Summary
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) представляют собой источник конкретного пациента тканей для клинического применения и фундаментальных исследований. Здесь мы представляем подробный протокол для перепрограммирования человека мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs), полученные из замороженных лейкоцитарных пленок в вирусные свободной ИПСК с использованием не-интегрирующие Эписомные плазмиды.
Abstract
Соматические клетки могут быть перепрограммированы в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), заставляя экспрессией четырех транскрипционных факторов (OCT-4, Sox-2, КФК-4 и C-Myc), как правило, выражается человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) , Из-за их сходства с ЭСК, иПСК стали важным инструментом для потенциальных пациентов конкретных регенеративной медицины, избегая этические вопросы, связанные с ЭСК. Для того чтобы получить клетки, пригодные для клинического применения, трансгенные свободной иПСК должны быть сгенерированы, чтобы избежать трансгена реактивации экспрессии измененного гена и неправильно дифференциацию. Кроме того, очень эффективный и недорогой способ перепрограммирования необходимо получить достаточные ИПСК для терапевтических целей. Учитывая эту потребность, эффективность неинтегрирующих подход эписомными плазмида предпочтительно выбором для IPSC выводе. В настоящее время наиболее распространенный тип батарей, используемых для целей перепрограммирования фибробласты, изоляция которых требуется биопсия тканей, яnvasive хирургическая процедура для пациента. Таким образом, в периферической крови человеческой представляет собой наиболее доступный и наименее инвазивный ткани для производства IPSC.
В этом исследовании, протокол экономически эффективным и вирусно-бесплатно с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды сообщается для генерации ИПСК из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs), полученных из замороженных лейкоцитарных пленок после центрифугирования крови всего и без градиента плотности разделения.
Introduction
В 2006 году группа Шинья Яманака 1 продемонстрирована впервые, что соматические клетки взрослых мышей и человека может быть преобразован в плюрипотентных государства эктопической экспрессии четырех перепрограммирования факторов (октябрь-4, Sox-2, КФК-4, и C-Мус), генерации так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) 2. Конкретного пациента иПСК напоминают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) в терминах морфологии, распространения и способности различать в трех типов зародышевых клеток-(мезодерма, энтодермы и эктодермы), а не хватает этические проблемы, связанные с использованием ЭСК и обход возможно иммунное отторжение 3. Таким образом, иПСК в качестве одного из самых важных источников конкретного пациента клетки для фундаментальных исследований, скрининга наркотиков, моделирования заболевания, оценки токсичности и регенеративной медицины целей 4.
Несколько подходы были использованы для генерации IPSC: вирусные векторы, интегрирующие(Ретровирус 5, лентивирус 6), вирусный без учета векторов (аденовирус 7), Сендай-вирус 8, 9 ВАС транспозонов, эписомные векторы 10, белки 11 или доставка РНК 12. Хотя использование вирусных опосредованной методов может привести к высокой эффективности перепрограммирования, вирусные векторы интеграции в геном клеток-хозяев и, следовательно, потенциальным случайным инсерционного мутагенеза, постоянное изменение экспрессии генов, и реактивации молчащих трансгенов во время дифференцировки не может быть исключена 13.
Чтобы сделать более безопасным иПСК для регенеративной медицины, были предприняты усилия для получения ИПСК без интеграции экзогенной ДНК в клеточных геномов. Хотя подакцизных вирусные векторы и транспозоны были разработаны, до сих пор неясно ли короткие последовательности вектора, которые неизбежно остаются в трансдуцированных клеток после удаления, и транспозазы выражение, может вызвать изменение в клеткеулар функционировать 13. Несмотря на высокую эффективность перепрограммирования, вирус Сендай представляет собой дорогостоящий подход и сквозные проблемы лицензирования с компанией, которая разработала эту систему есть потенциал, чтобы ограничить его применение в трансляционных исследований. Кроме того, необходимость прямого введения белков и РНК требует многократного перепрограммирования доставку молекул с присущими технических ограничений Это вносит, и общая эффективность перепрограммирование очень низкая 14. Следует отметить, что рентабельные вирусные свободные и неинтегрирующих методы, основанные на использовании Эписомные плазмид успешно отчиталась за перепрограммирования фибробластов кожи 15. В частности, в настоящей работе мы решили использовать коммерческие доступные интеграции, свободной Эписомные плазмиды, как сообщалось ранее 10,15.
На сегодняшний день, фибробласты кожи представляют собой наиболее популярный тип донорских клеток 5. Тем не менее, другие источники клеток были Successfully перепрограммировать в ИПСК, включая кератиноциты 16, костного мозга мезенхимальных стволовых клеток жировой, 17 стромальных клеток 18, волосяных фолликулов 19, и пульпа клетки 20. Выделение таких клеток требуется хирургических процедур, и через несколько недель, необходимых для расширения в пробирке клеток для того, чтобы установить первичной культуры клеток.
В этом свете, выбор, начиная тип клеток имеет решающее значение, и это в равной степени важно, чтобы иметь возможность производить ИПСК из легко доступных и менее инвазивных тканей, таких как кровь. Оба одноядерные клетки пуповинной крови (CBMNCs) 21,22 и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs) 14,22-24 представляют подходящие источники клеток для вывода ИПСК.
Хотя эффективность взрослого PBMNC перепрограммирования 20-50 раз ниже, чем у CBMNCs 22, они остаются наиболее удобным типом клеток для целей отбора проб. ВДело в том, выборки PBMNC имеет то преимущество, что минимально инвазивных, и, кроме того, эти клетки не требуют экстенсивного расширения в пробирке Перед перепрограммированием экспериментов. На сегодняшний день, различные протоколы сообщили, что после разделения PBMNCs градиента плотности могут быть заморожены и разморожены дней до нескольких месяцев после замораживания и расширена в течение нескольких дней, прежде чем перепрограммирования в ИПСК 22,23. Тем не менее, насколько нам известно, никаких сообщений не описано перепрограммирование PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок. Важно отметить, что замороженные охристые пальто, собранные без разделения в градиенте плотности представляют собой наиболее общие образцы крови, хранящиеся в крупных биобанках из популяционных исследований, тем самым обеспечивая легкодоступный бассейн материала для производства IPSC, чтобы избежать дальнейшего сбора образца.
В этом мы сообщаем впервые поколение вирусных свободной ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок человека, на основе ранее описанной протокола 22. ВКроме того, иПСК были получены из замороженных PBMNCs, полученных после разделения в градиенте плотности, как протокол управления для градиента плотности не очищенных результатов PBMNC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мононуклеарных клеток крови (PBMNCs) были выделены из периферической крови человека здоровых доноров после подписанных информированное согласие и одобрение этического комитета провинции Южный Тироль. Эксперименты были проведены в соответствии с принципами, выраженными в Хельсинкской декларации. Все данные были собраны и проанализированы анонимно.
1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs)
- PBMNCs получены из лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови, без разделения в градиенте плотности.
- Собирают 8 мл венозной периферической крови в буферный цитрат натрия пластиковую трубку, и хранить при комнатной температуре (25 ° C). Процесс в крови в пределах 12 ч после сбора.
- Центрифуга трубки на 2000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С в роторе ковша поворотной, отключение центрифуги тормоза.
- Соберите облачно Баффи пальто (слой между верхней фазе плазмы и нижефазу, содержащую большую часть эритроцитов), содержащий обогащенный PBMNC фракцию (500 мкл) в криопробирку трубки.
- Ресуспендируют в 500 мкл светлого сгустка крови с 500 мкл 2x морозильной среде, содержащей 90% FBS и 20% ДМСО, чтобы получить общий объем 1 мл 10% -ной концентрации ДМСО.
- Замораживание в пузырек с контролируемой скоростью замораживания контейнера при -80 ° С. Храните ячейки в жидком азоте в течение более длительных периодов.
- PBMNCs, полученный после отделения градиента плотности
- Соберите 12 мл венозной периферической крови в цитрат натрия буфером пластиковую трубку, и магазин при комнатной температуре. Процесс в крови в пределах 12 ч после сбора.
- Развести крови с стерильной PBS до конечного объема 35 мл.
- Осторожно и медленно, слой 35 мл разбавленной крови на 15 мл раствора (polysucrose, используемой для разделения в градиенте плотности) (р = 1,077) в 50 мл коническую пробирку (соотношение 3: 1).
- Центрифуга трубки при 800 х г в течение 30 мин при комнатной температуре вротора ведро размахивая, отключение центрифуги тормоза.
- Аспирируйте верхний, желтый фазы, содержащей плазму и отбросить его. Осторожно, передать непрозрачный белый слой, содержащий межфазный PBMNCs к новому 50 мл коническую трубку.
- Доведите общий объем до 30 мл с стерильной PBS и центрифугировать при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 30 мл PBS. Подсчитайте число жизнеспособных клеток, основанный на трипанового синего 25.
- Центрифуга PBMNCs в 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре, аспирата супернатант и отбросить его.
- Ресуспендируют осадок клеток в соответствующем количестве морозильной среде, содержащей 90% FBS и 10% ДМСО, чтобы получить концентрацию 5 × 10 6 клеток / мл.
- Аликвоты по 1 мл на флакон (около 5 × 10 6 клеток / мл) и заморозить в пузырек с контролируемой скоростью замораживания контейнер в - 80 ° С. Храните ячейки в жидком азоте в течение более длительных периодов.
2. Размораживание и покрытие из PBMNCs (день 0)
- PBMNCs получены из лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови, без разделения в градиенте плотности.
- Чтобы начать, используя протокол PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок, оттаивать 1 флакона клеток в водяной бане при 37 ° С и разбавляют слой светлого сгустка крови стерильной PBS до конечного объема 2 мл.
- Передача поглощающее покрытие разбавленного в 50 мл коническую пробирку, добавляют 10 мл буфером для лизиса эритроцитов и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Для приготовления 500 мл буфером для лизиса эритроцитов, добавляют 0,5 г бикарбоната калия, 4,145 г хлорида аммония добавляют 100 мкл 0,5 М ЭДТА в 500 мл сверхчистой воды, рН 7.2-7.4.
- Доведите общий объем до 50 мл с стерильной PBS и центрифугировать при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с 50 мл стерильной PBS, центрифугируют поглощающее покрытие при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют клеток в1 мл PBMNC среды, как описано ранее 22, состоящий из: IMDM и Хэма F-12 (отношение 1: 1), 1% инсулина трансферрина-Селен-этаноламина (ITS-X), 1% химического состава липидов концентрат (КДЛ), 1% пенициллина / стрептомицина, 0,005% от L-аскорбиновой кислоты, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1-Тиоглицерин (конечная концентрация 200 мкМ), фактор стволовых клеток SCF (100 нг / мл), интерлейкин -3 IL-3 (10 нг / мл), эритропоэтин (EPO 2 ед / мл), инсулиноподобный фактор роста IGF-1 (40 нг / мл), дексаметазон (1 мкМ) и голограмма-трансферрина (100 мкг / мл ).
- Передача их в одну лунку 12-луночного планшета со стандартной тканевой культуры обрабатываемой поверхности, без покрытия, при плотности 2 × 10 6 клеток / мл. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе в течение 48 ч, до тех пор, изменяющейся средней ступени (см раздел 3).
- PBMNCs, полученный после отделения градиента плотности
- Чтобы начать протокол, используя замороженные PBMNCs послеГрадиент плотности разделения, оттепели 1 флакон клеток в водяной бане при 37 ° С, передачи клеток в 5 мл среды PBMNC. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл среды PBMNC и передавать их в одну лунку 12-луночного планшета при плотности 2 × 10 6 клеток / мл. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе в течение 48 ч, до тех пор, изменяющейся средней ступени (см раздел 3).
3. Культура и расширение PBMNCs (ДЕНЬ 2-13)
- Сбор PBMNCs в суспензионной культуре, с помощью пипетки с наконечником в 1 мл, в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл свежей среды PBMNC.
- Передача клеток в 1 лунке 12-луночного планшета со стандартной тканевой культуры обрабатываемой поверхности, без покрытия, и инкубируют их при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
4. Трансфекция PBMNCs с Эписомные плазмид (день 14)
Примечание: Выполнение изоляции из четырех коммерческих услуг интеграции, свободной Эписомные плазмид, несущих гены плюрипотентности с помощью коммерческого набора для очистки плазмиды и оценить качество очищенных плазмид с использованием анализа в агарозном геле, в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Сбор PBMNCs в 15 мл коническую пробирку и подсчитывают количество жизнеспособных клеток (на основе трипанового синего) 25.
- Центрифуга 2 × 10 6 клеток на 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют 2 х 10 6 клеток в трансфекции смеси, содержащей 100 мкл буфера ресуспендирования T и 1 мкг каждого плазмиды ДНК (плазмида, несущая один Oct3 / 4 и shRNA против р53, один плазмида, несущая SOX2 и KLF4, одинплазмида, несущая L-MYC и Lin28, и один плазмида, несущая EGFP, чтобы проверить эффективность трансфекции).
- Аспирируйте трансфекции смесь, содержащую клетки в мкл кончика 100 и вставьте пипетку с образцом вертикально в трубку, заполненную 3 мл электролитического буфера Е2, размещенных в пипетки станции электропорации машины, в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Эффективно электропорации клетки, используя следующую программу: 1650 В, 10 мс, 3 импульса.
- Ресуспендируют электропорации клетки (2 х 10 6 клеток) в 2 мл подогретого PBMNC среды, добавляя 0,25 мМ натрий бутират (NAB) и подсчитывают количество жизнеспособных клеток после электропорации протокола (на основе трипанового синего) 25.
- Передача клеток в одну лунку 6-луночного планшета с без покрытия, осторожно встряхнуть пластину и инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
- День после электропорации, страт количество GFP-положительных клеток при флуоресцентной микроскопии с 8-10 случайных полей, с тем чтобы оценить эффективность трансфекции.
- Поддерживать трансфицированных клеток без разделения на 3 дня, пока покрытие их на MEFs (см раздел 6).
- Замените 2 мл свежей среды PBMNCs, плюс 0,25 мм наб каждые два дня.
5. готовить блюда с фидерной клеток для совместного культивирования (день 16)
- Шерсть лунки 6-луночного планшета с 1 мл базальной мембраны матрицы в течение 15 мин при 37 ° С и пластины эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) при плотности 2 х 10 5 клеток / лунку с 2 мл 10% FBS, содержащейся DMEM (МЭФ среда) за один день до пассажей электропорации PBMNCs на MEF фидерных клеток.
6. Покрытие трансфицированных PBMNCs на MEFs (ДЕНЬ 17-19)
- Сбор PBMNCs в суспензионной культуре, с помощью пипетки 1 мл наконечником, в 15 мл коническую трубку центрифуги и трансфицировали PBMNCs при 300 х г в течение 10 минпри комнатной температуре.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 2 мл свежего PBMNC среды, плюс 0,25 мм наб.
- Пластина клеток на MEF покрытием 6 луночного планшета и инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
- После двух дней, аспирация среды и заменить его с 2 мл IPSC среды, состоящей из нокаут DMEM (КО-DMEM), 20% КО-сыворотка Замена (KOSR), 1 мМ NEAAs, 1% пенициллина / стрептомицина, 20 мМ L- Глютамин, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 10 нг / мл FGF (основной оФРФ) и 0,25 мМ NAB.
- Замените 2 мл свежей среды IPSC каждый день, и проверить клетки ежедневно.
Примечание: В 22-25 день, первые колонии ИПСК должны быть видны.
7. сбора и расширения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) Клоны (ДЕНЬ 30-35)
Примечание: В 30-35 дней после трансфекции, IPSC колонии должны быть готовы к комплектации и replating. Эффективность перепрограммирования должно быть Эстисоединяется как процент от количества колоний Ipsc / общее количество электропорации клеток, как сообщалось ранее 26.
- Накануне пассажей IPSC колонии, подготовить MEF подачи в 12-луночного планшета (1,25 х 10 5 клеток / лунку).
- Аспирируйте MEF средних и изменить с 1 мл IPSC среде с 10 нг / мл оФРФ и 10 мкМ Y-27632. Вручную рассекают с иглой одной колонии в каждый момент времени при вскрытии микроскопом в захватного капотом, чтобы получить сетку, собирать мелкие комки с помощью пипетки и передавать их по отдельности друг в одну лунку 12-луночного планшета, покрытого MEFs.
- Прохождение и расширение каждого 12-луночного планшета на 6-луночный планшет в соотношении 1: 2, а затем каждый 6-луночный планшет в соотношении 1: 4 для дальнейшего распространения. Проанализируйте и расширить ИПСК вручную в течение первых 2-3 проходов (как тщательно описано в шаге 7.2), а затем использовать процедуру фермент диссоциации (начните с шага 7.4).
- Для протокола фермент диссоциации, чистый IPSC колоныES аспирационных дифференцированные части, под микроскопом рассекает в подхвата капотом.
- Инкубируйте ИПСК 1 мл коллагеназы IV (1 мг / мл) в течение 10 мин при 37 ° С.
- Аспирируйте ферментного раствора, промыть клетки с 1 мл КО-DMEM и собирать колонии в 15 мл коническую трубку. Центрифуга при 100 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Аспирата супернатант, ресуспендируют колонии в 2 мл среды Ipsc с 10 нг / мл оФРФ и 10 мкМ Y-27632 и их на пластину MEF покрытием 6-луночный планшет (соотношение 1: 4).
8. Характеристика ИПСК (5-15 Проходы)
- Щелочной фосфатазы Окрашивание
- Культура колонии IPSC в течение 3-5 дней в среде с IPSC 10 нг / мл оФРФ.
- Для запуска щелочной фосфатазы окрашивания протокол, промыть ИПСК один раз PBS, а затем исправить их 1 мл 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Промыть клетки три раза с PBS, чтобы удалить остаточный PFA.
- Пятно фиксированные клетки, использующиекоммерческий щелочной фосфатазы окрашивания комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Иммунофлюоресценция
- Культура колонии IPSC в течение 3-5 дней в среде с IPSC 10 нг / мл оФРФ.
- Чтобы начать иммунофлуоресценции, мыть один раз с ИПСК PBS, а затем исправить их 1 мл 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Промыть клетки три раза с PBS, чтобы удалить остаточный PFA.
- Treat фиксированные ИПСК 1 мл / проницаемости блокирующего раствора, содержащего 4% козьей сыворотки, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 и 0,05% азида натрия (NaN 3) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Аспирируйте блокирующий раствор и инкубировать фиксированные клетки с первичными антителами в 3% БСА и 0,05% NaN 3 Раствор O / N при 4 ° С (проверить материальное таблицу для списка первичных антител и антител предложено коэффициент разбавления).
- На следующий день, мыть ИПСК три раза PBS, а затем инкубируют клетки с Alexa Fluor 488 козьего анти-мышиного и Alexa FlУОР 555 козьих антител против кроличьего антитела, разведенного 1: 1000 в 3% БСА и 0,05% NaN 3 раствора, в течение 1 ч при 37 ° С.
- Пятно ядер с DAPI (1 мкг / мл) в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте и последующей промывки три раза с PBS.
- Дифференциация ИПСК в эмбриональных органов (ЭТ)
- Культура колонии IPSC в течение 5-6 дней в среде с IPSC 10 нг / мл оФРФ.
- Удалить дифференцированные части из IPSC колонии аспирационных под микроскопом рассекает в подхвата капотом.
- Инкубируйте ИПСК 1 мл коллагеназы IV (1 мг / мл) в течение 10 мин при 37 ° С.
- Аспирируйте ферментного раствора, промыть клетки с 1 мл КО-DMEM и собирать колонии в 15 мл коническую трубку. Центрифуга при 100 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Аспирата супернатант и ресуспендируют колонии в 2 мл EB среды, состоящей из KO-DMEM, 20%, определенной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 мМ NEAAs, 1% пенициллина / стрептомицина, 20 мМ L-глутамина, 0,1 мМ46; -mercaptoethanol.
- Пластинчатый Ipsc колонии в суспензии в течение 6 дней на сверхнизких крепления 6-луночных планшетах, с тем чтобы обеспечить образование сфероидальных трехмерных эмбриональных телец (EBS). Изменить 2 мл свежей среды EB каждые два дня.
- На 7-й день, собирать ЭТ и пластины их на 0,1% желатином покрытием 6-луночных планшетах в 2 мл EB среды и поддерживать ЭТ в дифференцировке в течение 20 дней.
- Изменить 2 мл свежей среды EB каждые два дня.
- Qrt-ПЦР для анализа экспрессии генов
- Культура колонии IPSC в течение 5-6 дней в среде с IPSC 10 нг / мл оФРФ.
- Извлечение общую РНК из PBMNCs, ИПСК или ЭТ с использованием 1 мл коммерческой реагента в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Оценка концентрации РНК и чистоту с помощью соответствующих методов, таких как использование спектрофотометра (высокое качество РНК с 260/280 и A 260 / A 230 коэффициентов> 1,8) 27.
- ПроверитьЦелостность РНК с использованием коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя (высокое качество РНК RQI> 9,5) 28.
- Выполнение реакции обратной транскрипции на 1 мкг общей РНК, используя коммерческий набор обратный транскриптазы в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Подготовка смеси КПЦР содержали 5 нг матрицы кДНК, 7,5 мкл SYBR Green Supermix, 2 мкл 5 мкМ праймеров (вперед: 1 мкл и обратного: 1 мкл) и 6 мкл РНКазы / ДНКазы без воды для каждой реакции 29.
- Выполнение Qrt-ПЦР с использованием следующей программы: начальной стадии денатурации при 95 ° С в течение 10 мин с последующими 40 циклами, разделенных на стадии денатурации при 95 ° С в течение 15 сек и отжига праймеров и расширение шага при 60 ° С в течение 45 сек 29.
- Нормализация экспрессию других генов с использованием GAPDH в качестве гена 28 (см праймеров, перечисленных в таблице 1).
- КПЦРдля трансгенной отчуждения
- Экстракт ДНК из PBMNCs или токов с использованием 1 мл буфера для лизиса, содержащего 50 мМ Трис, 100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% додецилсульфат натрия (SDS) и 20 мкг / мл протеиназы К.
- Добавить равный объем (1 мл) 100% изопропанола, перемешивают инверсией три раза, чтобы позволить осаждение ДНК и центрифуге при 10000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Жидкость над осадком сливают, мыть ДНК гранул с 1 мл 70% этанола и центрифугируют при 10000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте и отбросить супернатант и ресуспендируют его в РНКазы ДНКазы / без воды.
- Оценка концентрации ДНК и чистоту с помощью соответствующих методов, таких как использование спектрофотометра (высокое качество РНК с 260/280 и A 260 / A 230 коэффициентов> 1,8) 27.
- Подготовка смеси, содержащие КПЦР 5 нг ДНК-матрицы, 7,5 мкл SYBR Green Supermix, 2 мкл 5 мкМ праймеров (вперед: 1 мкл и наоборот: 1 мкл) и 6 &# 181; л РНКазы ДНКазы / без воды для каждой реакции 29.
- Нормализация экспрессии специфических эписомными плазмиды EBNA-1 гена с использованием FBX-15 в качестве гена 29 (см праймеров, перечисленных в таблице 1).
- Кариотип анализ
- Культура колонии IPSC в течение 5-6 дней на тарелку с покрытием фидерных бесплатно базальной мембраны матрицы с коммерческой определяется, подающего свободной поддерживающей среде для ИПСК, следуя инструкциям изготовителя.
- Чтобы начать протокол исследования кариотипа, не отделить Ipsc колонии с 1 мл раствора открепления клеток в течение 5 мин при 37 ° С, до получения одного диссоциации клеток.
- Собирают клетки и центрифуги при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют иПСК в 2 мл среды, специально разработанный для культивирования клеток для пренатальной диагностики техники. Тарелка одноклеточные иПСК на базальной мембраны матричных покрытием стеклянной посуды и инкубировать их в 37 ° C, 5% СО 2 </ Суб> инкубатор.
- Через 2-4 дней, добавить 10 мкл / мл колхицина непосредственно к культурам и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
- Аспирируйте среду и инкубируют ИПСК в 1 мл гипотонического раствора (0,6% цитрата натрия и 0,13% хлорида калия) в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Промыть клетки с 1 мл 5% раствора уксусной кислоты и исправить ИПСК смесью метанол / раствором уксусной кислоты (соотношение 3: 1) в машине с контролируемой температурой и влажностью (28 ° C, 42% RH).
- Погрузитесь и пятен фиксированной клетки с Акрихин решение для 15-20 мин при комнатной температуре в темноте (чтобы получить Q-полосы) 30.
- Приобретать клеток метафаз под флуоресцентным микроскопом при увеличении 100X 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании простой и эффективный протокол для генерации свободных вирусных ИПСК по перепрограммированию PBMNCs выделенных из замороженных лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови и по сравнению с перепрограммирования PBMNCs, полученных после разделения в градиенте плотности сообщается. 1А показывает схематическое представление Подробный протокол. После оттаивания, изолированные PBMNCs, показывая типичный округлую форму, расширены в определенной культурой крови среды в течение 14 дней (рис 1B), а затем трансфицировали Эписомные плазмид. Через 10-15 дней после трансфекции, небольшие округлые светлые колонии с определенными полями и клеточной морфологией эмбриональных стволовых начинают появляться (рисунок 1С). Примерно 20-30 дней после трансфекции, IPSC колонии становятся очень компактный, с острыми краями, увеличить их размер и готовы для сбора и расширение (рис 1D). После шагов первый пассажей (2-3 проходов),IPSC колонии поддержания их недифференцированного состояния и показать типичный морфология эмбриональных стволовых клеток-человека. В течение первых проходов, ручной сбор является более эффективным способом по сравнению с расширением фермента диссоциации с целью выбора полностью недифференцированная, компактный и плотно упакованы колоний (2А). Более Увеличение IPSC колонии показаны отдельные клетки в колонии и высокий ядро соотношение цитоплазмы легче наблюдается (рис 2б). После первоначального механического сбора, выбранные IPSC клоны будут расширены с использованием фермента диссоциации коллагеназы IV. Через 10-15 проходов расширения в пробирке, цитогенетический анализ проводится на IPSC колонии. Около 20 метафаз из по меньшей мере двух независимых культур, примерно 300-400 уровне группы, анализируются и все образцы показывают нормальную кариограмму (фиг.2с). Это наблюдение предполагает, что иПСК генетически стабильными.
Кормовойэр расширения в пробирке (5-10 проходов), иПСК характеризуются для экспрессии маркеров стволовости и их плюрипотентность потенциала. 3А, В показывают, что иПСК положительны при щелочной фосфатазы окрашивания. Используя анализ Qrt-ПЦР, мы убедились, что иПСК выразить эндогенные гены плюрипотентных (SOX-2, Oct3 / 4, Nanog) при значительно более высоких уровнях, чем начинать PBMNCs, в то время как уровни экспрессии эндогенного C-MYC и KLF-4, подобное раньше и после перепрограммирования IPSC (3С). После всего лишь 5 пассажей в культуре, экспрессии экзогенных Эписомные трансгенов не может быть обнаружен в ИПСК, что указывает на успешное активацию эндогенных генов плюрипотентных. PBMNCs 5 дней после трансфекции с сильным уровнем экспрессии трансгена, оценивали с помощью специфических праймеров Эписомные для EBNA-1, используют в качестве положительного контроля. PBMNCs, которые никогда не подвергаются плазмидами, несущими 4 экзогенных генов плюрипотентности, используются в качестве отрицательного контроля (Fiфигура 3D). Наконец, анализ показывает, что иммунофлюоресценции иПСК выразить плюрипотентности маркеры, такие как Oct3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-и 1-81 (рис 4).
иПСК дифференцируются в эмбриональных телец (ЕВ) с использованием спонтанной дифференцировки протокол, как показано на фиг.5А, чтобы оценить их в пробирке плюрипотентности потенциал. Qrt-ПЦР эксперименты показывают, что иПСК способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков; Действительно, ЭТ, полученный после 20 суток дифференцировки дисплея значительной положительную регуляцию линии передачи маркеров представителем эндодермы (SOx-7 AFP), мезодермы (CD31, Acta-2, ЦРБ-5, Runx-1) и эктодермы (KTR- 14, М, GABRR-2) (Фиг.5В). Конфокальной микроскопии анализ показывает, что одноклеточный диссоциируют избиение кластеры выразить характерные маркеры кардиомиоцитов, такие как тропонина I (Тп-I) и α-актинина, организованный в ясной саркомерного рисунком (Рисунок6A). Кроме того, анализ иммунофлюоресценции ЭТ показывает положительное окрашивание для нейрона-специфический класс маркер III β-тубулина (TUJ1), а для дофаминергической нейронов маркер тирозингидроксилазы (TH) (рис 6В).
Рисунок 1. Протокол для генерации ИПСК из периферической крови человека и клеточных морфологических изменений в ходе протокола. (А) Схема протокола используется для генерации ИПСК, полученные из замороженных PBMNCs после АРД и PBMNCs изолированы от замороженных лейкоцитарных пленок, используя один трансфекции не-интеграции Эписомные плазмиды. (Б) Типичные изображения пролиферирующих PBMNCs полученные от DGS и Баффи пальто после оттаивания и расширения в культуре в течение 14 дней, прежде чем трансфекции. Масштабная линейка 100 мкм. (С) Примеры IPSC колонии неделю после того, как клетки плованные на MEFs. Масштабная линейка 500 мкм. (D) Типичные изображения IPSC колонии на 30-35 дней после повторной обшивки на MEF подачи слоя. Масштабная линейка 500 мкм. ИПСК = индуцированных плюрипотентных стволовых клеток; DGS = градиент плотности разделения; PBMNCs = мононуклеарных клеток периферической крови; МЭФ = мышиных эмбриональных фибробластов; Факторы GFs = роста; оФРФ = основной фактор роста фибробластов; NaB = натрия бутират. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Морфология и анализ кариотипа. () Типичные изображения IPSC колонии после 2-3 ручных шагов пассажей. Масштабная линейка 500 мкм. (Б) Более Увеличение IPSC колонии. Масштабная линейка 200 мкм. (С) Representative нормальные karyograms из ИПСК после 10-15 пассажей расширения в пробирке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Ipsc характеристики: активность щелочной фосфатазы, повторно экспрессии эндогенных генов плюрипотентности ИПСК и оценки трансгенной молчания (А) и (Б) Типичные изображения, показывающие положительное окрашивание на щелочную фосфатазу.. Масштабная линейка 500 мкм. (С) столбчатую диаграмму, показывающую повторного экспрессии эндогенных генов плюрипотентности (C-MYC, КФК-4, SOx-2, Oct3 / 4 и NANOG) в обоих ИПСК, полученных из АРД и лейкоцитарных пленок, используя анализ Qrt-ПЦР ( п = 4, Стьюдента-тест: * р <0,05, р <§ 0,005 против соответствующих PBMNCs). (D) Qrt-ПЦР с Эписомные-специфических праймеров (EBNA-1) (по сравнению с контрольной FBOX15 праймеров) не показывает генома интеграции Эписомные векторов. (П = 4, Стьюдента-тест: * р <0,001 против соответствующих PBMNCs 5-дневный трансфекции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Иммунофлуоресценции анализ эмбриональных стволовых клеток плюрипотентности маркеров. Окрашивание представитель иммунофлюоресценции показывает значительное выражение плюрипотентности белков SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct3 / 4 и SOX-2. Ядра контрастно DAPI. Масштабная линейка 200 мкм для IPSC DGS (A) и IPSC Баффи пальто (B). Масштабная линейка 100 мкм для IPSC Баффи пальто (A), IPSC DGS (Б сильный>) и (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Протокол дифференциации ИПСК и экспрессии трех генов зародышевой слоя в ЭТ получены из ИПСК. (A) схематическое представление протокола индуцирующего спонтанной дифференцировке в ИПСК из PBMNCs после АРД и лейкоцитарных пленок в ЭТ. (Б) Qrt-ПЦР экспериментов, демонстрирующие экспрессию всех генов трех зародышевых слоев: энтодермы (SOx-7, АФП), мезодермы (CD31, Acta-2, ЦРБ-5, Runx-1), и эктодерма (КРТ-14, TH, GABRR-2) в ЭТ после 20 суток дифференцировки (п = 4, Стьюдента: * р <0,05 по сравнению с соответствующей ИПСК коллегу). EBS = эмбриональные органы./52885/52885fig5large.jpg "Цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. конфокальной микроскопии анализ сердечных и нервных белков в ЭТ в 20-й день дифференциации, полученной из PBMNCs после DGS и Баффи пальто, полученных ИПСК. () Типичные изображения (максимальный выступ стек конфокальной изображения) для сердечных саркомерных белков α-актинина и тропонина I (Тп-я) в одноклеточных диссоциированных бить областей (масштабную линейку 10 мкм) и (В) для нейрон-специфический класс маркера III β-тубулина (TUJ1) и дофаминергических нейронов маркер тирозингидроксилазу (TH) (масштаб бар 20 мкм). Ядра контрастно DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюэтот показатель.
| Грунтовка | Последовательность | ||
| С-Мус FW | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 ' | ||
| С-Мус оборотов | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 ' | ||
| КФК-4 FW | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 ' | ||
| КФК-4 оборотов | 5'AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 ' | ||
| SOX-2 FW | 5'GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 ' | ||
| SOX-2 оборотов | 5'-3 TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG | ||
| Oct3 / 4 FW | 5'GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 ' | ||
| Oct3 / 4 оборотов | 5'CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 ' | ||
| NANOG FW | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 ' | ||
| NANOG оборотов | 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 " | ||
| SOX-7 FW | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 ' | ||
| SOX-7 оборотов | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 ' | ||
| AFP FW | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 » | ||
| AFP оборотов | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 ' | ||
| CD31 FW | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 ' | ||
| CD31 оборотов | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 ' | ||
| ACTA-2 FW | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 ' | ||
| ACTA-2 оборотов | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 ' | ||
| ЦРБ-5 FW | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 ' | ||
| ЦРБ-5 оборотов | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 ' | ||
| Runx-1 FW | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 " | Runx-1 оборот | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 " |
| КРТ-14 FW | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 ' | ||
| КРТ-14 оборотов | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 ' | ||
| TH FW | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 ' | ||
| TH оборотов | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 ' | ||
| GABBR-2 FW | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 ' | ||
| GABBR-2 оборотов | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 ' | ||
| EBNA-1 FW | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 ' | ||
| EBNA-1 оборот | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 ' | ||
| FBX-15 FW | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 ' | ||
| FBX-15 FW | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 ' | ||
| GAPDH FW | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' | ||
| GAPDH оборотов | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ' |
Таблица 1: Список Qrt-ПЦР праймеров Primer последовательности, используемые для оценки эндогенной экспрессии генов плюрипотентности, трансгенной молчания и выражения из трех зародышевых слоев маркеров..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В прошлом, единственным способом получения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, несущих определенную генетическую мутацию, был завербовать родителей, перенесших доимплантационная генетическую диагностику и произвести эмбриональные стволовые клетки из бластоцисты их выброшенных 31,32. Использование перепрограммирования подход, исследователи теперь может генерировать ИПСК из пациентов, несущих практически любой генотип. Возможность начать с конкретного пациента клеточной линии и легко доступным источником очень важно, поскольку оно позволяет исследовать патофизиологии расстройств и последующей идентификации новых терапевтических подходов.
В настоящем исследовании, мы объединили плазмиды подход 15 с методом уже применяется для производства ИПСК из PBMNCs ранее замороженных после разделения 22 градиента плотности и успешно сгенерированные незараженных ИПСК из замороженных Баффи пальто PBMNCs. Использование Баффи пальто вместо градиента плотности, разделенных PBMNCs всехпотоки нам сократить расходы, рабочее время и ручных операций для операторов при обработке образца. Настройка протокола недорогим используя PBMNCs из замороженных охристыми пальто имеет важное значение для исследований с повышенной числа участников и образцов коллекций в многоцентровых исследованиях. Важно отметить, что способность производить ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок позволяет получить доступ к многочисленным замороженных биопроб уже хранящихся в банках крови, используя простой, экономически эффективный и не так много времени метод для сбора образца.
Этот метод индукции может быть полезно для вывода интеграционных свободной конкретного пациента ИПСК, где колонии характеризуются отсутствием эписомальном трансгена только после нескольких проходов (≥5 переходы), в обоих исходных материалов. Примечательно, мы обнаружили, что все отобранные колонии IPSC получено от обоих типов исходного материала отображения сопоставимых особенностей плюрипотентности и сохранения клеточных и молекулярных сходства с ЭСК, Indicaка успешным IPSC вывод и согласуется воспроизводимость протокола.
Кроме того, мы успешно создали иПСК из более чем 10 человека фибробластов кожи и 3 мезенхимальных стромальных клеточных линий (как сердечных здоровых доноров и пациентов с сердечной и скелетных мышечных заболеваний), используя этот метод (данные не показаны), таким образом, предположить, что описано протокола могут быть использованы для успешного перепрограммирования различных типов клеток. Однако выбор из крови в качестве исходного материала является предпочтительным по сравнению с фибробластами, особенно если учесть, что экстенсивное расширение фибробластов в пробирке может повлиять на эффективность перепрограммирования, на основе фибробластов числом пассажей и пролиферации скоростью 33,34. Наш протокол также позволяет генерировать трансгенных свободной ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок после минимального времени культуры, тем самым уменьшая около 3-4 недель время, необходимое для вывода ИПСК по сравнению с другими источниками, такими как Интернетфибробластов. Кроме того, недавние исследования показали, что клеточные полученных иПСК крови отображения эпигенетическую подпись, что больше напоминает ЭСК, чем те, полученный из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) / 14,35 фибробластов.
Несмотря на успешное поколение ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок, должны быть рассмотрены в этом протоколе несколько ограничений. Перед перепрограммированием индукции, усиления PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок может представлять собой важный шаг протокола. Качество исходного материала могут сильно влиять на выбор и выделение PBMNCs, для достижения достаточного количества клеток для перепрограммирования процедуры (по крайней мере 2 × 10 6 клеток для электропорации). Это в основном из-за внутренней биологической изменчивости образцов, но также технических вопросов. Действительно, усиление PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок является менее эффективным по сравнению с PBMNCs полученных от разделения в градиенте плотности, из-за сильного дехарактера температурной зависимости от ручной изменчивости оператора. В целях повышения воспроизводимости и эффективности PBMNC усиления от замороженных охристыми пальто без разделения в градиенте плотности, использование автоматизированных систем настоятельно рекомендуется собирать Баффи пальто фракций. Хотя это более трудно расширить достаточное количество PBMNCs из лейкоцитарных пленок, чем PBMNCs после градиента плотности разделения, эффективность перепрограммирования (около 0.001-0.0005%) из двух исходных материалов сопоставима, в соответствии с эффективностью перепрограммирования крови сообщалось ранее 14, 23. Поскольку эффективность перепрограммирования низок для регенеративных целей медицины, использование улучшенной EBNA1 / OriP (из вируса Эпштейна-Барр, ВЭБ) эписомные векторы могут увеличить количество IPSC колонии для будущего развития клеточной терапии 22,36. Кроме того, MEF подачи слой для генерации и поддержания IPSC используется в нашем протоколе. Для того чтобы получить клинико-класса ИПСК, фидерных свободной культуры может быть Стараяrnative метод для дальнейших исследований.
В заключение, этот протокол представляет собой действенный метод для создания ИПСК из легкодоступной пациента источника клеток с большим преимуществом, используя не-интегративный системы, которые потенциально могут быть использованы для вывода клинико-класса ИПСК, не только для моделирования болезней, но Также для будущей персонализированной медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
