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Immunology and Infection

Kupffer Zelle Isolierung für die Toxizität von Nanopartikeln Testing

doi: 10.3791/52989 Published: August 18, 2015

Abstract

Die große Mehrheit der in-vitro-Studien haben nanotoxikologische immortalisierten Zelllinien auf ihre Praxistauglichkeit verwendet. Jedoch haben Ergebnisse aus Nanopartikeln Toxizität in immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen Diskrepanzen zeigt, die die Notwendigkeit, die Verwendung von primären Zellen für in vitro-Assays zu erweitern. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Mausleber Makrophagen, Kupffer-Zellen genannt, und ihre Verwendung zur Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. Kupffer-Zellen sind die häufigsten Makrophagenpopulation im Körper und Teil des retikuloendothelialen Systems (RES), für die Erfassung von zirkulierenden Nanopartikel verantwortlich. Die Kupfferzellen Isolierverfahren hier berichtet wird, auf einem 2-Schritt-Perfusionsverfahren, gefolgt von Reinigung über Dichtegradientenzentrifugation basieren. Wobei das Verfahren, bezogen auf Kollagenaseverdau und Dichte der Zentrifugation wird der von Smedsr d et al ursprüngliche Protokoll angepasst. für Rattenleberzell isolatio ausgelegtn und bietet hohe Ausbeute (bis 14 x 10 6 Zellen pro Maus) und hoher Reinheit (> 95%) von Kupffer-Zellen. Diese Isolierung Methode erfordert keine teure Ausrüstung oder anspruchsvoll und stellt somit einen idealen Kompromiss zwischen Komplexität und Zellausbeute. Die Verwendung von schwereren Mäuse (35-45 g) die Ausbeute an dem Isolierungsverfahren, sondern erleichtert auch bemerkenswert, das Verfahren der Pfortader Kanülierung. Die Toxizität von Kohlenstoffnanoröhren f -CNTs wurde in diesem Modell durch das modifizierte LDH-Assay gemessen. Dieses Verfahren bewertet die Lebensfähigkeit der Zellen durch Messen der Mangel an struktureller Integrität Kupffer Zellmembran nach Inkubation mit f -CNTs. Toxizität von f induzierte -CNTs konsistent mit diesem Assay gemessen werden, Hervorhebung, dass isolierte Kupffer-Zellen sind für die Prüfung der Toxizität von Nanopartikeln. Das Gesamtverständnis der Nanotoxikologie können von diesen Modellen profitieren, so dass die Nanopartikel-Auswahl für die klinische Übersetzung effizient.

Introduction

Der Bereich der Toxikologie Forschung zielt auf die biologische Wirkung von Nanopartikeln zu charakterisieren. Toxikologische Untersuchungen auf Basis von in vivo Untersuchungen bleiben die genauesten Methoden. Allerdings ist ihr Einsatz durch ihre Kosten, Arbeit und Zeitaufwand 1 beschränkt. Als Alternative, in vitro-Assays wurden aufgrund ihrer Einfachheit und der Möglichkeit der Entwicklung von Hochdurchsatz in vitro Testplattformen 2 verwendet wurden - so Erweiterung der Anzahl von Bedingungen getestet. Esten nanotoxikologische Untersuchungen werden mit Hilfe von in-vitro-Assays mit immortalisierten Zelllinien. Es gibt jedoch Bedenken hinsichtlich der Extrapolation dieser experimentellen Befunde in vivo toxikologische 3. Tatsächlich können die Eigenschaften der immortalisierten Zelllinien signifikant von Geweben sie abgeleitet wurden, zum Beispiel genetische Transformation 4. Verschlechterung von wichtigen morphologischen Merkmale sein5, Verlust der Zellpolarität 6 und funktionellen Veränderungen wie die Regulierung von Entzündungsmediatoren 7.

Kupffer-Zellen sind die häufigsten Makrophagenpopulation im Körper und sind in direktem Kontakt mit Blut durch Auskleiden der Wand Lebersinusoide. Als Teil des retikuloendothelialen Systems (RES), sind diese Makrophagen für die Erfassung von zirkulierenden Nanopartikel und damit verantwortlich, bilden eine sehr geeignetes Modell, um die Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. In vivo 8 und In-vitro-Studien 9 von Entzündungsreaktionen mit Kupffer-Zellen zu Nanopartikeln ausgesetzt zugeordnet wurden an anderer Stelle veröffentlicht. Kupffer-Zellen wurden ebenfalls in der Pathogenese von Lebererkrankungen wie alkoholische Leberkrankheit 10, Leberfibrose 11 oder Virushepatitis 12 beteiligt. Es wurde berichtet, dass isolierte Kupffer-Zellen liefern nützliche Einblicke in zelluläre Mechanismen inv beschreibenLeberstörungen 13,14 olved.

Mehrere Verfahren wurden berichtet, zu isolieren und zu reinigen, Kupffer-Zellen. Zellisolierung aus mechanischen oder enzymatischen Dissoziation 15 führen. Kollagenaseverdau zeigt den Vorteil, dass die Erhaltung der Funktionsfähigkeit der Kupffer-Zellen, während die zu hohen Kupffer Zellausbeute 16. Viele experimentelle Ansätze unterschiedlicher Komplexität und die Kosten, sind verwendet worden, um den Kupffer-Zellen von anderen Leberzellpopulationen zu trennen. Beispielsweise kann Kupfferzelle Reinheit durch Immunoaffinitätschromatographie 17. Strömungs Elektrophorese 18, 16 oder selektive Adhäsion durch die Zentrifugalkraft Techniken 16, die Zellen auszuwählen entsprechend ihrer Größe und Dichte erreicht werden. Eine Kombination dieser Verfahren kann gewählt werden, um die Reinheit der Bevölkerung 16 zu erhöhen. Es besteht kein Konsens über die ideale Methode für die Kupffer-Zellisolierung, da sie größtenteils abhängig von der Anwendung und den verfügbaren equipment. Im Falle von Nanopartikeln Toxizitätstests, die Einfachheit und eine hohe Ausbeute der Technik mit der funktionellen Erhaltung Kupffer Zellen assoziiert ist jedoch zu dem als am besten geeignet für diese Anwendung.

Die Kupfferzellen Isolierverfahren hier berichtet wird, auf einem 2-Schritt-Perfusionsverfahren, gefolgt von Reinigung über Dichtegradientenzentrifugation basieren. Die Methode wurde von dem vom Smedsr d et al ursprüngliche Protokoll geändert. 16 für Rattenleberzellisolierung konzipiert. Die meisten Studien berichtet und beschrieben die Isolierung von Kupffer-Zellen aus Rattenlebern. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kupffer-Zellen aus Mäuseleber isoliert, in hoher Ausbeute und Reinheit. Die Verwendung von Mäusen, vermindert die Kosten und Experiment erlaubt die Verarbeitung mehrerer Lebern, große Mengen von Kupffer-Zellen zur Nanopartikeltoxizitätstests erhalten.

Im folgenden Protokoll wurden Kupffer-Zellen mit funktionalisierten Kohlenstoff-Nanoröhren inkubiert (f also hohen Länge-Durchmesser-Verhältnis und eine große Oberfläche haben CNTs interessante Kandidaten als Vektoren für die Therapie und Diagnosezwecken hergestellt. Allerdings wurde die Sorge in Bezug auf die Toxizität von CNTs 19, und die Entwicklung neuer in vitro-Tests zielt darauf ab, das Verständnis der CNT biologische Wirkung erhöht. Toxizität in Kupffer Zelle mit einem Mangel an struktureller Integrität der Zellmembran assoziiert. Dies wird durch den Verlust der zytoplasmatischen Enzyms LDH aus der Zelle in den Überstand gemessen. Das Prinzip dieses Verfahrens ist es daher, um jede freigesetzte LDH zu entfernen und zu messen, was in den Zellen 20 belassen. Dies wird bevorzugt, um die Messung des freigesetzten LDH im Überstand durchgeführt, da das Vorhandensein von CNTs in dem Überstand stört den Test 21.

Wir schlagen vor, die Verwendung dieser einfachen und kostengünstigen Kupffer Zellisolierung method zu hoher Anzahl funktioneller Kupffer-Zellen zu isolieren. Dies ermöglicht das Screening von Toxizität einer Reihe von Nanopartikeln in einem relevanten primären Makrophagenmodell.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden durchgeführt. Das Protokoll demonstriert wurde unter der Leitung und Genehmigung des britischen Innenministeriums Regelung durchgeführt

1. Perfusion and Cell Collection (Figur 1)

Abbildung 1
Abb. 1: Leberperfusion Nach Anästhesie der Maus, der Verdauungstrakt ist seitlich nach links des Bauches, um die Pfortader (PV) zugänglich zu machen bewegt. Der Istwert mit einer langsamen Flussgeschwindigkeit (1-3 ml / min) von EGTA / HBSS-Lösung und die untere Veina cava (IVC) kanüliert sofort aufgebrochen, um überschüssige Druck in der Leber zu vermeiden. Innerhalb der ersten Minute der Perfusion wird die Fließgeschwindigkeit allmählich zu 7 ml / min erhöht. Die Collagenase-Lösung wird dann bei 10 ml / min perfundiert, bis zu seiner vollständigen Verdauung erreicht wird.

  1. PrepaWieder frisch alle in der Materialtabelle beschriebenen Reagenzien.
  2. Warm das EGTA (Ethylenglykol-Tetra-Essigsäure) / HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Lösung (50 ml pro Maus) und die Kollagenase-Lösung (100 ml pro Maus) 30 Minuten lang bei 40 ° C.
  3. Zuerst mit 70% Ethanol spülen Sie den flexiblen Pumpschlauch. Gießen Sie 40 ml EGTA / HBSS-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen im Wasserbad getaucht und spülen Sie den flexiblen Pumpschlauch mit vorgewärmter EGTA / HBSS Lösung.
  4. Führen Terminal Anästhesie mit einem Barbiturat zuverlässig Bewusstlosigkeit erzeugen, bevor die Atemdepression und Tod. Injizieren Phenobarbital bei 1 mg / kg, ip in einen weiblichen oder männlichen CD1-Maus (35-45 g). Bestätigen Sie die Anästhesie durch toe Kneifen.
  5. Rasieren Bauchhaare und sterilisieren die Bauchfläche mit 70% Ethanol-Lösung.
  6. Messer durch die Bauchhöhle und setzen die Pfortader und Vena cava inferior durch Bewegen des Darms seitlich nach links des Bauches.
  7. Start die Pumpe bei einer Geschwindigkeit von 1-3 ml / min mit EGTA / HBSS-Lösung und kanülieren die Pfortader mit einer 23 g Schmetterlingsnadel (Flügel geschnitten). Klemmen Sie den Abschnitt der Pfortader mit der 23 G-Nadel einer Kanüle versehen, und dann drehen Sie die serrefine Zange an der Oberfläche des geöffneten Mausunterleib. Die Leber sollte rasch blass innerhalb der ersten 30 sec von EGTA / HBSS-Lösung Perfusion.
  8. Der untere Teil der unteren Hohlvene rasch einzuschneiden, um überschüssige Druckaufbau in der Leber vermieden, und erhöhen die Fließgeschwindigkeit allmählich zu 7 ml / min, über der ersten Minute der Perfusion. Das Tier stirbt wegen Blutungen sekundär zu Venenpunktion Vena cava.
  9. Wenn weniger als 5 ml EGTA / HBSS Lösung wird in die Zentrifugenröhrchen verbleibenden, füllen Sie es mit Kollagenase-Lösung (40-50 ml). Erhöhung der Strömungsrate allmählich auf 10 ml / min, über 30 sec.
  10. Stellen Sie die Leber anschwellen, indem Druck auf die untere Hohlvene, mit einer Pinzette, für 5-10 sec Intervallen. This kann in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden (5-10 mal während der Verdauung). Mit diesem Schritt wird die Leberzelle Dissoziation zu verbessern und mit Collagenase reduzieren die Durchblutung Zeit.
  11. Wenn weniger als 10 ml Kollagenase-Lösung innerhalb des Zentrifugenröhrchens bleibt, gießt 40-50 ml vorgewärmtes Collagenaselösung in dem Zentrifugenröhrchen.
  12. Nach 10-15 min Perfusion und etwa 70-80 ml Kollagenase-Lösung perfundiert, eine kleine Druck auf die Oberfläche der Leber mit einer Pinzette. Ein Druck des Druck zeigt an, dass Leberzellen dissoziiert.
  13. Entfernen Sie die Leber aus der Bauchhöhle als ein Stück und legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen mit 20-30 ml Kupffer-Zellen Isolierung Medium. Halten Sie Leberzellen auf Eis oder bei 4 ° C für einen Zeitraum von maximal 3 Stunden zu vermeiden, die Leberzelllebensfähigkeit.
  14. Wiederholen Sie den Vorgang auf Perfusion mehrere Tiere, wenn nötig, während die Leber perfundiert auf Eis. Pool 1-3 Lebern für die Reinigung und fahren Sie mit Stufe 3.

2. Herstellung des Dichtegradienten für die Zentrifugation (Figur 2)

Figur 2
Abb. 2: Vorbereitung des Dichtegradienten Alle Vorgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Der SIP wird durch Mischen von 15,3 ml von beschichteten Silicapartikel-Lösung mit 1,7 ml 10 x PBS hergestellt. Ein 5 ml SIP werden mit 15 ml PBS gemischt und 20 ml 25% SIP Lösung herzustellen. 10 ml von SIP werden mit 10 ml PBS gemischt und 20 ml 50% SIP Lösung herzustellen. Zentrifugenröhrchen, das 50% SIP-Lösung (20 ml) gekippt wird und die 25% SIP-Lösung (20 ml) wird langsam mit einer serologischen 25 ml-Pipette.

  1. Fahren Sie mit den folgenden Schritten (Abschnitt 2., 3. und 5.) unter sterilen Bedingungen und halten Zellen auf Eis oder bei 4 ° C. Bereiten Sie die SIP (Lösung von Isotonische beschichteten Siliciumdioxid-Teilchen) durch Mischen von 15,3 ml von beschichteten Silicapartikel-Lösung mit 1,7 ml 10 x PBS. Zu 20 ml 25% SIP-Lösung zu machen, mischen Sie 5 ml SIP mit 15 ml PBS. Zu 20 ml 50% SIP-Lösung zu machen, mischen 10 ml SIP mit 10 ml PBS.
  2. Füllen eines Zentrifugenröhrchen mit 20 ml der 50% igen Lösung SIP. Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen in einem Winkel nahe 90 ° und fügen Sie langsam die 25% SIP-Lösung (20 ml) auf der Seitenwand der Röhre mit einem 25 ml serologische Pipette, ohne Berührung der Oberfläche des 50% SIP-Schicht. Beim Hinzufügen von 25% SIP Lösung progressiv den Winkel der Röhre zu verringern. Halten Sie den Dichtegradienten auf Eis bis zum Gebrauch.

3. Kupfferzelle Reinigung (Figur 3)

Figur 3
Fig. 3: Reinigung von Kupffer-Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und Zelladhäsion Alle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. (A) Nach dem Bruch der Glisson-Kapsel, werden Leberzellen durch eine 1 gefilterten00 & mgr; m Sieb. Die Suspension wird bei 50 x g zentrifugiert, um Hepatozyten zu verwerfen (Pellets) zu sammeln und das nicht-parenchymalen Zellfraktion (Überstand). Diese Stufe wird 3 mal wiederholt. Nicht-parenchymalen Zellen auf einem diskontinuierlichen isotonischen Gradienten gegeben und bei 800 · g für 15 min zentrifugiert. Kupffer-Zellen von 25% SIP Kissen gesammelt werden durch Zelladhäsion Selektion gereinigt. (B) Die Zellen werden in 24-Well-Platte ausplattiert und bei 37 ° C für 30 min inkubiert und 5% CO 2. Nicht-adhärente Zellen werden einmal mit 500 ul HBSS gewaschen. Kupffer-Zellen zeigen ihre haft Morphologie 4 Stunden nach der Plattierung, wenn f -CNTs können zu den Zellen gegeben werden. Der Maßstab entspricht 25 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Setzen Sie einen perfundierten Leber in einer Petrischale mit 15 ml Kupffer Zelle Isolierung Medium. Bruch der Glisson-Kapsel (Membran der Leber) mit einer Schere und lassen alle Leberzellen in den Kupffer-Zellisolierung Medium. Die Lösung wird, obwohl ein 100 & mgr; m Zellsieb in ein Zentrifugenröhrchen gesammelt werden. Wiederholen Sie den Vorgang auf zusätzliche Perfusion perfundierten Leber und bündeln die Zellen in der gleichen Zentrifugenröhrchen (15 ml von einer Maus, bis zu 45 ml von drei Mäusen).
  2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 g für 2 min bei 4 ° C. Parenchymale Zellen (Hepatozyten) wird in dem Pellet und nicht-parenchymale Zellen (einschließlich Kupffer-Zellen) werden in dem Überstand sein.
  3. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 50 g für 2 min je. Wiederholen Sie diesen Schritt drei weitere Male.
  4. Zentrifuge bei 1.350 × g für 15 min pelletiert nicht-parenchymalen Zellen. Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml von Kupffer Zellen Isolierung Medium.
  5. In den nicht-Parenchymzelle Lösung auf dem diskontinuierlichen isotonischen Gradienten 25/50%, wie in 2.3 beschrieben. Centrifuge bei 850 × g für 15 min ohne Beschleunigung oder Pause.
  6. Lokalisieren des angereicherten Kupfferzelle Fraktion innerhalb 25% SIP Fraktion in der Nähe des 25/50% SIP-Schnittstelle (Figur 3) erscheinen trüb. Mit einem 10 ml serologische Pipette absaugen etwa 12 ml der angereicherten Kupffer Zellfraktion. Übertragungszellen in ein Zentrifugenröhrchen mit 35-40 ml Kupfferzelle Isolationsmedium. Vorsichtig mischen und Zentrifugieren bei 1.350 xg für 15 min bei 4 ° C Zellen zu pelletieren.
  7. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 5-10 ml vorgewärmtes Kupffer Zellkulturmedium. Count-Zellen (Hämozytometer) und messen die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau-Färbung.
  8. Platte der gereinigten nicht-Parenchymzellen in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 5 Zellen / Vertiefung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 (Figur 3). Nach 30 Minuten, entfernen Sie vorsichtig das Medium, waschen mit vorgewärmter Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) einmal ersetzenes mit 500 ul frisch und vorgewärmte Kupffer Zellkulturmedium (pro Vertiefung).
  9. Verlassen Kupffer Zellen für mindestens 4 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2 vor der Behandlung mit Nanopartikeln, damit sie ihre haft Morphologie erhalten.

4. Charakterisierung

  1. Kupffer-Zellen Purity
    1. Bereiten Sie frisch verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten Kupffer PBS / BSA-Lösung. Wasche die Zellen einmal mit 500 ul PBS / BSA-Lösung. Entfernen Sie die PBS / BSA-Lösung und nehmen Kupffer-Zellen in 500 ul frischem PBS / BSA-Lösung mit leichtem Kratzen. Wenn Zellen in 24-Well-Platten, kürzen Sie die Enden der Schaberklingen mit einer Schere, um das Lösen einfacher zu fahren. Übertragen Sie Zellen in der Durchflusszytometrie Röhren.
    2. Zählen Kupffer-Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Zentrifuge 1 x 10 5 Zellen bei 1350 x g. Resuspendieren Kupffer-Zellen in 30 ul F4 / 80-Antikörper (unverdünnt). Gut mischen und bei Raumtemperatur für 30 min. Halten Sie die ungefärbten Zellen (nicht mit dem Antikörper) auf Eis.
    3. 2 ml PBS / BSA-Lösung in gefärbten Zellen, Zentrifuge bei 1.350 g für 5 min und entsorgen Sie die resultierende Überstand. Resuspendieren gefärbten Zellen in 200 ul PBS / BSA.
    4. Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Tor 10.000 unbefleckt Kupffer-Zellen nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung) und Granularität (side scatter). Analysieren Fluoreszenz gated Zellen in FL-1-Kanal.
    5. Wiederholen Sie den Vorgang für Bunt Kupffer-Zellen halten die gleichen Einstellungen für die Durchflusszytometrie-Analyse von ungefärbten Kupffer-Zellen verwendet. Auszuwählen und Quantifizierung der Fluoreszenz von gefärbten Zellen, die Reinheit Kupfferzelle beurteilen.
  2. Kupffer Zelle Phagozytoseaktivität
    1. Ersetzen Medien mit 0,5% (v / v) fluoreszierenden Kügelchen in Kupffer Cell Culture Medium und Inkubation für 4 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
    2. Um nicht verinnerlicht Perlen, Zentrifuge Kupffer-Zellen bei 1350 · g, di entfernenscard den Überstand und resuspendieren Zellen in 500 ul PBS / BSA-Lösung. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male.
    3. Scrape Kupffer-Zellen in 500 ul PBS / BSA-Lösung und Transfer Zellen in ein Durchflußzytometrie Röhre.
    4. Centrifuge Kupffer-Zellen bei 1350 · g, den Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 200 ul PBS / BSA-Lösung.
    5. Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Tor 10.000 unbefleckt Kupffer-Zellen nach ihrer Größe (Vorwärtsstreuung) und Granularität (side scatter). Analysieren Fluoreszenz gated Zellen in FL-2-Kanal.

5. Die Inkubation von chemisch funktionalisierte Kohlenstoffnanoröhren (f -CNTs)

  1. Bereiten Sie eine Dispersion f -CNTs (1 mg / ml) in Wasser durch Ultraschallbehandlung für 15 Minuten vor dem Gebrauch. F -CNTs werden im eigenen Haus 22 vorbereitet.
  2. Bereiten 2x konzentriert f- CNTs Dispersion in Kupffer Zellkulturmedium. Beschallen f- CNTs in Medium dispergiert2 Minuten, bevor Sie mit Schritt 5.3 fortfahren).
  3. Für jeden gut, ersetzen Sie 250 ul alten Medien mit 250 ul 2x f -CNTs Dispersion. Unbehandelten Vertiefungen (250 & mgr; l konditioniertes Medium + 250 & mgr; l frisches Kupffer Cell Culture Medium) und Vertiefungen, die mit 10% DMSO behandelt werden als negative und positive Kontrolle verwendet wurden.
  4. Inkubieren Kupffer Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 oder 72 Stunden.

6. Toxizität Beurteilung f -CNTs in Kupffer-Zellen nach dem modifizierten Lactatdehydrogenase (LDH) Assay

  1. Überstand verwerfen.
  2. Fügen Sie 200 ul (pro Well Platte mit 24 Vertiefungen) von Lysis Buffer und bei 37 ° C für 30 min-1 Std.
  3. Nach Durchführung heftiges Pipettieren, sammeln bei 40.000 xg in Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge lysiert Kupffer-Zellen für 10 Minuten, um zu pelletieren f -CNTs, die von den Zellen und der Zelltrümmer aufgenommen wurden.
  4. Sammeln Sie die Überstände (ƒ-CNT frei) inReaktionsgefäße und bei -20 ° C oder fahren Sie mit Schritt 6.5).
  5. Transfer 50 ul in eine Platte mit 96 Vertiefungen und dasselbe Volumen des Substrats Mix-Lösung (LDH-Kit) in jede Vertiefung. Streifen abdecken und bei Raumtemperatur für 15 min vor Zugabe von 50 & mgr; l der Stopplösung (LDH-Kit). In dreifacher Ausführung von leeren Vertiefungen, die 50 & mgr; l Lysepuffer 50 ul Substrat-Mix-Lösung und 50 ul Stop-Lösung.
  6. Die Absorption bei 490 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät und verwenden Sie die folgende Formel, um die (%) Zelllebensfähigkeit zu berechnen.

Gleichung 1

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Representative Results

Die Anzahl der nicht-gereinigten Parenchymzellen war konsistent und lag im Bereich zwischen 8 und 14 x 10 6 Zellen pro Maus (17 Isolierungen wurden durchgeführt). Jede Maus Isolation war ausreichend, um 16 bis 28 Brunnen zu plattieren. Die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Färbung zeigten die Zelllebensfähigkeit ~ 95%. Kupffer-Zellen zeigten eine runde Form innerhalb von 30 min Inkubation bei 37 ° C, das unvollständige adhärente Morphologie (4A) bezogen. Bei 4 h Inkubation und anschließend wurden die Zellen verteilt und Zellhaufen zu bilden begann.

Kupffer-Zellen wurden dann charakterisiert, ihre Reinheit und phagozytische Aktivität zu bestätigen. Die Zellen wurden mit F4 / 80 Antikörper gefärbt, um den Kupffer-Zellen Reinheit zu demonstrieren. Durchflusscytometrie-Analyse zeigte Kupfferzelle Reinheit über 95% (Figur 4B). Zellen wurden mit 1 & mgr; m fluoreszierenden Kügelchen, 12 h nach dem Ausplattieren inkubiert, um ihre Fähigkeit zur Aufnahme großer Teilchen zu bestätigen. Durchflusscytometrie-Analyse zeigte, That mehr als 85% von Kupffer-Zellen sind phagozytische, dh bis die 1 & mgr; m-Perlen (4C) zu nehmen. Nach 72 h der Kultur, 40% der Kupffer-Zellen wurden phagozytischen, das anzeigt, dass Kupffer-Zellen teilweise ihrer phagozytischen Aktivität verloren.

Mikroskopie von Kupffer-Zellen mit f -CNTs für 24 und 72 h inkubiert ergab ähnliche Zellmorphologie im Vergleich zu naiven Zellen (5A). Kupffer-Zellen mit 10% DMSO (positive Kontrolle) inkubiert angezeigt nekrotischen Morphologie (5A). Nach der Analyse des modifizierten LDH-Assay, Kupffer-Zellen mit 10% DMSO (positive Kontrolle) für 24 behandelt und 72 Stunden zeigte eine hohe Toxizität (5B). Im Vergleich dazu f -CNTs induzierte leichte, aber signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen nur, wenn die Zellen bei 50 & mgr; g / ml für 72 h (5B) belichtet.

Figur 4
Abbildung 4: Reinheit und Uptake Abilities von Kupffer-Zellen (A) Mikroskopische Aufnahmen von Kupffer-Zellen nach 30 min oder 24 h bei 37 ° C mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 überzogen.. Der Maßstab präsentiert 50 um. (B) Durchflusszytometrie Analyse von Kupffer-Zellen erfolgte nach FSC / SSC-Gating-Zelle durchgeführt. Kupfferzelle Reinheit wurde mit F4 / 80-Antikörper-Färbung bestimmt und zeigte, zu über 95% betragen. (C) Kupffer-Zellen wurden für 4 Stunden in Gegenwart von 1 & mgr; m fluoreszierenden Kügelchen ihre Phagozytoseaktivität beurteilen inkubiert. Die funktionellen Eigenschaften von Kupffer waren besser in frisch isolierten Zellen (12 Stunden nach dem Ausstreichen) im Vergleich zu Zellen nach 3 Tagen getestet gehalten.

Figur 5
Abbildung 5: Aufnahme und Toxizität von <em> f- CNTs in Kupffer-Zellen. (A) Mikroskopische Aufnahmen von Kupffer-Zellen. Abbildungen zeigen Kupffer-Zellen mit 10% DMSO und 50 & mgr; g / ml f -CNTs für 24 und 72 h lang bei 37 ° C. Der Maßstab präsentiert 50 um. (B) Geändert LDH-Assay. Niedrige Zelllebensfähigkeit wurde in 10% DMSO behandelten Zellen (positive Kontrollen), während f -CNTs erst nach Exposition mit 50 ug / ml für 72 h signifikant die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt gesehen. * P <0.05 gegenüber dem vorbehandelten Zustand (ohne 10% DMSO Bedingung) durch eine Varianzanalyse (one-way ANOVA) mit post hoc Analyse durch den Tukey-Test. Der Maßstab entspricht 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die folgenden Schritte sind entscheidend für die hohe Ausbeute und hohe Rentabilität der Kupffer-Zellen zu erreichen. Aseptischen Bedingungen zu verwenden, um das Risiko einer bakteriellen und Pilzkontamination zu begrenzen. Alle Instrumente müssen vor Gebrauch sterilisiert werden. Reagenzien werden frisch vor der Durchführung der Isolationsverfahren hergestellt werden.

Die Wahl der Collagenase IV, mit niedrigen Trypsinaktivität, ist von entscheidender Bedeutung. Verschiedene Partien vom gleichen Lieferanten haben unterschiedliche enzymatische Aktivität und sie benötigen, um zunächst im Vergleich zu den am besten geeigneten Ansatz zur Zellisolierung Kupffer auszuwählen. Dies kann durch die Bewertung Zellausbeute und die Lebensfähigkeit der Zellen beurteilt werden. Es wird ebenfalls empfohlen, um die Anbieter zu kontaktieren, um Chargen, die für ähnliche Anwendungen verwendet worden sind, bereitzustellen. Einmal entschied sich für die Charge zu verwenden, behalten es für die zukünftige Verwendung.

Die Kanülierung Verfahren erfordert Training. Planen Sie den Einsatz von mehreren Tieren zuversichtlich, mit der Pfortader zu werdenKanülierung Verfahren. Mit etwas Übung werden erfolgreiche Kanülierung leicht erreicht werden kann, und das Verfahren kann von einer Person gehandhabt werden. Man beachte, daß die Verwendung von Schwer Tiere vergrößert den Durchmesser der Pfortader und erleichtert somit das Verfahren. Wenn die Rückwand der Pfortader perforiert ist es technisch schwierig, die Vene wieder öffnen, vor allem wenn man neue bei dieser Vorgehensweise sind, und daher ist es bevorzugt, mit einem neuen Tier zu starten.

HBSS und Kollagenase Lösungen sollte ihr pH-Wert auf 7,4 eingestellt und bei 40 ° C vorgewärmt, um eine Ausgangstemperatur von der Schlauchpumpe von 37 ° C zu erreichen. Die Perfusion mit EGTA / HBSS-Lösung (Ca 2+ und Mg 2+ frei), enthaltend EGTA für die Unterbrechung der Ca 2+ -abhängigen Adhäsionsmoleküle, genannt desmosome Bedarf Schwächung der Zell-Zell-Interaktion. Collagenase Typ IV verwendet wird, um Leberzellen lösen sich von der extrazellulären Matrix und so führen, um LeberZelldissoziation. Die Perfusion Zeit für die beiden Lösungen sollte 15 min für CD1 Mäusen, aber andere Stämme, wie C57BL / 6 nicht übersteigt, erfordern etwas länger Leber Aufschlusszeit.

Um eine erfolgreiche Isolation zu erreichen, ist es notwendig, hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit zu erhalten. Wenn der Experimentator hat keine Erfahrung in Leberzellisolierung, ist es ratsam, Hepatozyten Pellets aus den ersten 3 Zentrifugation bei 50 · g durch Trypanblau-Ausschluss-Assay zu kombinieren und zu zählen Zellen. Die Hepatozyten Ausbeute sollte> 20 x 10 6 Zellen und die Hepatozyten Lebensfähigkeit> 50% sein. Geringe Erträge resultieren im Wesentlichen aus armen Zelle Dissoziation führt indirekt zu Kupffer Zellausbeute senken. Es sollte bestätigt werden, dass die Leber ordnungsgemäß am Ende der Perfusion Schritt aufgeschlossen werden. Wenn geeignete Hepatozyten Ausbeute ist in Kombination mit niedrig Hepatozyten Fähigkeit erreicht wird, kann dies von einer übermäßigen Kollagenaseverdau führen jedoch eher durch eine unangemessene Leber erklärtPerfusion oder die Verwendung eines kontaminierten Reagenz / Material.

Nach dem Plattieren Kupffer-Zellen sind empfindlich und sollten vorsichtig gewaschen werden. Mindestens 4 Stunden für Kupffer-Zellen benötigt, um ihre Anhänger Morphologie erwerben. Die Behandlung erfolgt in der Regel 4-24 Stunden nach der Beschichtung durchgeführt, so Kupffer-Zellen zeigen ihre maximale Phagozytoseaktivität innerhalb von 1 Tag nach der Plattierung.

In unserem Protokoll beschreiben wir die Dissoziation von CD1 Mäuseleberzellen, gefolgt von der Reinigung von Kupffer-Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und Auswahl durch Adhäsion. Die Charakterisierung von Kupffer-Zellen durch Durchflusszytometrie, zeigt, daß hohe Ausbeute und Reinheit von Kupffer-Zellen können unter Verwendung dieses Verfahrens erzielt werden.

Diese Kupffer Zelle Isolationsverfahren stellt einen wertvollen Kompromiss zwischen Komplexität und die Zellausbeute. Es wird jedoch berichtet, dass bestimmte Kupfferzelle Methoden können leichter zu leiten, wie das durch die beschriebenen ProtokollWu et al., Wo die Leber verdaut ex vivo 23. Allerdings ist die von Wu et al. führt zu einer begrenzten Anzahl von Zellen und geringere Zell Reinheit. Höhere Ausbeute und Reinheit erhalten werden, sondern erfordern teure und / oder hoch entwickelten Geräten und kann zeitaufwendig sein.

Das durch Smedsr d et al. 16 entwickelt ursprüngliche Protokoll verwendet einen vergleichbaren Protokoll auf Basis 2-Schritt-Perfusionsverfahren (HBSS + Kollagenaseverdau), gefolgt von Zentrifugation auf Percoll-Gradienten und die Auswahl des niedrigeren Percoll Kissen für weitere Reinigung durch Oberflächenhaftung. Durch Modifizieren der Zentrifugationsverfahren und Sammeln der oberen Percoll-Kissen, erhöhten wir die angereicherte Zellfraktion Kupffer von 5,25 x 10 6 bis 8,2 x 10 6 Zellen pro Gramm Leber. Diese Verbesserung könnte die Verwendung von EGTA während der frühen Perfusionsschritt um die Dissoziation von Leberzellen zu erleichtern zurückzuführen. Mine, die Verwendung von Durchflußzytometrie-Analyse erlaubt die zuverlässige quantitative Charakterisierung Kupfferzelle Reinheit und Phagozytenaktivität. Mit einer maximalen Ausbeute von 14 x 10 6 gereinigt nicht-parenchymalen Zellen pro Maus Leber. Die vorliegende Isolationsverfahren erreichen höhere Menge von Kupffer-Zellen pro Maus Leber zu dem, was in der Literatur 24 gemeldet. Diese Verbesserung kann durch die Verwendung von schwereren Maus (35-45 g) im Vergleich zu anderen Verfahren 24 erläutert. Neben der Erhöhung der Zellausbeute, die Verwendung von größeren Tieren erleichtert beträchtlich den Vorgang der Pfortader Kanülierung.

Hochdurchsatz-in-vitro-Tests können unter Verwendung dieser Primär phagocytic Modell durchgeführt werden, damit Nachahmung der in vivo toxikologischen Auswirkungen von Nanopartikeln. Das Gesamtverständnis der Nanotoxikologie können von diesen Modellen profitieren, so dass die Nanopartikel-Auswahl für die klinische Übersetzung effizienter. Darüber hinaus ist es in Übereinstimmung mitUmsetzung des Konzepts der 3 R (Reduzierung, Verfeinerung und Ersatz) für die Tier biomedizinischen Forschung.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthatal (pentobarbital sodium) Merial
CD1 mice Charles River   - Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. 
HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)   Life Technologies   14175-053 HBSS must be  Ca2+ free. 
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt  Sigma-Aldrich   E8145   EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. 
HEPES (1 M)  Life Technologies   15630-056  100 ml 
Collagenase type IV  Worthington  CSL-4  It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation 
 Low glucose DMEM  Sigma-Aldrich   D5523  500 ml 
RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax)  Life Technologies   12633-012  500 ml
Penicillin/Steptomycin  Life Technologies   15140-122 100 ml
Fetal Bovine Serum  First-Link   60-00-850  500 ml 
Trypan blue solution  Sigma-Aldrich  T8154  100 ml 
Coated silica particle solution (Percoll) GE Healtcare   17-0891-02  Percoll® is very stable and can be kept for several years 
1x Phosphate Buffered Saline   Life Technologies   10010-023 500 ml 
10x Phosphate Buffered Saline   Life Technologies   70011-036 500 ml
Dimethyl sulfoxide  Fisher  D/4120/PB08  500 ml 
LDH kit (CytoTox 96)  Promega  G1781  Keep protected from light 
DMEM phenol red free Life Technologies   31053-028  500 ml 
F4/80 antibody (Alexa 488) AbD Serotec MCA497A488 Do not dilute, used neat for flow cytometry
Fluorescent beads Sigma L2778 Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml
Name of the Material Company  Catalog number  Comments/Description 
Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing)   BD  367288
Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim)  Minisart  16534-K 
Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)  BD Biosciences, Falcon  35 2070 
Petri dish (90 x 15 mm)  Thermo Fisher Scientific   BSN 101VR20 
100 μm cell strainer   BD   352360
Peristaltic pump  Watson Marlow  SciQ 300   Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.
24-well plates Corning   3526
96-well plates  Corning   3595
Centrifuge  Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Serrefine forceps Hammacher GmbH  Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon  352052
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Elkay   000-MICR-150
Cell scraper BD Biosciences, Falcon 353086 Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.
Name of the Reagent Company  Catalog number  Comments/Description 
 EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution  HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.  
Collagenase Solution  DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. 
Kupffer Cell Isolation Medium  RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.  
Kupffer Cell Culture Medium  RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.  
SIP (solution of isotonic coated silica particles) Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline  with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP.
25% SIP solution  Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline  
50% SIP solution  Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline 
Lysis Buffer DMEM media with 0.9% Triton X-100
PBS/BSA Solution Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. 

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References

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Kupffer Zelle Isolierung für die Toxizität von Nanopartikeln Testing
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Bourgognon, M., Klippstein, R., Al-Jamal, K. T. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (102), e52989, doi:10.3791/52989 (2015).More

Bourgognon, M., Klippstein, R., Al-Jamal, K. T. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (102), e52989, doi:10.3791/52989 (2015).

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