Summary
誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。
Abstract
体細胞は、典型的には、ヒト胚性幹細胞（hESC）で表される、（KLF-4、Oct-4の、ソックス-2、及びc-Mycの）は、4つの転写因子の発現を強制することによって誘導多能性幹細胞（iPS細胞）に再プログラムすることができ。によるヒトES細胞との類似性のために、性IPSCは、ヒトES細胞に関連する倫理的な問題を回避し、潜在的な患者特有の再生医療のための重要なツールとなっています。臨床応用のために適切な細胞を得るために、導入遺伝子を含まないiPS細胞は、導入遺伝子の再活性化、遺伝子発現の変化と誤った分化を回避するために生成される必要があります。また、非常に効率的で安価な再プログラミング方法は、治療目的のために十分なiPS細胞を誘導するために必要です。この必要性を考えると、効率的な非統合エピソームプラスミドアプローチは、iPS細胞の誘導に好適な選択です。現在、再プログラミングのために使用される最も一般的な細胞型は、線維芽細胞、組織生検を必要とするの分離、Iであります患者のためのnvasiveの外科的処置。そのため、ヒト末梢血は、iPS細胞の生成のための最もアクセスし、最も侵襲性の組織を表します。
本研究では、非組み込み型エピソームプラスミドを用いてコスト効果およびウイルスフリープロトコルは、全血の遠心分離後に密度勾配分離せずに凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）からのiPS細胞の生成のために報告されています。
Introduction
2006年には、山中伸弥のグループが1 KLF-4、成体マウスおよびヒトからの体細胞は、4つの再プログラミング因子（Oct-4の、ソックス-2の異所性発現によって多能性状態に変換することができることを初めて実証し、 C-Mycの）、いわゆる人工多能性幹細胞（性IPSC）2を生成します。患者特異性IPSC密接形態、増殖、およびhESCの使用に関連する倫理的な問題を欠くと迂回し、三生殖細胞型（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に分化する能力の点でヒト胚性幹細胞（hESC）の似ています可能な免疫拒絶3。このように、性IPSCは、基礎研究、薬物スクリーニング、疾患モデリング、毒性の評価、および再生医療の目的のために4患者特異的細胞の最も重要な源の一つとして表示されます。
いくつかのアプローチは、iPS細胞の生成のために使用されている：ウイルスベクターを統合します（レトロウイルス5、レンチウイルス6）、ウイルス非組み込み型ベクター（アデノウイルス7）、センダイウイルス8、BACトランスポゾン9、エピソームベクター10、タンパク質11またはRNAの送達12。ウイルス媒介方法の使用は、高効率のリプログラミングにつながることができますが、ウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、したがって、潜在的なランダム挿入変異、遺伝子発現の永久的な変化、および分化の間沈黙導入遺伝子の再活性化は、13を除外することはできません。
再生医療用iPS細胞をより安全にするために、努力は携帯のゲノムへの外来DNAの組込みなしでiPS細胞を誘導するためになされています。切除可能なウイルスベクターおよびトランスポゾンが開発されているが、それは必然的に短く切除後に形質導入した細胞中に残存ベクター配列、およびトランスポザーゼの発現は、細胞内変化を誘発することができるかどうかまだ不明ですウラル機能13。その高い初期化効率にもかかわらず、センダイウイルスは、高価なアプローチを表し、このシステムを開発した会社でリーチスルーライセンスの懸念は、翻訳の研究でその用途を制限する可能性があります。さらに、タンパク質およびRNAの直接導入の必要性は、これが導入されて、固有の技術的な限界で分子を再プログラミングする複数の配信を必要とし、全体の再プログラミング効率は14非常に低いです。注目すべきは、エピソームプラスミドの使用に基づいて、費用対効果の高い無料のウイルスおよび非統合の方法は、正常皮膚線維芽細胞15の再プログラミングのために報告されています。具体的には、本研究で我々は、以前に10,15を報告したように、市販の統合フリーエピソームプラスミドを使用することにしました。
現在までに、皮膚線維芽細胞は、最も人気のあるドナー細胞型5を表します。しかし、他の細胞源は大成功していますsfullyケラチノサイト16、骨髄間葉系幹細胞17、脂肪間質細胞18、毛包19および歯髄細胞20を含むiPS細胞に再プログラム。これらの細胞の単離は、外科的処置を必要とし、数週間の初代細胞培養を確立するために、 インビトロ細胞増殖に必要とされます。
この観点から、細胞型の開始の選択は重要であり、それは、血液などの容易にアクセス可能で低侵襲性の組織からiPS細胞を生成することができることが同様に重要です。臍帯血単核細胞（CBMNCs）21,22と、末梢血単核細胞（PBMNCs）14,22-24両方が性IPSCの導出のための細胞の適切な供給源を表します。
成人PBMNCの再プログラミングの効率がCBMNCs 22のそれよりも20〜50倍低いが、それらは、サンプリング目的のために最も便利な細胞型のままです。で実際には、PBMNCサンプリングは低侵襲であるという利点があり、加えて、これらの細胞は、再プログラミング実験の前に、インビトロで広範な拡張を必要としません。現在までに、異なるプロトコルは、密度勾配分離後PBMNCsを凍結し、解凍した日数ヶ月に凍結後と性IPSC 22,23に再プログラミングする前に数日のために拡張することができることを報告しています。それにもかかわらず、限り我々が知っているように報告は凍結バフィーコートからPBMNCsの再プログラミングを説明していません。重要なことは、密度勾配分離することなく収集凍結軟膜は、このように、試料採取を回避するiPS細胞の製造のための材料の容易にアクセスできるプールを表す、集団研究から大規模なバイオバンクに保存されている最も一般的な血液サンプルを表します。
本明細書中で、私たちは以前に記載されたプロトコル22に基づいて、初めて人間の冷凍軟膜からのウイルスフリー性IPSCの生成を報告しています。でまた、性IPSCは、非密度勾配精製PBMNC結果の制御プロトコルとして、密度勾配分離後に得られた凍結PBMNCsから生成されました。
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Protocol
末梢血単核細胞（PBMNCs）は、後のインフォームドコンセントと南チロル州の倫理委員会の承認に署名した健康なドナーのヒト末梢血サンプルから単離しました。実験は、ヘルシンキ宣言で表さ原理に従って行われました。すべてのデータが収集され、匿名で分析しました。
末梢血単核細胞（PBMNCs）の1の単離
- PBMNCsは、密度勾配分離することなく、全血を遠心分離した後、バフィーコートから得られました。
- クエン酸ナトリウム中に静脈末梢血の8ミリリットルを収集し、室温（25℃）で、プラスチックチューブ、およびストアバッファリング。採取後12時間内のプロセスの血液。
- スイッチングオフ遠心ブレーキを、スウィングローターで、4℃で15分間、2,000×gでチューブを遠心。
- 曇ったバフィーコート（上プラズマ相との間の層と下部の収集クリオバイアルチューブ内に濃縮されたPBMNC画分（500μl）を含む赤血球の大部分を含む相）、。
- 2×500μlの、10％のDMSO濃度で1mlの総容量を得るために、90％FBSおよび20％DMSOを含む培地を凍結してバフィーコートの500μLを再懸濁します。
- -80℃で制御された速度の冷凍コンテナのバイアルを凍結。より長い期間のために液体窒素中で細胞を保管してください。
- 密度勾配分離後に得られたPBMNCs
- クエン酸ナトリウムに静脈末梢血12mlのを収集するには、室温でプラスチックチューブ、およびストアをバッファリング。採取後12時間内のプロセスの血液。
- 35ミリリットルの最終容量まで無菌PBSで血液を希釈します。
- 慎重にゆっくりと、50mlコニカルチューブ（比率3：1）中の（密度勾配分離のために使用される）ポリスクロース溶液（P = 1.077）を15mlに希釈した血液の層35 mlです。
- RTで30分間、800×gでチューブを遠心スウィングローター、スイッチングオフ遠心ブレーキを。
- プラズマを含む上部、黄色相を吸引し、それを捨てます。慎重に、新しい50mlコニカルチューブにPBMNCsを含む不透明な白色相間層を転送します。
- 滅菌PBSで30 mlに全量を、室温で10分間、300×gで遠心します。
- 上清を捨て、PBS 30mlで細胞を懸濁します。トリパンブルー排除25に基づいて、生存細胞の数をカウントします。
- 室温で10分間、300×gで遠心分離PBMNCsは、上清を吸引し、それを捨てます。
- 5×10 6細胞/ mlの濃度を得るために、90％FBSおよび10％DMSOを含有する凍結培地の適当量に細胞ペレットを再懸濁します。
- アリコート1ミリリットル当たりのバイアル（約5×10 6細胞/ ml）と、制御速度凍結容器にバイアルを凍結- 80°C。より長い期間のために液体窒素中で細胞を保管してください。
2.解凍とPBMNCsのめっき（0日目）
- PBMNCsは、密度勾配分離することなく、全血を遠心分離した後、バフィーコートから得られました。
- 凍結したバフィーコートからPBMNCsを使用してプロトコルを開始するには、37℃の水浴中での細胞の1バイアルを解凍し、2mlの最終容量まで無菌PBSでバフィーコートを希釈。
- 50mlのコニカルチューブに希釈軟膜転送赤血球溶解緩衝液10mlを添加し、室温で10分間インキュベートします。
- 赤血球溶解緩衝液を500mlを調製するために、重炭酸カリウム0.5gを、塩化アンモニウム4.145グラム、超純水500ml、pHが7.2〜7.4の0.5 M EDTA溶液100μlを加えます。
- 滅菌PBSで50mlに全量を、室温で10分間、300×gで遠心します。
- 上清を捨て、滅菌PBS 50mlでペレットを洗浄、室温で10分間、300×gでバフィーコートを遠心してください。
- で細胞を再懸濁IMDMとハムのF-12（比率1：1）、インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン（ITS-X）、化学的に1％の1％の定義された脂質濃縮PBMNC培地1mlを、としては、以前からなる、22に記載しました（CDL）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、L-アスコルビン酸0.005％、ウシ血清アルブミン（BSA）0.5％、1-チオグリセロール（終濃度200μM）、細胞因子SCF（100ng / mlの）の幹、インターロイキン-3 IL-3（10 ngの/ ml）を、エリスロポエチンEPO（1 U / ml）を、インスリン様成長因子IGF-1（40 ngの/ ml）を、デキサメタゾン（1μM）及びホロトランスフェリン（100μg/ mlの）。
- 2×10 6細胞/ mlの密度で、コーティングすることなく、標準的な組織培養処理された表面を有する12ウェルプレートのウェルに移します。変更メディアステップ（セクション3を参照）まで、48時間加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- 密度勾配分離後に得られたPBMNCs
- 後に凍結したPBMNCsを使用してプロトコルを開始するには密度勾配分離、融解37℃の水浴中での細胞の1バイアルを、PBMNC培地5mlに細胞を移します。室温で10分間、300×gで遠心分離します。
- PBMNC培地1mlで細胞を再懸濁し、2×10 6細胞/ mlの密度で、12ウェルプレートのウェルに移します。変更メディアステップ（セクション3を参照）まで、48時間加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
3.文化とPBMNCsの拡大（DAY 2-13）
- RTで10分間、300×gで15ミリリットルの円錐管と遠心機で、1mLの先端にピペットを使用して、懸濁培養でPBMNCsを収集します。
- 上清を捨て、新鮮なPBMNC培地1mlで細胞を懸濁します。
- 加湿インキュベーター中でコーティングすることなく、標準的な組織培養処理された表面を有する12ウェルプレートの1ウェルに細胞を移し、37℃でインキュベートして、5％CO 2。
エピソームプラスミドとPBMNCs 4.トランスフェクション（14日目）
注：プラスミド精製のための市販のキットを用いて、多能性遺伝子を有する4つの商業intergationフリーのエピソームプラスミドの単離を行い、アガロースゲル分析を使用して精製したプラスミドの品質を評価し、製造業者の指示に従って。
- 15ミリリットルコニカルチューブでPBMNCsを収集し、25（トリパンブルー排除に基づいて）生細胞の数をカウントします。
- 遠心分離機室温で10分間、300×gで2×10 6個の細胞。
- 100再懸濁バッファーTμlの各1μgのプラスミドDNAを含有するトランスフェクション混合物中に再懸濁2は、x 10 6細胞（p53のに対して、OCT3 / 4とするshRNAを運ぶ1つのプラスミド、1つのプラスミド運搬SOX2、およびKLF4、1プラスミドは、L-MYC及びLIN28を担持し、1つのプラスミド）をトランスフェクション効率をチェックするために、EGFPを運びます。
- 吸引し、100μlの先端に細胞を含むトランスフェクション混合物及び垂直チューブにピペットでサンプルを挿入するには、製造業者の説明書に従って、電気穿孔装置のピペットステーションに配置された電解バッファE2を3mlを充填します。
- 以下のプログラムを使用して効率的にエレクトロポレーションセル：1,650 V、10ミリ秒、3パルス。
- 0.25 mMの酪酸ナトリウム（のNaB）を追加して、予め温めておいたPBMNC培地2mlにエレクトロポレーションした細胞（2×10 6細胞）を再懸濁し、25（トリパンブルー排除に基づいて）、エレクトロポレーションプロトコル後の生細胞数をカウントします。
- 、コーティングなしで6ウェルプレートの1つのウェルに細胞を移し穏やかにプレートをロックし、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- エレクトロポレーション、COUNの翌日トランスフェクション効率を評価するために、8-10のランダムフィールドの蛍光顕微鏡下でGFP陽性細胞の数はt。
- （第6節参照）のMEF上にメッキされるまで、3日間分割せずにトランスフェクトされた細胞を維持します。
- 新鮮PBMNCs培地2mlに加え、0.25 mMののNaB 2日ごとに交換してください。
5.共培養用フィーダー細胞と料理を準備します（16日目）
- コート37℃で15分間、基底膜マトリックス1mlの6ウェルプレートのウェル及びFBSを含有10％2mLでよく、2×10 5細胞/の濃度でマウス胚線維芽細胞（MEFの）をプレートDMEM（MEF培地）MEFフィーダー細胞上にエレクトロポPBMNCsを継代前に一日。
MEFの上へ6.メッキトランスフェクトのPBMNCs（DAY 17〜19）
- 10分間、300×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機トランスフェクトPBMNCsで、1ミリリットルチップでピペットを用いて、懸濁培養でPBMNCsを収集RTで。
- 上清を捨て、新鮮なPBMNC培地2mlにペレットを再懸濁、プラス0.25 mMでのNaB。
- MEF-コーティングした6ウェルプレート上に細胞をプレートし、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- 2日後、培地を吸引し、DMEM（KO-DMEM）、20％KO-血清代替（KOSR）、1 mMのNEAAs、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、20mMのL-ノックアウトからなるiPS細胞培地2mlと交換してくださいグルタミン、0.1mMのβメルカプトエタノール、10 ngの/ mlのFGF（基本のbFGF）および0.25 mMでのNaB。
- 毎日新鮮なiPS細胞培地2mlを交換して、毎日の細胞を確認してください。
注：約22〜25日で、性IPSCの最初のコロニーが見えるはずです。
人工多能性幹細胞の7ピッキングと拡張（性IPSC）クローン（DAY 30〜35）
注：トランスフェクション後約30〜35日目に、iPS細胞コロニーをピッキングし、再播種のための準備ができているはずです。再プログラミング効率はESTIであるべきです以前に26報告されているように、iPS細胞コロニー/エレクトロポレーションした細胞の総数の数の割合として交配。
- iPS細胞コロニーを継代前日に、12ウェルプレート（1.25×10 5細胞/ウェル）でMEFフィーダーを用意します。
- 吸引しMEF培地および10 ngの/ mlのbFGFおよび10μMY-27632でiPS細胞培地1mLで変更します。手動で、グリッドを得るために、ピッキング、フード内で解剖顕微鏡下で各時刻で針1のコロニーを解剖し、ピペッティングにより小さい塊を収集したMEFでコーティングした12ウェルプレートの1ウェルに個別にそれらを転送します。
- さらなる増殖のために4：1の比率で、2、各6ウェルプレートを：比1で6ウェルプレートに各12ウェルプレートを通過して展開します。解剖した後、酵素解離プロシージャを使用し、（のような徹底的にステップ7.2で説明した）最初の2〜3継代のために手動でiPS細胞を拡大する（ステップ7.4から開始）。
- 酵素解離プロトコルの場合、きれいなiPS細胞のコローニピッキング·フードで解剖顕微鏡下で、分化した部分を吸引することにより、ES。
- 37℃で10分間のコラゲナーゼIVを1ml（1mg / ml）でiPS細胞をインキュベートします。
- 、酵素液を吸引KO-DMEM 1mlで細胞を洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブにコロニーを収集します。 RTで2分間、100×gで遠心分離。
- 吸引した上清を、10 ngの/ mlのbFGF及び10μMのY-27632を用いてiPS細胞培地2ml中でコロニーを再懸濁し、MEFで被覆した6ウェルプレート（比1：4）上にプレート。
性IPSCの8.特性（5-15通路間）
- アルカリホスファターゼ染色
- 10 ngの/ mlのbFGFを持つiPS細胞培地中で3-5日間培養iPS細胞コロニーを。
- アルカリホスファターゼ染色プロトコルを開始するため、PBSで一回性IPSCをリンスし、次いで、室温で20分間、4％PFA 1mlでそれらを修正。
- 残留PFAを除去するために、PBSで細胞を3回洗浄します。
- 使用して染色固定細胞製造業者の指示に従って商業アルカリホスファターゼ染色キット。
- 免疫蛍光
- 10 ngの/ mlのbFGFを持つiPS細胞培地中で3-5日間培養iPS細胞コロニーを。
- 免疫蛍光アッセイを開始するには、PBSで一回性IPSCを洗浄した後、室温で20分間、4％PFA 1mlでそれらを修正。
- 残留PFAを除去するために、PBSで細胞を3回洗浄します。
- RTで1時間、4％ヤギ血清、0.1％BSA、0.1％トリトンX-100及び0.05％アジ化ナトリウム（NaN 3を） を含む溶液をブロッキング/透過1mlの固定性IPSCを扱います。
- ブロッキング溶液を吸引し、4℃で一次の3％BSA中の抗体および0.05％のNaN 3溶液のO / Nで固定した細胞をインキュベート（一次抗体リストの材料表をチェックして、抗体の希釈倍率を示唆）。
- 次の日、PBSで性IPSC 3回洗浄し、次いでAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスおよびAlexaフロリダで細胞をインキュベートします37℃で1時間、3％BSAおよび0.05％NaN 3を溶液1,000：UOR 555ヤギ抗ウサギ抗体を、1に希釈しました。
- PBSで3時間洗浄し、暗所で室温で10分間、のためにDAPI（1μgの/ ml）で核を染色します。
- 胚様体におけるiPS細胞の分化（胚様）
- 10 ngの/ mlのbFGFを持つiPS細胞培地中で5-6日間培養iPS細胞コロニーを。
- ピッキング·フードで解剖顕微鏡下で、吸引することによってiPS細胞コロニーから分化した部分を削除します。
- 37℃で10分間のコラゲナーゼIVを1ml（1mg / ml）でiPS細胞をインキュベートします。
- 、酵素液を吸引KO-DMEM 1mlで細胞を洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブにコロニーを収集します。 RTで2分間、100×gで遠心分離。
- 上清を吸引し、KO-DMEM、20％の定義されたウシ胎児血清（FBS）からなるEB培地2ml、1mMのNEAAs、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、20mMのL-グルタミン、0.1mMの中でコロニーを再懸濁します46;メルカプトエタノール。
- 球状三次元胚様体（EB）の形成を可能にするために、超低付着6-ウェルプレートに6日間懸濁液中のiPS細胞コロニーをプレート。 2日ごとに新鮮なEB培地2mlを変更します。
- 7日目に、EBを収集し、EB培地2mlで6ウェルプレートにコーティングし、20日間分化したEBを維持し、0.1％ゼラチンにそれらをプレート。
- 2日ごとに新鮮なEB培地2mlを変更します。
- 遺伝子発現解析のための定量RT-PCR
- 10 ngの/ mlのbFGFを持つiPS細胞培地中で5-6日間培養iPS細胞コロニーを。
- メーカーの指示に従って市販の試薬の1ミリリットルを使用してPBMNCs、iPS細胞やEBからの全RNAを抽出します。
- このような27分光光度計（280分の260および230分の260比> 1.8で高品質なRNA）を使用するなどの適切な方法により、RNAの濃度および純度を評価します。
- チェック製造業者のプロトコル（高品質のRNA RQI> 9.5）28に従って、市販のキットを用いてRNAの完全性。
- 製造業者の指示に従って商用逆転写キットを用いて全RNA1μgのに逆転写反応を行います。
- cDNA鋳型の5 ngの、7.5μlのSYBR GREENスーパーミックス、5μMのプライマー、2μlの含有定量PCR混合物の準備（フォワード：1μLとは逆：1μl）を、それぞれの反応29のためのRNase / DNaseを含まない水の6μLを。
- 45を60℃で10分間、95℃での初期変性工程、15秒間プライマーアニーリングおよび伸長工程95℃での変性段階に分け40サイクル、続いて、次のプログラムを使用して、定量RT-PCRを行って秒29。
- ハウスキーピング遺伝子28としてGAPDHを使用して、他の遺伝子の発現を正規化する（ 表1に示すプライマーを参照）。
- 定量PCR導入遺伝子の排除のための
- 50mMのトリス、100mMのEDTA、100mMのNaCl、1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および20μg/ mlのプロテイナーゼKを含有する溶解緩衝液1mlを用いPBMNCsまたはiPS細胞からDNAを抽出します
- RTで5分間、10,000×gでDNA沈殿および遠心分離を可能にするために3回の100％イソプロパノールを等量（1 ml）を追加し、反転により混合します。
- 室温で5分間、10,000×gで70％エタノール及び遠心の1mlでDNAペレットを洗浄、上清を捨てます。吸引し、上清を廃棄し、RNアーゼ/ DNアーゼフリーの水に再懸濁します。
- このような27分光光度計（280分の260および230分の260比> 1.8で高品質なRNA）を使用するなどの適切な方法により、DNA濃度及び純度を評価します。
- （：1μLとは逆：1μlのフォワード）および6＆DNAテンプレート5ngの、7.5μlのSYBR GREENスーパーミックス、5μMのプライマーの2μLを含む定量PCR混合物を準備＃181;各反応29のためのRNase / DNaseを含まない水のリットル。
- ハウスキーピング遺伝子29（ 表1に列挙されたプライマーを参照）としてFBX-15を使用して、特定のエピソームプラスミドのEBNA-1遺伝子の発現を正規化します。
- 核型分析
- 無フィーダー基底膜マトリックス上に培養5-6日間iPS細胞コロニーは製造者の指示に従って定義された商業、iPS細胞用フィーダーなしの維持培地でプレートを被覆しました。
- 核型分析プロトコルを開始するために、単一細胞分離が得られるまで、37℃で5分間、細胞剥離液1mlでiPS細胞コロニーを切り離します。
- 室温で5分間、400×gで細胞と遠心分離を収集します。
- 2mlの培地で再懸濁性IPSCは、具体的には出生前診断技術のための細胞を培養するために開発しました。基底膜マトリックス被覆ガラス皿上にプレート単細胞性IPSC、37℃、5％CO 2 <それらをインキュベート/サブ>インキュベーター。
- 2~4日後、培養物に直接10μL/ mlのコルヒチンを追加し、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で3時間インキュベートします。
- 培地を吸引除去し、室温で10分間、低張液（0.6％クエン酸ナトリウム及び0.13％の塩化カリウム）1mlにiPS細胞をインキュベートします。
- 5％酢酸溶液1mlで細胞を洗浄し、メタノール/酢酸溶液（比率3：1）を用いてiPS細胞を固定し、機械で制御された温度および湿度（28℃、42％RH）を有します。
- 浸し、暗所で室温で15〜20分間、キナクリン溶液で染色固定した細胞を30（Q-バンディングを得るため）。
- 100X倍率29で蛍光顕微鏡下で細胞分裂中期を取得します。
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Representative Results
本研究では、全血の遠心分離および密度勾配分離が報告された後に得られたPBMNCsの再プログラミングと比較した後に凍結したバフィーコートから単離したPBMNCsの再プログラミングによるウイルスフリー性IPSCを生成するための簡単で効果的なプロトコルです。 図1（a）は、の概略図を示します詳細なプロトコル。解凍後、典型的な丸みを帯びた形状を示す単離されたPBMNCsは、14日間の特定の血液培養培地（ 図1B）に展開され、その後、エピソームプラスミドでトランスフェクトしました。 10〜15日後にトランスフェクションした後、定義されたマージンと胚性幹細胞様の形態を有する小さな丸い明るいコロニーが（ 図1C）現れ始めます。約20〜30日、トランスフェクション後に、iPS細胞コロニーは、シャープなエッジで、非常にコンパクトになり、そのサイズを大きくして、ピッキングと拡張（ 図1D）の準備ができています。最初の継代工程（2-3継代）した後、iPS細胞のコロニーをそれらの未分化状態を維持し、典型的なヒト胚性幹細胞の形態を示します。最初の通路の間に、手動ピッキングは、コンパクト、完全に未分化と密に詰まったコロニー（ 図2A）を選択するために、解離酵素と比較して、より効率的な拡張方法です。 iPS細胞コロニーの大きい倍率はコロニー内の個々の細胞を示し、細胞質比が高い核がより簡単に（ 図2B）が観察されます。初期の機械的ピッキングした後、選択されたiPS細胞クローンを、コラゲナーゼIVを用いた酵素解離で展開されます。 in vitroでの増殖の10〜15継代後、細胞遺伝学的解析はiPS細胞コロニー上で行われています。少なくとも2つの独立した培養物から約20の中期には、約300〜400バンドレベルで、分析され、すべてのサンプルが正常karyogram（ 図2C）を示します。この観察は、iPS細胞が遺伝的に安定であることを示唆しています。
アフトER インビトロ拡大（5~10継代）、性IPSCは、幹細胞性マーカーの発現およびそれらの多能性の可能性について特徴付けられる。 図3A、Bは、iPS細胞は、アルカリホスファターゼ染色に陽性であることを示しています。定量RT-PCR分析を用いて、我々はiPS細胞が内因性多能性遺伝子を発現することを確認した（SOX-2、OCT3 / 4、NANOG）出発PBMNCsよりも有意に高いレベルで、内因性のC-MYCおよびKLF-4の発現レベルは前に類似しているとしながら、 iPS細胞の再プログラミング後（ 図3C）。文化の中で唯一の5継代後、外因性のエピソーム導入遺伝子の発現は、このように、内因性多能性遺伝子の活性化の成功を示し、性IPSCで検出することはできません。 EBNA-1エピソームのための特異的プライマーによって評価強力な導入遺伝子発現レベルで5日間トランスフェクション後PBMNCsは、陽性対照として使用されています。 4外因性多能性遺伝子を有するプラスミドにさらされることはありませんPBMNCsは、Fiの （負の対照として使用されていますグレの3D）。最後に、免疫蛍光分析は、性IPSCは、OCT3 / 4、SOX-2、SSEA-4、TRA-1-60、およびTRA-1-81（ 図4）のような多能性マーカーを発現することを明らかにする。
図5Aに示すように、iPS細胞は、それらのインビトロ多能性潜在能力を評価するために、自発的な分化プロトコルを使用して、胚様体（EB）に分化されています。定量RT-PCR実験は、性IPSC三胚葉の細胞に分化することができることを明らかにする。確かに、EBは、系統マーカーの分化表示大幅なアップレギュレーション内胚葉の代表（SOX-7、AFP）、中胚葉（CD31、ACTA-2、CDH-5、RUNX-1）および外胚葉（KTR-の20日後に得られました14、TH、GABRR-2）（ 図5B）。共焦点顕微鏡分析は、単一細胞が拍動クラスターは、トロポニンI（TN-I）およびαアクチニンのような典型的な心筋細胞のマーカーを発現する解離することを示す、明確な筋節のパターンで組織（ 図図6（a））。また、EBの免疫蛍光分析は、ニューロン特異的マーカークラスIIIβチューブリン（TUJ1）、ならびにドーパミン作動性ニューロンのためのマーカー、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）（ 図6B）について陽性染色を示します。
プロトコル中のヒト末梢血、細胞の形態学的変化からiPS細胞を生成するための図1のプロトコル。DGSとPBMNCsが凍結軟膜から単離した後、プロトコルの（A）図は、単一のトランスフェクションを使用して、凍結したPBMNCsから得られたiPS細胞を生成するために使用されます非組み込み型エピソームプラスミドの。 （B）トランスフェクトされる前に、14日間の培養で解凍し、展開後のDGSと軟膜から得られたPBMNCsの増殖の代表的な画像。スケールバーは100μm。細胞がPLである一週間後にiPS細胞コロニーの（C）の例MEFの上ated。スケールバーは500μm。 （D）MEFフィーダー層上に再プレーティング後30〜35日目のiPS細胞コロニーの代表的な画像。スケールバーは500μm。性IPSC =誘導多能性幹細胞。 DGS =密度勾配分離。 PBMNCs =末梢血単核細胞。のMEF =マウス胚性線維芽細胞;のGF =成長因子; bFGFを塩基性線維芽細胞増殖因子を=。のNaB =酪酸ナトリウム。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.形態と核型分析。（A）2-3手動継代ステップ後のiPS細胞コロニーの代表的な画像。スケールバーは500μm。 （B）iPS細胞コロニーの拡大倍率。スケールバーは200μm。 （C）Represein vitroでの増殖の10〜15継代後iPS細胞からntative通常karyograms。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3 iPS細胞の特徴付け：アルカリホスファターゼ活性、性IPSCおよび導入遺伝子サイレンシングの評価の内因性多能性遺伝子の再発現（A）およびアルカリホスファターゼについて陽性染色を示した（B）代表的な画像。スケールバーは500μm。 （C）DGSおよびバフィーコートから得られた両方のiPS細胞において（C-MYC、KLF-4、SOX-2、OCT3 / 4およびNanog）の内因性多能性遺伝子の再発現を示す棒グラフ、定量RT-PCR分析を使用して（ N = 4、スチューデントt検定：* P <0.05、P <対応PBMNCs対0.005）を§。 （エピソームの特異的プライマー（EBNA-1）とD）のqRT-PCRは、（相対FBOX15プライマーを制御する）エピソームベクターのないゲノムの統合を示していません。 （N = 4、スチューデントt検定：* P <0.001 PBMNCs 5日間のトランスフェクションを、対応する対）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
多能性タンパク質SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、OCT3 / 4、SOX-2の有意な発現を示し、胚性幹細胞の多能性マーカーの図4.免疫蛍光分析。代表的な免疫蛍光染色。核をDAPIで対比されています。 iPS細胞DGS（A）とiPS細胞バフィーコート（B）のためのスケールバーは200μm。 iPS細胞バフィーコート（A）、iPS細胞DGSのためのスケールバーは100μm（B 強い>）と（C）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
5.性IPSCの分化のためのプロトコルとEBSの3胚葉遺伝子の発現がiPS細胞から得られた図。DGSとEBSの軟膜の後PBMNCsからiPS細胞の自発的分化を誘導するプロトコルの（A）概略図。 （B）3つ全ての胚葉遺伝子の発現を示す定量RT-PCR実験：内胚葉（SOX-7、AFP）、中胚葉（CD31、ACTA-2、CDH-5、RUNX-1）、および外胚葉（KRT-14、分化の20日後のEBSのTH、GABRR-2）（N = 4、スチューデントt検定：* P <0.05、対応するiPS細胞の対応対）。 EBは=胚様体。/52885/52885fig5large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図DGSと軟膜由来のiPS細胞の後PBMNCsから得られた分化の20日目のEBにおける心臓とニューロンタンパク質の6共焦点顕微鏡分析。（A）代表的な画像（共焦点画像スタックの最大投影）αアクチニン心臓筋節タンパク質について単セル内のトロポニンI（TN-I）は、スケール（ニューロン特異的なマーカークラスのIIIβチューブリン（TUJ1）およびドーパミン作動性ニューロンマーカーのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）の領域（スケールバーは10μm）と（B）を破っ解離しました）が20μmをバー。核はDAPIで対比染色している。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。
| プライマー | シーケンス | ||
| C-MYC FW | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 ' | ||
| C-MYCのREV | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 ' | ||
| KLF-4 FW | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 ' | ||
| KLF-4 REV | 5'- AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 ' | ||
| SOX-2 FW | 5'- GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 ' | ||
| SOX-2 REV | 5'- TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3 | ||
| OCT3 / 4 FW | 5'- GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 ' | ||
| OCT3 / 4回転 | 5'- CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 ' | ||
| NANOG FW | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 ' | ||
| NANOGの回転 | 5＆＃8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 ' | ||
| SOX-7 FW | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 ' | ||
| SOX-7 REV | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 ' | ||
| AFP FW | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 ' | ||
| AFPの回転 | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 ' | ||
| CD31 FW | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 ' | ||
| CD31の回転 | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 ' | ||
| ACTA-2 FW | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 ' | ||
| ACTA-2 REV | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 ' | ||
| CDH-5 FW | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 ' | ||
| CDH-5 REV | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 ' | ||
| RUNX-1 FW | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 ' | RUNX-1回転 | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 ' |
| KRT-14 FW | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 ' | ||
| KRT-14 REV | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 ' | ||
| TH FW | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 ' | ||
| TH REV | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 ' | ||
| GABBR-2 FW | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 ' | ||
| GABBR-2 REV | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 ' | ||
| EBNA-1 FW | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 ' | ||
| EBNA-1回転 | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 ' | ||
| FBX-15 FW | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 ' | ||
| FBX-15 FW | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 ' | ||
| GAPDHのFW | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' | ||
| GAPDHの回転 | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ' |
表1：定量RT-PCRプライマーのリスト内因性多能性遺伝子の発現を、導入遺伝子サイレンシングおよび3胚葉マーカーの発現を評価するために使用されるプライマー配列。
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Discussion
過去には、唯一の方法は、特定の遺伝的変異を有するヒト多能性幹細胞を得るためには、着床前遺伝子診断を受けている親を募集し、その廃棄31,32胚盤胞から胚性幹細胞を生成することでした。再プログラミングのアプローチを使用して、研究者らは現在、事実上すべての遺伝子型を保有する患者からiPS細胞を生成することができます。それは障害および新規治療アプローチのその後の識別の病態生理の研究を可能にするため、患者特異的細胞株と簡単にアクセスできるソースから開始する可能性は非常に重要です。
本研究では、我々はすでに凍結軟膜PBMNCsから以前に密度勾配分離22後に凍結PBMNCsからiPS細胞と正常に生成ウイルスフリー性IPSCを生成するために適用される方法とのプラスミドアプローチ15を組み合わせます。代わりに、密度勾配分離PBMNCsすべてのバフィーコートの使用サンプル処理中にオペレータのための時間と手動の手順を作業、コストを削減するために私達にOWS。凍結したバフィーコートからPBMNCsを使用して、低コストのプロトコルのセットアップは、参加者の上昇数とし、多施設試験のサンプルコレクションの研究のために不可欠です。重要なことは、凍結したバフィーコートからiPS細胞を生成する能力は、サンプル採取のためのシンプルな、費用対効果ではなく、そのように時間のかかる方法を用いて、既に血液バンクに保存されている多数の冷凍バイオサンプルへのアクセスを可能にします。
この誘導方法は、両方の出発物質に、コロニーはわずか数継代（≥5継代）後にエピソーム導入遺伝子が存在しないことによって特徴付けられる、患者特異的組込みを含まないiPS細胞の誘導に有用であり得ます。注目すべきことに、我々は選択したすべてのiPS細胞コロニーを原料表示匹敵する多能性の特徴の両方のタイプとヒトES細胞への細胞および分子の類似性の保全、インディカから得られることを観察しましたティン成功iPS細胞の誘導およびプロトコルの一貫した再現。
さらに、我々は正常従ってその記載されたプロトコルを示唆し、10以上のヒト皮膚線維芽細胞、およびこの方法を使用して（心臓および骨格筋疾患と健常ドナーおよび患者の両方）3心臓間充織間質細胞株（データは示していない）からiPS細胞を生成しました異なる細胞型の成功した再プログラミングのために使用することができます。しかし、出発物質として、血液の選択は、特にインビトロでの線維芽細胞の大規模な拡大は、線維芽細胞の継代数および増殖速度33,34に基づいて、再プログラミングの効率に影響を与える可能性があることを考慮すると、線維芽細胞と比較して有利で す。我々のプロトコルは、このように約3~4週間かかるFiなどの他のソースと比較してiPS細胞を誘導するために必要な時間を短縮すること、最小限の培養時間後に凍結したバフィーコートからの導入遺伝子を含まないiPS細胞の生成を可能にしますbroblasts。さらに、最近の研究では、血液細胞由来のiPS細胞は、より密接に、間葉系幹細胞（MSC）/ 14,35線維芽細胞から得られたものよりもヒトES細胞に類似しているエピジェネティックな署名を表示することを明らかにしました。
凍結したバフィーコートからのiPS細胞の正常な発生にもかかわらず、いくつかの制限は、このプロトコルで考慮される必要があります。誘導を再プログラミングする前に、凍結したバフィーコートからPBMNCsの増幅は、プロトコルの重要なステップを表すことができます。出発原料の品質が強く再プログラミング手順に（エレクトロポレーションのための少なくとも2×10 6細胞）を、十分な細胞数を達成するために、PBMNCsの選択および分離に影響を与えることができます。これは主に、サンプルの固有の生物学的変動に起因するだけでなく、技術的な問題です。実際、凍結軟膜からPBMNCsの増幅は、強いデに、密度勾配分離から得られたPBMNCsに比べて効率が低いです手動オペレータの変動にpendence。密度勾配分離することなく凍結バフィーコートからPBMNC増幅の再現性及び効率性を高めるために、自動化されたシステムの使用を強くバフィーコート画分を収集することが推奨されます。それは密度勾配分離後PBMNCsよりバフィーコートからPBMNCsの十分な数を拡張することはより困難であるが、2つの出発物質の再プログラミングの効率（約0.001から0.0005パーセント）は、血液再プログラミング効率によれば、同程度であるが、以前に、14を報告しました23。再プログラミング効率は、再生医療のために低いため、改善されたEBNA1 / oriPをの使用は、（エプスタイン·バーウイルスから、EBV）、エピソームベクターは、将来の細胞療法の開発22,36用のiPS細胞コロニーの数を増加させることができます。さらに、iPS細胞の生成及び維持のためのMEFフィーダー層は、我々のプロトコルで使用されています。臨床グレードのiPS細胞を得るためには、無フィーダー培養は、アルテかもしれませんさらなる研究のためrnative方法。
結論として、このプロトコルは、潜在的にだけでなく、疾患のモデリングのために、臨床グレードのiPS細胞の誘導のために使用することができる非統合システムを使用することの大きな利点で簡単にアクセス可能な患者の細胞源からiPS細胞を生成するための有効な方法を表しているが、また、将来のオーダーメイド医療のために。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
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