBMNCs 22的低20-50倍，它们仍然是最方便的细胞类型为取样目的。在事实上，PBMNC取样有被微创的优点，此外，这些细胞不需要重新编程实验之前在体外广泛扩展。迄今为止，不同的协议已经报道，密度梯度分离后外周血单个核细胞可冷冻后冷冻和解冻天至数月并重新编程成iPS细胞22,23之前膨胀为几天。然而，就我们所知没有报道描述从冷冻的血沉棕黄层外周血单个核细胞的重编程。重要的是，没有密度梯度分离收集冷冻棕黄色大衣代表存储在从人口研究大型生物库，从而代表材料的生产的iPSC以避免进一步的样品采集的方便池中最常见的血液样本。
此处我们报告首次病毒无iPSCs的产生来自人类冷冻血沉棕黄层，根据先前描述的方案22。在此外，从密度梯度分离之后得到的冷冻外周血单个核细胞生成的iPSCs，对于非密度梯度纯化PBMNC结果的控制协议。
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Protocol
外周血单个核细胞（外周血单个核细胞）后，从签署知情同意书和南蒂罗尔省的伦理委员会批准献血者健康人外周血标本中分离。实验是按照在表达赫尔辛基宣言的原则进行。所有的数据收集和分析了匿名。
1.分离外周血单个核细胞（外周血单个核细胞）
- 从全血中离心后的血沉棕黄层获得外周血单个核细胞，没有密度梯度分离。
- 收集8毫升静脉外周血成柠檬酸钠缓冲的塑料管，并储存在室温（25℃）。在采集后12小时过程血。
- 离心管中，在2000×g离心15分钟，在4℃下，在吊桶式转子，开关关闭离心机刹车。
- 收集阴天棕黄层（上层血浆相和下之间的层相含有大部分的红细胞），将含有富集的PBMNC级分（500微升）到离心管筒。
- 悬浮500μl的棕黄层用500μl含有90％FBS和20％DMSO的2×冷冻介质中，在为了得到1毫升，用10％的DMSO浓度的总体积。
- 冻结在受控速率冷冻容器小瓶在-80℃下。商店细胞在液氮中更长时间。
- 密度梯度分离后获得外周血单个核细胞
- 收集12ml含静脉外周血成柠檬酸钠缓冲的塑料管，并储存在室温。在采集后12小时过程血。
- 稀释血液用无菌PBS以35 ml的终体积。
- 小心缓慢，层35毫升稀释血液15毫升多聚蔗糖溶液（用于密度梯度分离）（p值= 1.077）在50ml锥形管（比率3:1）。
- 离心管中，在800×g离心在室温30分钟在吊桶式转子，开关关闭离心机刹车。
- 吸上，含血浆黄相并丢弃。仔细，含有外周血单个核细胞的不透明白色相间层转移到新的50ml锥形管中。
- 将总体积至30ml用无菌PBS和离心机在300×g离心在室温10分钟。
- 弃上清，重悬细胞用30ml PBS中。计数活细胞的数目，根据台盼蓝排除25。
- 离心机外周血单个核细胞在300×g离心10分钟，在室温，吸出上清液，并丢弃它。
- 重悬细胞沉淀在含有90％FBS和10％DMSO的冷冻介质的一个合适的量，以获得5×10 6个细胞/ ml的浓度。
- 等分试样1毫升每小瓶（约5×10 6个细胞/ ml）并冷冻小瓶在受控速率冷冻集装箱- 80℃。商店细胞在液氮中更长时间。
2.解冻和外周血单个核细胞的电镀（0天）
- 从全血中离心后的血沉棕黄层获得外周血单个核细胞，没有密度梯度分离。
- 开始使用从冷冻血沉棕黄层外周血单个核细胞的协议，解冻1小瓶细胞在水浴中在37℃和稀释的血沉棕黄层用无菌PBS至2ml的最终体积。
- 传送稀释的血沉棕黄层到50毫升锥形管，加入10毫升红细胞裂解缓冲液，孵育在室温10分钟。
- 而制成500毫升红细胞裂解缓冲液，加入0.5克碳酸氢钾，4.145克氯化铵，100微升的0.5M EDTA溶液至500ml的超纯水，pH值7.2-7.4。
- 将总体积至50ml用无菌PBS和离心机在300×g离心在室温10分钟。
- 弃去上清液，并用50ml无菌PBS洗涤沉淀，离心血沉棕黄层，在300×g离心在室温10分钟。
- 悬浮细胞中1毫升PBMNC介质，如前所述22，组成：IMDM和火腿的F-12（比例为1：1），胰岛素-转铁-硒-乙醇胺（ITS-X），经化学为1％的1％定义脂质浓缩（CDL），1％青霉素/链霉素，L-抗坏血酸酸0.005％，牛血清白蛋白（BSA）的0.5％，1-硫代甘油（终浓度都是200μM），干细胞因子SCF（100毫微克/毫升），白细胞介素-3，IL-3（10毫微克/毫升），促红细胞生成素的EPO（2单位/毫升），胰岛素样生长因子IGF-1（40毫微克/毫升），地塞米松（1μM）和全息转铁蛋白（100μg/ ml的）。
- 他们转移到一个12孔板用标准组织培养处理过的表面的一个孔，无涂层，以2×10 6个细胞/ ml的密度。孵育细胞在37℃，5％CO 2的加湿培养箱中48小时，直到变换媒体的步骤（见第3节）。
- 密度梯度分离后获得外周血单个核细胞
- 要使用冷冻的外周血单个核细胞后启动协议密度梯度分离，解冻1小瓶细胞在水浴中在37℃下，转移细胞到5毫升PBMNC培养基。离心在300×g离心在室温10分钟。
- 重悬细胞于1ml PBMNC培养基中，并将它们转移到一个12孔板的一个孔，以2×10 6个细胞/ ml的密度。孵育细胞在37℃，5％CO 2的加湿培养箱中48小时，直到变换媒体的步骤（见第3节）。
3.文化与扩张外周血单个核细胞的（2-13天）
- 收集外周血单个核细胞在悬浮培养中，用移液管以1毫升尖，在15ml锥形管中并离心，在300×g离心在室温10分钟。
- 弃去上清液并将细胞重新悬浮在1ml新鲜的外周血单个核细胞培养基。
- 转移细胞进入1井的12孔板用标准组织培养处理过的表面，没有涂布，并孵育它们在37℃，5％CO 2的加湿培养箱。
4.转染外周血单个核细胞与附加型质粒（第14天）
注意：执行四个商业intergation无游离型质粒的分离，使用商业试剂盒进行质粒纯化携带的多能性基因和评估使用琼脂糖凝胶电泳分析纯化的质粒的质量，根据制造商的说明。
- 收集在15ml锥形管中外周血单个核细胞并计数活细胞的数量25（台盼蓝排斥的基础上）。
- 离心机2×10 6个细胞，在300×g离心在室温10分钟。
- 重悬2×10 6个细胞在含有100微升的再悬浮缓冲液T和各1μg质粒DNA转染混合物（一个质粒携带OCT3 / 4和shRNA抗p53，一个质粒携带SOX2和KLF4，人们质粒携带的L- MYC和LIN28和一种质粒携带绿色荧光蛋白，以检查转染效率）。
- 吸含有细胞的转染混合物加入100微升尖端和插入与样品垂直插入管中，填充用3ml电解缓冲液的E2，置于电穿孔机的吸移管站的移液管，按制造商的说明。
- 使用以下程序有效电穿孔细胞：1650伏，10毫秒，3个脉冲。
- 重悬电穿孔的细胞（2×10 6个细胞）于2ml预热PBMNC培养基中，加入0.25毫丁酸钠（NAB）和计数存活细胞的电穿孔规程后的数字25（台盼蓝排斥的基础上）。
- 转移细胞到6孔板的一个孔中无涂层，轻轻摇动平板孵育所述细胞在37℃，5％CO 2的加湿培养箱。
- 电穿孔，COUN后的第二天吨GFP阳性细胞的荧光显微镜下从8-10随机字段的数量，以评估转染效率。
- 维持转染的细胞不分裂为3天，直到镀它们的MEF（参见第6节）。
- 代替加入2ml新鲜外周血单个核细胞培养基，再加0.25毫酸钠每两天。
5.准备菜肴馈线细胞共培养（16天）
- 外套一个6孔板用1ml基底膜基质的15分钟的，在37℃和板小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）以2×10 5个细胞的密度/孔用2毫升10％FBS的含有孔DMEM（MEF中）1天传代电外周血单个核细胞到MEF饲养细胞之前。
6.镀染外周血单个核细胞上的MEF（17-19天）
- 收集悬浮培养外周血单个核细胞，用移液管与1ml尖，在15ml锥形管中，并离心转染外周血单个核细胞在300×g离心10分钟在RT。
- 弃上清，重悬沉淀在2ml新鲜PBMNC介质，加上0.25mM的丁酸钠。
- 板上的细胞上的MEF涂覆的6孔板孵育所述细胞在37℃，5％CO 2的加湿培养箱。
- 两天后，吸出培养基并用2ml的iPSC介质的敲除DMEM（KO-DMEM），20％KO-血清替代（KOSR），1mM的NEAAs，1％青霉素/链霉素，20mM的组成取代的L-谷氨酰胺，0.1mM的β巯基乙醇，10纳克/毫升的FGF（基本的bFGF）和0.25毫酸钠。
- 更换每天上午2毫升新鲜的iPSC中，每天检查的细胞。
注：在大约22-25天，iPS细胞的第一殖民地应该是可见的。
7.采摘和扩张诱导多能干细胞的（iPS细胞）克隆（30-35天）
注：在转染后约30-35天，菌落的iPSC应准备好采摘和replating。重编程效率应ESTI配合作为的iPSC集落/电穿孔的细胞的总数量的数量的百分比，如先前报道26。
- 传代的iPSC集落的前一天，制备MEF饲养在12孔板（1.25×10 5个细胞/孔）。
- 吸的MEF培养基，改变用1mL的iPSC培养基用10ng / ml的bFGF和10μM的Y-27632。手动用针一个菌落，以获得栅格解剖在采摘机罩的解剖显微镜下，每次，通过移液收集较小的块和每个单独的转移成的12孔板涂覆的MEF一个阱。
- 通道和扩展每个12孔板到6孔板中的比率为1：2，然后每6孔板中的比率1：进一步传播4。解剖和手动展开的iPSC用于第一2-3代（如在步骤7.2中全面描述），然后用一种酶分解过程（从步骤7.4启动）。
- 对于酶分解协议，干净的iPSC科洛尼ES通过吸差异部分，在采摘机罩的解剖显微镜下。
- 孵育的iPSC用1mlⅣ型胶原酶（1毫克/毫升）10分钟，在37℃。
- 吸酶溶液冲洗细胞用1ml KO-DMEM中并收集菌落在15ml锥形管中。离心，在100×g离心在室温2分钟。
- 吸出上清，重悬在2ml的iPSC介质的菌落用10ng / ml的bFGF和10μM的Y-27632和板他们在MEF涂覆的6孔板（比率1:4）。
iPS细胞的表征8.（5-15之间代）
- 碱性磷酸酶染色
- 培养中的iPSC介质3-5天的的iPSC集落用10ng / ml的bFGF。
- 用于开始碱性磷酸酶染色方案，冲洗的iPSC一次用PBS，然后修复它们用1ml 4％PFA的20分钟，室温。
- 用PBS洗细胞三次，以去除残留的PFA。
- 使用染色固定的细胞根据制造商的说明商用碱性磷酸酶染色试剂盒。
- 免疫荧光
- 培养中的iPSC介质3-5天的的iPSC集落用10ng / ml的bFGF。
- 启动免疫荧光测定法中，用PBS洗涤一次的iPSC，然后修复它们用1ml 4％PFA的20分钟，在室温。
- 用PBS洗细胞三次，以去除残留的PFA。
- 对待固定的iPSC用1ml透化/阻挡含有4％山羊血清，0.1％BSA，0.1％的Triton X-100和0.05％叠氮化钠溶液（NaN 3的）处理1小时，在室温。
- 吸出封闭溶液并孵育固定的细胞用3％BSA的第一抗体和0.05％NaN 3的溶液O / N在4℃（检查一次抗体列表的材料表和建议的抗体稀释因子）。
- 第二天，洗涤的iPSC三次，用PBS，然后孵育细胞的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠和Alexa FLUOR 555山羊抗兔抗体，稀释1：1000中的3％BSA和0.05％NaN 3的溶液，1小时，在37℃。
- 染色用DAPI（1微克/毫升）的原子核在室温10分钟在黑暗中，接着是三个时间用PBS清洗。
- 在胚体iPS细胞分化（EBS）
- 培养中的iPSC介质5-6天的iPSC集落用10ng / ml的bFGF。
- 通过抽吸去除的iPSC菌落差异的部分，在采摘机罩的解剖显微镜下。
- 孵育的iPSC用1mlⅣ型胶原酶（1毫克/毫升）10分钟，在37℃。
- 吸酶溶液冲洗细胞用1ml KO-DMEM中并收集菌落在15ml锥形管中。离心，在100×g离心在室温2分钟。
- 吸出上清，重悬菌落在2ml KO-DMEM中组成的EB培养基中，20％的定义胎牛血清（FBS），1毫NEAAs，1％青霉素/链霉素，20mM的L-谷氨酰胺，0.1毫46;巯基乙醇。
- 板中的悬浮液中6天的iPSC集落到超低附件6孔板中，为了使球状三维胚体（EB）的形成。变化2毫升新鲜EB培养基每两天。
- 在第7天，收集EB中和板他们到0.1％明胶包被的6孔板的2ml的EB培养基中，并在分化维持胚20天。
- 变化2毫升新鲜EB培养基每两天。
- 定量RT-PCR基因表达分析
- 培养中的iPSC介质5-6天的iPSC集落用10ng / ml的bFGF。
- 提取外周血单个核细胞，iPS细胞或胚使用按照制造商的说明1毫升商业试剂总RNA。
- 评估RNA的浓度和纯度通过合适的方法，如使用分光光度计（高品质的RNA用A 260 / A 280和A 260 / A比值230> 1.8）27。
- 检查使用根据制造商的协议（高品质的RNA RQI> 9.5）28商业试剂盒的RNA完整性。
- 执行使用根据制造商的说明商用逆转录试剂盒1微克总RNA进行逆转录反应。
- 制备含5毫微克cDNA模板，7.5微升SYBR Green超，2微升5μM引物的qPCR的混合物（前锋：1微升和反向：1微升）和6微升RNA酶/ DNA酶的水每个反应29。
- 使用以下程序进行的qRT-PCR：起始变性步骤，在95℃进行10分钟，然后是40个循环分成一个变性步骤在95℃下15秒，引物退火和延伸步骤在60℃进行45秒29。
- 正常化使用GAPDH作为管家基因28的其它基因的表达（ 见表1中所列的引物）。
- 定量PCR对于转基因排除
- 使用将1ml含有50mM Tris，100毫摩尔EDTA，100毫摩尔NaCl，裂解缓冲液外周血单个核细胞或iPS细胞提取的DNA的1％十二烷基硫酸钠（SDS）和20微克/ ml的蛋白酶K.
- 加100％的异丙醇等量的（1毫升）中，以允许沉淀DNA，离心在10,000rpm×g离心5分钟，在室温颠倒混合三次。
- 弃去上清液，用1毫升70％乙醇和离心机以10,000×g离心洗DNA沉淀进行5分钟，在室温。吸弃上清，重悬它核糖核酸酶/ DNA酶的水。
- 评估DNA浓度和纯度通过合适的方法，如使用分光光度计（高品质的RNA用A 260 / A 280和A 260 / A比值230> 1.8）27。
- 制备含5毫微克的DNA模板，7.5微升SYBR Green超，2微升5μM引物的qPCR的混合物（前锋：1微升和反向：1微升）和6＃181;微升RNA酶/ DNA酶的水用于每个反应29。
- 正常化具体游离质粒EBNA-1基因的使用FBX-15作为持家基因29（参照表1中所列的引物）的表达。
- 核型分析
- 文化的iPSC菌落5-6天到无饲养基底膜基质涂板定义的商业，无饲养维修中的iPS细胞，按照生产商的说明。
- 要启动的核型分析协议，分离的iPSC集落用1ml细胞脱附溶液中5分钟，在37℃，直到获得单细胞解离。
- 收集细胞，离心，在400×g离心5分钟，在RT。
- 重悬的iPSC在2ml培养基中专门为进行产前诊断技术培养细胞的发展。板单细胞到iPSCs的基底膜基质镀 膜玻璃的菜肴，并培育他们在37℃，5％CO 2 </ SUB>孵化器。
- 后2-4天，直接添加10微升/毫升秋水仙碱到培养并在培养箱孵育3小时，在37℃，5％的CO 2。
- 吸出培养基并孵育的iPSC在1ml的低渗溶液（0.6％的柠檬酸钠和0.13％氯化钾），用于在室温下10分钟。
- 冲洗细胞用1ml 5％乙酸溶液和修复的iPSC用甲醇/乙酸溶液（比率3:1）中的机器具有受控温度和湿度（28℃，42％RH）。
- 浸泡和染色固定的细胞15-20分钟在黑暗阿的溶液在室温（获得Q-带）30。
- 在获得放大100倍29在荧光显微镜下的细胞分裂中期。
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Representative Results
在这项研究中的简单而有效的协议，用于病毒无iPSCs的由外周血单个核细胞从全血中离心分离和密度梯度分离报道后获得外周血单个核细胞的重新编程，比较后冷冻的血沉棕黄层中分离的重编程的产生。 图1A示出的示意图详细的协议。解冻后，分离的外周血单个核细胞，显示出典型的圆形形状，在特定的血液培养基中14天（ 图1B）展开，然后转染了附加型质粒。经过10-15天转染后，小圆角明亮菌落定义利润率和胚胎干细胞类似的形态开始出现（ 图1C）。转染后约20-30天，菌落的iPSC成为高度紧凑，边缘锋利，扩大规模，准备采摘和扩张（ 图1D）。后的第一传代步骤（2-3代），IPSC的殖民地维持其未分化状态，并显示一个典型的人类胚胎干细胞的形态。在第一段落，人工采摘是一种更有效的扩展方式相比，以选择完全未分化，紧凑和紧凑的菌落（ 图2A）酶分解。的iPSC集落的放大倍率示出了单个细胞集落内和高细胞核至细胞质的比例，更容易观察到（ 图2B）。最初的机械采摘后，选定的iPSC克隆扩大利用胶原酶Ⅳ酶分解。经过10-15代体外扩张，细胞遗传学分析上的iPSC菌落进行。来自至少两个独立的培养物，在大约300-400带水平约20个中期进行了分析，所有样品显示正常karyogram（ 图2C）。这一观察表明iPS细胞是遗传稳定的。
船尾尔的体外扩增 （5-10代），iPS细胞的特征在于用于干性标记物的表达及其多能性的潜力。 图3A，B表明iPS细胞是阳性的碱性磷酸酶染色。使用定量RT-PCR分析，我们已经证实的iPSCs表达内源性多能干基因（SOX-2，OCT3 / 4，NANOG）在显著水平高于起始外周血单个核细胞，而内源性c-myc和KLF-4的表达水平是相似的前和iPSC的重新编程后（ 图3C）。后仅5在培养传代，外源附加型的转基因表达，不能在iPSCs的检测，从而表明内源性多能干基因成功激活。外周血单个核细胞转染后5天，用强的转基因表达水平，通过附加型特异性引物对EBNA-1进行评价，被用作阳性对照。外周血单个核细胞即不会暴露于质粒携带4外源多能性基因，被用作阴性对照（ 连接古尔3D）。最后，免疫荧光分析显示，iPS细胞表达多潜能标志物，如OCT3 / 4，SOX-2，SSEA-4，TRA-1-60，和TRA-1-81（ 图4）。
iPS细胞分化成使用自发分化方案胚体（EB）， 如图5A所示 ，以评价它们在体外多能性潜能。定量RT-PCR实验表明iPS细胞是能够分化成三个胚层的细胞;的确，拟胚后20天的分化显示显著上调的谱系标记物代表定形内胚层（SOX-7，AFP），中胚层（CD31，ACTA-2，CDH-5，RUNX-1）和外胚层获得（KTR- 14，TH，GABRR-2）（ 图5B）。共聚焦显微镜分析表明，单细胞解离的跳动簇表达典型心肌标记物如肌钙蛋白I（TN-I）和α -肌动，组织在一个明确横纹肌图案（ 图图6A）。此外，胚的免疫荧光分析显示了阳性染色的神经元特异性标记物III类β微管蛋白（TUJ1），以及用于多巴胺能神经元标记酪氨酸羟化酶（TH）（ 图6B）。
图1.协议用 于从协议期间人外周血和细胞形态变化的iPSCs的产生。（A）的协议的示意图用于产生从冷冻外周血单个核细胞获得的iPSC后DGS和外周血单个核细胞从冷冻的血沉棕黄层中分离，使用单转染的非整合游离型质粒。 （ 二）从增殖和DGS棕黄色大衣14天获得解冻和扩大培养后，被转染前外周血单个核细胞的代表图像。比例尺为100μm。一周后的iPSC集落的（C）的例子，细胞是复ated上的MEF。比例尺为500μm。 （D）的iPSC菌落在30-35天在MEF饲养层再电镀后代表图像。比例尺为500μm。的iPSC =诱导多能干细胞; DGS =密度梯度分离;外周血单个核细胞=外周血单个核细胞;的MEF =小鼠胚胎成纤维细胞;政府飞行服务队=生长因子; bFGF的=碱性成纤维细胞生长因子;酸钠=丁酸钠。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.形态和染色体核型分析。（A）的iPSC菌落后2-3手动传代的步骤代表性的图像。比例尺为500μm。 （B）的iPSC菌落较大的放大倍率。比例尺为200μm。 （C）Represe从iPS细胞ntative正常karyograms后10-15代体外扩增的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. iPSC的表征：碱性磷酸酶活性，再表达的iPS细胞和转基因沉默的评价的内源多能性基因（A）和（B）中示出了阳性染色碱性磷酸酶代表性图像。比例尺为500μm。 （C）的条线图表示重新表达的内源多能性基因（c-myc，KLF-4，SOX-2，OCT3 / 4和Nanog的）在从DGS和血沉棕黄层获得既iPSCs的，采用定量RT-PCR分析（ N = 4，学生t检验：* P <0.05，§P <0.005 VS相应的外周血单个核细胞）。 （D）的定量RT-PCR以游离基因特异性引物（EBNA-1）（相对于对照FBOX15引物）表示没有基因组整合附加型载体。 （N = 4，学生t检验：* P <0.001对相应的外周血单个核细胞5天的转染）。 请点击此处查看该图的放大版本。
的胚胎干细胞的多能性标记物图4的免疫荧光分析。代表性免疫荧光染色显示显著多能性的蛋白表达SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81，OCT3 / 4和SOX-2的表达。细胞核counterstained用DAPI。比例尺200微米的iPSC的DGS（A）和iPSC的捉鬼大衣（B）。比例尺100微米的iPSC的捉鬼大衣（A），iPSC的DGS（B STRONG>）和（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.协议iPS细胞和胚中的三个胚层的基因表达的差异，从iPS细胞获得的。该协议诱导iPSCs的自发分化DGS和棕黄色大衣胚后外周血单个核细胞（ 一 ）示意图。 （B）的定量RT-PCR实验示出的所有三个胚层的基因表达：内胚层（SOX-7，AFP），中胚层（CD31，ACTA-2，CDH-5，RUNX-1），和外胚层（KRT-14， TH，GABRR-2）胚后20天分化（N = 4，学生t检验：* P <0.05与相应的iPS细胞配对）。胚=胚体。/52885/52885fig5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
在胚心脏和神经元蛋白的图6.共聚焦显微镜分析在DGS和血沉棕黄层衍生的iPSC后从外周血单个核细胞获得的分化的第20天。（A）的代表性图像（共聚焦图像堆栈的最大投影）用于心脏肌蛋白α -肌动和肌钙蛋白I（TN-I）中的单细胞离解跳动领域神经元特异性标记物III类β微管蛋白（TUJ1）（比例尺为10μm）和（B）和多巴胺能神经元标记酪氨酸羟化酶（TH）（比例酒吧20微米）。细胞核counterstained用DAPI。 请点击此处查看大图这个数字。
| 入门 | 序列 | ||
| C-MYC FW | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3' | ||
| C-MYC转 | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3' | ||
| KLF-4 FW | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3' | ||
| KLF-4转 | 5'AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3' | ||
| SOX-2 FW | 5'GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3' | ||
| SOX-2转 | 5'- TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3 | ||
| OCT3 / 4 FW | 5'GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3' | ||
| OCT3 / 4转 | 5'CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3' | ||
| NANOG FW | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3' | ||
| NANOG转 | 5＆＃8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3' | ||
| SOX-7 FW | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3' | ||
| SOX-7 REV | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3' | ||
| 法新社FW | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3' | ||
| 法新社转 | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3' | ||
| CD31 FW | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3' | ||
| CD31转 | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3' | ||
| ACTA-2 FW | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3' | ||
| ACTA-2转 | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3' | ||
| CDH-5 FW | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3' | ||
| CDH-5转 | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3' | ||
| RUNX-1 FW | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3' | RUNX-1转 | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3' |
| KRT-14 FW | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3' | ||
| KRT-14转 | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3' | ||
| TH FW | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3' | ||
| TH转 | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3' | ||
| GABBR-2 FW | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3' | ||
| GABBR-2转 | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3' | ||
| EBNA-1 FW | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3' | ||
| EBNA-1转 | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3' | ||
| FBX-15 FW | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3' | ||
| FBX-15 FW | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3' | ||
| FW GAPDH | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3' | ||
| GAPDH转 | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3' |
表1：定量RT-PCR引物列表用于内源多能性基因表达，转基因沉默和三个胚层标志物表达的评价的引物序列。
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Discussion
在过去，只有这样才能获得携带特定遗传变异的人类多能干细胞是招募家长进行胚胎植入前遗传学诊断，并产生从他们丢弃的囊胚31,32胚胎干细胞。使用方法重新编程，研究人员现在可以生成携带几乎所有的基因型患者iPS细胞。的可能性，以从患者的特定细胞系就易于访问的源是非常重要的，因为它允许病症的病理生理学和随后鉴定的新的治疗方法的研究。
在本研究中，我们结合的质粒的方法15与已施加到从冷冻棕黄层外周血单个核细胞产生从密度梯度分离22之后先前冷冻外周血单个核细胞的iPSC和成功生成脱毒的iPSC的方法。采用棕黄色的大衣，而不是密度梯度分离外周血单个核细胞的全部OWS我们减少样品处理过程中的成本，工作时间和手动步骤为运营商。该设置使用外周血单个核细胞从冷冻棕黄色大衣低成本协议是用于提升参与者数量研究和多中心研究样本集合必不可少的。重要的是，从冷冻血沉棕黄层产生的iPSC的能力允许访问已存储在血库众多冷冻生物样品，使用简单的，具有成本效益的和不那么耗时样品收集方法。
这种诱导方法可用于对患者特异性整合无iPSCs的，其中菌落特征在于没有附加型转基因的仅少数通道（≥5传代）之后，在这两种原料的推导是有用的。值得注意的是，我们观察到，从两种类型的起始材料显示可比多能性的特征和细胞分子相似的保存到人类胚胎干细胞，籼稻获得所有选定的iPSC集落挺成功的iPSC推导和协议的一致重复性。
从超过10人皮肤成纤维细胞和3心脏间充质基质细胞系（均来自健康供体和患者心肌和骨骼肌疾病），使用此方法（数据未显示）。此外，我们已经成功地产生的iPSC，从而表明所描述的协议可用于不同细胞类型的成功的重新编程。然而，相对于成纤维细胞的血液的选择作为起始材料是有利的，尤其是考虑到在体外成纤维细胞的广泛扩张可能会影响重编程的效率的基础上，成纤维细胞传代次数和细胞增殖率33,34时。我们的协议还允许从冷冻血沉棕黄层转基因无iPSCs的生成后的最小培养时间，从而由大约3-4周减少所需的iPSC推导相对于其他来源，例如网络连接时成纤维细胞。此外，最近的研究表明，血细胞来源的iPS细胞显示一个后生签名更类似于人类胚胎干细胞比那些从间质干细胞（MSC）/成纤维14,35获得。
尽管成功的一代从冷冻棕黄色大衣iPS细胞的，有一些限制需要在本协议中加以考虑。之前重新编程诱导，从冷冻血沉棕黄层外周血单个核细胞的扩增可以代表协议的一个关键步骤。起始材料的质量可以极大地影响外周血单个核细胞的选择和分离，以达到足够的细胞数量为重编程过程（至少为2×10 6个细胞用于电穿孔）。这主要是由于样品的固有生物变异性，而且要技术问题。事实上，比起由于强烈的去从密度梯度分离，得到外周血单个核细胞从冷冻的血沉棕黄层外周血单个核细胞的扩增效率较低pendence手动运营商的变化。为了提高再现性和冷冻棕黄色大衣PBMNC扩增效率，而不密度梯度分离，使用自动化系统的强烈建议，收集棕黄色大衣分数。虽然它是比较困难的密度梯度分离后扩大从血沉棕黄层比外周血单个核细胞外周血单个核细胞的足够数量的，重编程的两种原料的效率（约0.001-0.0005％）媲美，根据血液重新编程的效率先前报道14， 23。由于重编程效率低再生医学的目的，使用改进的EBNA1 / ORIP的（从Epstein-Barr病毒，EB病毒）附加型载体可能增加的iPSC集落的数量为未来的细胞疗法的发展22,36。此外，MEF饲养层的iPSC产生和维持用于我们的协议。为了获得临床级的iPSC，无饲养层培养可以是阿尔特rnative方法进一步研究。
总之，本协议代表一个有效的方法来产生从一个方便患者的细胞来源的iPSC使用可以潜在地用于临床级iPSCs的，不仅对疾病建模，但是推导一个非整合系统的显着优点也为未来的个性化药物。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
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