انقباض القياسات على العضلات الحليمية معزولة للتحقيق في القلب Inotropy في الفئران

Summary

ترك الفئران العضلات الحليمية البطين يمكن استخدامها لتحقيق انقباض القلب في المختبر. توضح هذه المقالة بالتفصيل العزلة والبروتوكولات التجريبية لدراسة خصائص مقلص القلب.

Abstract

العضلات الحليمية المعزولة من قلوب الماوس الكبار يمكن استخدامها لدراسة انقباض القلب خلال مختلف الفسيولوجية / الحالات المرضية. يمكن تقييم الخصائص مقلص بمعزل عن التأثيرات الخارجية مثل الأوعية الدموية توترية أو وضع عصبي هرموني. وهو يصور منهج علمي بين القياسات خلية واحدة مع myocytes القلب المعزولة والدراسات المجراة مثل ضربات القلب. وبالتالي، فإن الاستعدادات العضلات الحليمية بمثابة نموذجا ممتازا لدراسة علم وظائف الأعضاء قلبية / الفيزيولوجيا المرضية، ويمكن استخدامها لإجراء تحقيقات مثل تعديل من قبل وكلاء الدوائية أو استكشاف النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. هنا، نحن تصف طريقة لعزل العضلات الحليمية الأمامي الأيسر الفئران للتحقيق انقباض القلب في الإعداد حمام الجهاز. على النقيض من إعداد الشريط العضلات المعزولة من الجدار البطيني، والعضلات الحليمية يمكن إعداد جملة وتفصيلا دون الإضرار TISSU العضلاتالبريد بشدة. يتكون الإعداد حمام الجهاز العديد من التجهيز الكهربائي غرف حمام الجهاز، بالغاز والتحكم في درجة حرارته. يتم إصلاح العضلات الحليمية معزولة في غرفة حمام جهاز وحفز كهربائيا. يتم تسجيل قوة نشل أثار باستخدام محول الضغط والمعلمات مثل نشل القوة السعة ونشل ويتم تحليل حركية. بروتوكولات تجريبية مختلفة يمكن القيام بها لتحقيق بالكالسيوم وانقباض تعتمد على التردد فضلا عن منحنيات الاستجابة للجرعة وكلاء مقلص مثل الكاتيكولامينات أو غيرها من المستحضرات الصيدلانية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن محاكاة ظروف مرضية مثل نقص التروية الحاد.

Introduction

التحقيق في البروتينات مثل القنوات الأيونية في اشارة دورها لانقباض القلب ضروري لاكتشاف pathomechanisms المختلفة ووضع استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج أمراض القلب مثل نقص التروية وفشل القلب.

ومن المعروف ظيفة مقلص العضلية الثدييات إلى أن منظم من قبل القنوات الأيونية مختلفة، النقل وغيرها من البروتينات. إمكانات العمل أثار تفعيل الجهد تعتمد sarcolemmal L من نوع كا ²⁺ قنوات الكالسيوم يؤدي إلى تدفق ²⁺ من الفضاء خارج الخلية، وبعد ذلك الى كا كا ²⁺ يسببها ²⁺ إطلاق سراح (CICR) ^{1، والذي} يؤدي الانكماش الخلوية ^2. كاليفورنيا ²⁺ -signaling يلعب دورا مركزيا في انقباض القلب والتكيف مع الإجهاد الفسيولوجية أو المرضية. الكاتيكولامينات تنشيط مستقبلات β الأدرينالية القلب، وبالتالي تحفيز محلقة أدينيليل (AC) الذي يجمع المخيم. يجري تفعيلها، من البروتينن كينيز (PKA) phosphorylates مختلفة داخل وغشاء البروتينات المرتبطة مثل L-نوع كا ²⁺ القنوات، فسفولامبان وryanodine المستقبلات مما يؤدي إلى تعديل من الكالسيوم ²⁺ العابرين والقلب انقباض ^1،3،4. تتحلل المخيم فسفودايستراز (PDE). تنشيط مستقبلات غس إلى جانب غيرها من β-adrenoceptors يؤدي أيضا إلى تراكم المخيم.

يتم تأسيس تقنية القياسات انقباض في عضلة البطين معزولة شرائط جيدا لأنواع الثدييات الكبيرة ^5-8. استنادا إلى إمكانية استهداف الجينات في الفئران فمن المهم وضع طرق لتحليل علم وظائف الأعضاء قلبية الفئران. ومع ذلك فإن البيانات المتوفرة حول الخصائص الفسيولوجية للالاستعدادات العضلات المعزولة في الفئران تختلف باختلاف ظروف تجريبية ^12/09.

يستخدم الأسلوب هو موضح لتحليل انقباض القلب من اليسار قبل العضلات الحليمية البطينparations في المختبر. يتم إجراء التحقيق في انقباض القلب في غياب تأثيرات تعديل انقباض القلب في الجسم الحي، مثل ضغط الدم، وتحفيز عصبي هرموني والاجهاد البدني أو التمثيل الغذائي. معدل الضرب من إعداد العضلات التعاقد يمكن تعريفه بدقة وتغيرت بشكل تعسفي. ويمكن تحليل نشل القوة في سياق مؤثرات معينة مثل تركيز الكالسيوم، والضرب التردد أو درجة الحرارة. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة يمكن استخدامها لتحقيق مختلف مكونات مسار الإشارات ومقارنة أداء القلب من نماذج الماوس المعدلة وراثيا عن طريق التحكم في ظروف تجريبية المذكورة أعلاه.

Protocol

ويبين الخطوات الأساسية لإجراء العزل في الشكل 1 ووصف جميع الخطوات بالتفصيل في البروتوكول التالي: ملاحظة. يتم تنفيذ عزل العضلات الحليمية و التركيب في الجهاز غرفة حمام وحيازة والتحليل في فترة زمنية متتالية والإلزامي.

وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للتشريع الألماني على حماية الحيوانات وتمت الموافقة من قبل مجلس مراجعة أخلاقيات جامعة هايدلبرغ.

1. إعداد الأجهزة

1. لانقباض القياسات تستخدم multichambered الإعداد حمام الجهاز. وتظهر عناصر من خارج الحي انقباض الإعداد حمام الجهاز في الشكل 2.
   ملاحظة: لتقليل مقدار الوقت بين إعداد العضلات الحليمية وبداية من بروتوكول التجريبية، وإعداد المعدات وإعداد مخازن قبل جمع tissue.This تجريبي يقوم بتقديموفاق أكبر قدر من الوقت الذي لا تزال قابلة للحياة الأنسجة لإجراء التجارب.
2. بدء أجهزة الحاسوب والحصول على البيانات. بدوره على حرارة حمام الجهاز (مسبقا إلى 32 درجة مئوية) والسماح لوحدات إلى درجة الحرارة مسبقا.
3. إعداد اقتناء المعدات. بدء تسجيل البيانات على النحو المذكور في دليل البرامج.
4. فحص وإجراء معايرة (إذا لزم الأمر) على كل قناة والصفر كل القنوات لتوحيد إشارة كهربائية الموردة من محول القوة المعنية (المرتبطة بهذا قناة) لقوة 2-ز المقدمة من وزن شهادة.
5. بدوره على امدادات الغاز (95٪ O _2/5٪ CO ₂₎ لغرف حمام الجهاز. الغاز المتواصل لجميع الدوائر خلال قياسات بروتوكول بأكملها.

2. إعداد مخازن والحلول الفسيولوجية

1. يعد حل العازلة كريبس-هنسلايت لتحقيق تركيزات النهائي من 119 ملي كلوريد الصوديوم. 25 ملي NaHCO _3؛ 4.6 ملي بوكل؛ الجلوكوز 11MM؛ 1 ملم نا فyruvate. 1.5 ملي CaCl _2؛ 1.64 ملي MgSO _4؛ 1.18 ملي KH ₂ PO ₄ وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (انظر الجدول 1 حل الفسيولوجي).
2. إعداد منفصل حل العازلة كريبس-هنسلايت لاستخدامها أثناء العزلة كما هو موضح في الخطوة 2.1 مع إضافية 30MM 2،3 Butanedione monoxime (بي دي إم) و 50 IE الهيبارين / مل. حل بارد إلى 4 ° C (انظر الحل إعداد الجدول 1). لمحاكاة نقص التروية، وإعداد نقص التروية-الحل كما هو موضح في الجدول 1.
3. لبروتوكول كا ^{2 + -} انقباض المعالين، إضافة الكالسيوم ²⁺ إلى حل العازلة كريبس-هنسلايت لطلب تركيز النهائي.
   ملاحظة: إعداد هذه الحلول مباشرة قبل استخدامه، وغاس مع كربوجين لتجنب ترسيب Calciumcarbonate. حل Prewarm إلى 32 ° C قبل استخدام.

3. إعداد بالغاز أنبوب وتشريح طبق استخدمت خلال حليمي الختان الداخلي

1. توصيل الغاز لينةالغناء أنبوب (الخارجية قطرها 2-4 مم) لاتصال الغاز (100٪ أكسجين، كربوجين بدلا من ذلك) مع خبير يعمل.
2. إنشاء حلقة مغلقة من الأنبوب بالغاز المناسب داخل طبق تشريح. ثقب الأنبوب بالغاز عدة مرات الذي أكد على السطح المستمر. هذا الأنبوب بالغاز يمكن استخدامها عدة مرات.
3. إعداد طبق تشريح مع المطاط الصناعي السيليكون في الجزء السفلي (0.5 سم سميكة)، بحيث دبابيس يمكن أن يكون عالقا فيه. هذا الطبق يمكن استخدام عدة مرات.

4. عزل اليسار الأمامي حليمي العضلات من الفئران

ملاحظة: قبل البدء في عزل العضلات الحليمية، والتحقق من أن خطوط الغاز واضحة من انسداد.

1. إعداد بالأعضاء الإعداد حمام على النحو المذكور في قسم البروتوكول 1-3 قبل البدء في إعداد العضلات الحليمية. إعداد جميع الحلول في يوم من التجربة.
2. التضحية الماوس (حوالي 8-12 أسابيع من العمر) من خلال عنق الرحم التفكك accordiنانوغرام للمبادئ التوجيهية المؤسسية الخبراء العامل و.
3. إصلاح الحيوان في موقف الظهرية عن طريق تحديد الأرجل الأمامية وهند الكفوف على لوحة التشريح، وفتح جانبي القفص الصدري على كلا الجانبين من خلال قطع الأضلاع مع مقص العظام الحادة، ثم قص الحجاب الحاجز مع خفض مستعرضة. إزالة التامور. الآن القلب والشريان الأورطي يمكن الوصول إليها.
4. إصلاح القلب مع ملقط حادة على الجذع الأوعية الدموية بالقرب من القلب وفصل القلب بسرعة مع مقص من الرئتين والأنسجة المحيطة بها.
5. نقل القلب النابض لطبق بيتري مملوءة بمحلول إعداد تبريد بالغاز مع الأكسجين (الخطوة 2.2). السماح للالقلب ينبض ويحفز انقباضات القلب بهدوء عن طريق لمس قمة القلب مع ملقط.
6. في أقرب وقت القلب exsanguinous تماما، نقلها إلى الطبق تشريح مملوءة بمحلول إعداد تبريد (الخطوة 2.2) وابيدوا _O 2. من هذه الخطوة على استخدام وstereomicroscope.
7. إصلاح هيئة التعليم العاليRT مع دبوس صغير من خلال البطين الأيمن بحيث ينظر إلى القلب من الظهرية (يقع البطين الأيمن على الجانب الأيمن من وجهة نظر المشغل).
8. باستخدام مقص المجهرية فصل كل من الأذينين على مستوى الأذينية البطينية، وقطع ربط الأنسجة من البطينين وتجاهل. إجراء قطع من خلال الجدار البطيني من على المستوى صمام AV إلى قمة القلب تجنب أي ضغط الميكانيكي.
9. فتح البطين الأيسر وإصلاح من جانب جدار الحرة مع ملقط، وبالتالي وجود نظرة على كل من اليسار العضلات الحليمية البطين.
10. خفض قليلا بعيدا الجانبية نسيج البطين على كلا الجانبين من العضلات الحليمية الأمامية اليسرى الحفاظ على جزء من الشراع صمامي على إعداد العضلات الحليمية وتجنب لمس أو شد العضلات الحليمية قدر الإمكان. تشريح الأنسجة المتبقية جدار البطين من العضلات الحليمية.
11. نعلق خيوط الحرير (7/0، متري 0.5) على كلا الجانبين من الإعدادية العضلات الحليمية aration، واحدة على الشراع صمامي واحد على جزء العضلي. إصلاح إعداد في غرفة حمام جهاز مملوءة بمحلول حمام الجهاز وابيدوا كربوجين، كما اقترح درجة الحرارة 32 ° C.

5. موازنة وتحفيز العضلات الحليمية

1. تحفيز إعداد العضلات الحليمية مع نبضات مستطيلة (مدة 2 مللي ثانية والحالية من 100 مللي أمبير) في وتيرة التحفيز 1 هرتز مباشرة بعد تثبيت الجهاز في الحمام.
2. ضمان التغيير المتكرر للحمام حل الجهاز، إما عن طريق التغيير المستمر أو عن طريق تغيير يدوي متكررة (كل 5 دقائق) وفقا لإعداد من نوع حمام الجهاز المستخدم.
3. زيادة تدريجية في ادعاء حتى نشل القوة القصوى في التوصل إليها. يتم التوصل إلى القوة القصوى نشل عندما لم يتبع هذه الزيادة من ادعاء من قبل زيادة أخرى في القوة نشل.
4. بعد 45-60 دقيقة من موازنة، بدء بروتوكول تجريبي.

"jove_title"> 6. اقترح التجريبية بروتوكولات لانقباض القياسات

ملاحظة: بروتوكول تجريبي المبينة أدناه وتشمل المناورات القياسية لتوصيف انقباض القلب في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. في قسم التمثيل وصفنا هذه البروتوكولات في التفاصيل تبين أيضا نتائج ممثل (انظر أيضا الجدول 2).

1. تسجيل وتحليل البروتوكولات التجريبية
   1. للتسجيل، واستخدام البرمجيات المناسبة لقرار الزمني الكافي (نسبة الاستحواذ ≥ 1KHZ).
   2. تحليل المعلمات بما في ذلك القوة نشل السعة (الارتفاع)، والوقت لذروتها التوتر (TTP) ونصف أقصى وقت الاسترخاء (R ₅₀ / TFall، على التوالي) كما ذكر في البرنامج (كمثال الرسم البياني 5.5 من ADInstruments، انظر الشكل 4).

Representative Results

يتم ضبطها بروتوكول لهذه المخطوطة لقياس انقباض معزولة الفئران الاستعدادات العضلات الحليمية إلى الظروف المثلى لتحقيق النتائج التجريبية استنساخه في ظل الظروف الفسيولوجية. لتحديد الظروف التجريبية المثلى أجرينا التجارب الرائدة متفاوتة درجة حرارة حمام الجهاز وتركيز الكالسيوم خارج الخلية (انظر أيضا ^12). تم تنفيذ بروتوكول الموصوفة هنا مع تركيز الكالسيوم خارج الخلية من 1.5 مم ودرجة حرارة 32 ° C.

خصائص انقباض القاعدية

لتوصيف خصائص انقباض القاعدية، المعلمات لقوة نشل السعة، ومعدل نشل، والوقت ليصل إلى ذروته (كما هو موضح الوقت اللازم للوصول إلى قوة انقباض القصوى بدءا من القاعدية 5٪) والاسترخاء 50 مرة (نصف أقصى وقت الاسترخاء؛ الذي يعرف بأنه الزمن اللازم ل وصول إلى نصف القوة الاسترخاء) وتستخدم في هذا البروتوكول. تتبع التمثيلي TWالحكة ويتضح من تحليل هذه المعلمات في الشكل 3A-B.

تعتمد على الكالسيوم انقباض

تركيز الكالسيوم خارج الخلية يحدد بشكل حاسم القلب الإثارة، تقلص اقتران ومتفاوتة هذه المعلمة، وحساسية الكالسيوم من تقلص في جهاز العضلية يمكن تقييمها. كما هو مبين في الشكل 3C زيادة موارد النتائج تركيز الكالسيوم خارج الخلية في العابرين الكالسيوم غيرت وبعد ذلك في توليد قوة نشل تغير. والكالسيوم تركيز المحلول خارج الخلية يزداد خطوة بخطوة (أي بين 1.5 إلى 7MM). من خلال تطبيق هذا البروتوكول، والكالسيوم فيما يتعلق انقباض تعتمد على الكالسيوم من جهاز مقلص يمكن تقييمها. في الإعداد حمام الجهاز المستخدمة في هذه المخطوطة، تم إجراء تغيير في تركيز الكالسيوم خارج الخلية عن طريق تغيير solut حمام الجهازأيون الرائدة يدويا إلى انقطاع قصير من سرعة وبعد ذلك إلى postrest التقوية الاصطناعية (انظر التقوية قوة بعد فترة غير سرعة).

التقوية التنفيذ بعد فترة غير سرعة (PRP)

في نهاية الكالسيوم دورة الانكماش المحتبسة في sarcoplasmatic الشبكة (SR) في الغالب عن طريق مضخة الكالسيوم التي تعتمد على ATP (SERCA،-ساركو الباطنة شبكية الكالسيوم أتباز)، وبالتالي خفض تركيز الكالسيوم عصاري خلوي أثناء انبساط. إذا تم توسيع الفاصل الزمني بين التقلصات، ويمكن ضخ مزيد من الكالسيوم مرة أخرى في SR ويمكن أن تنطلق في وقت لاحق مزيد من الكالسيوم أثناء الإثارة القادمة. بروتوكول postrest-التقوية (PRP) يصف التعديلات من السعة قوة نشل بعد التحفيز السابق مع فترة راحة لمدة محددة. في الإنسان، الفئران وكذلك في الأنسجة القلبية الفئران، تبين لزيادة القوة نشل ^{10،12-14،16} ( 13،14،16،17 الإنسان والفئران. يستخدم هذا البروتوكول لتقييم وظيفة تراكم الكالسيوم الانبساطي في مخازن داخل الخلايا ^4،15.

التي تعتمد على تردد انقباض جنباتها

يصف علاقة قوة التردد العلاقة بين الضرب معدل وقوة نشل مقلص (بوديتش المفعول) ^18. العلاقة تردد force- يختلف بشكل كبير بين أنواع الثدييات والظروف التجريبية ^19. في الفئران، تبين وجود علاقة محددة بين معدل الضرب وقوة الانكماش. في 32 ° C، وقد أظهرت لFFR السلبي الأولي بين معدلات التحفيز من 0،1-1 هرتز، في حين تم عرض FFR أن تكون إيجابية في حدود 1-4 هرتز من التحفيز ^9-12 (الشكل 3E).

في عدم myocardium وجود علاقة عكسية بين معدل الضرب ويوصف انقباض ^20،21. في هذه المخطوطة، يتم تقليل معيار سرعة التردد (1 هرتز) إلى 0.1 هرتز والبدء من هناك، ورفعت سرعة التردد تدريجيا إلى 5 هرتز (0.2، 0.5، 1، 2، 3، 4، 5 هرتز).

التحفيز الأدرينالية بيتا

الكاتيكولامينات مثل الأدرينالين والنورادرينالين هي الهرمونات التي تم إصدارها خلال (patho-) ظروف الإجهاد الفسيولوجية تحوير قوة مقلص عضلة القلب عن طريق تفعيل β-adrenoceptors. تطبيق علاجي المنشأ الكاتيكولامينات يلعب دورا بارزا في العلاج السريري للمرضى الذين يعانون من قصور القلب الحاد لتعزيز inotropy القلب مؤقتا. ويمكن أيضا أن ينظر إلى هذا التأثير والتحقيق في الدراسات في المختبر. كما ناهض من β-adrenoceptors، إيزوبرينالين يزيد قوة نشل مقلص. في الجسم الحي، وزيادة في الضرب تردد يحدث أيضا (تأثير إيجابي مؤثر في التقلص العضلي)، والتيبالإضافة إلى ذلك ينظم استجابة مقلص (بوديتش تأثير، انظر أيضا وصف بروتوكول جنباتها أعلاه). باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، وتأثير مؤثر في التقلص العضلي من إيزوبرينالين يمكن التحقيق بمعدل الضرب الثابتة دون أن تأثير ميقاتية (الشكل 3F). ويمكن أيضا أن يتحقق تحفيز β-adrenoceptors بواسطة هرمونات أخرى مثل الهستامين. في أنسجة البطين الفئران، وتطبيق نتائج الهستامين في استجابة ثنائية الطور الذي يحتوي على تأثير إيجابي مؤثر في التقلص العضلي الأولي، ولكن مع انخفاض عابر في القوة نشل كما هو مبين في الشكل الجيل الثالث 3G. لهذا السبب يبدو تفسير البيانات المقاسة من خلال تطبيق الهستامين أن يكون أمرا صعبا؛ خصوصا الأساسي مستقبلات التنشيط في الفئران لم تحل تماما.

شروط الدماغية

ويعرف نقص التروية القلبية الحاد الحصر حاسم من تدفق الدم مما يؤدي إلى قلة المعروض من أنسجة القلب مع الأكسجين والمواد الغذائية مما يؤدي إلى فقدان انقباض، وتطوير انكماش الدماغية وموت الخلايا. لمحاكاة نقص التروية في المختبر، تتعرض العضلات لمدة 30 دقيقة إلى الجلوكوز، وخالية من البيروفات حل خارج الخلية انفجر مع 95٪ N _05/02٪ CO _2. مع هذا النهج يجب أن يتسبب في نضوب ATP في العضلية. في غضون دقائق قليلة بعد بدء نقص التروية، والمحاكاة، وانخفاض القوة نشل يحدث مع مظهر انكماش الدماغية تصويرها على شكل زيادة تلقائية في التوتر التحميل المسبق (الشكل 3H).

الجدول 1: مكونات وتركيزات المحاليل المستخدمة.

/>

الجدول 2: قائمة البروتوكولات التجريبية المقترحة لتحقيق انقباض القلب في معزولة الاستعدادات العضلات الحليمية.

الشكل 1. الخطوات الرئيسية لإعداد العضلات الحليمية. (A) تشريح كل من الأذينين. (B) عرض على العضلات الحليمية الأمامية البطين الأيسر. (C) تشريح العضلات الحليمية من جدار البطين. (D) مرفق اثنين من خيوط الحرير قبل التثبيت في غرفة حمام الجهاز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6fig2.jpg "/>
الشكل 2. الإعداد حمام الجهاز. (A) إعداد تخطيطي لإعداد حمام الجهاز. سترة المياه غرف حمام الجهاز مجهزة فريتس الزجاج تهوية توفر التحكم في درجة الحرارة مستقرة. لتوليد نبضات مربع الموجة هي التي تعلق الأقطاب ميدانية لدعم الأنسجة. A محول القوة الحواس تقلص العضلات وبالتالي تضخيم إشارة ولدت. يتم تصفية هذه الإشارات ونقلها إلى جهاز الكمبيوتر عن طريق محول A / D. والإشارة ثم الرقمية، ويمكن حفظها للتحليلات لاحقة. (B) صورة لإعداد العضلات الحليمية واحد ثابت في غرفة حمام الجهاز من الإعداد حمام الجهاز (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خريج "/>
الشكل 3. ممثل النتائج من القياسات انقباض العضلات الحليمية الأمامي الأيسر الفئران. (A) تحليل الممثل للقوة نشل السعة، وقت الذروة في التوتر (TTP) ونصف أقصى وقت الاسترخاء (R ₅₀₎ من نشل واحد. التسجيلات التمثيلية للتشنجات حفز من الفئران الاستعدادات العضلات الحليمية في إطار التحفيز القاعدية مع معدل الضرب من 1 هرتز (B)، خلال زيادة تركيزات الكالسيوم خارج الخلية (C)، خلال فترات محددة الراحة (التقوية آخر الراحة، PRP) (D)، أو مختلفة معدلات التحفيز (علاقة قوة التردد، FFR) (E) وبعد تطبيق زيادة تركيزات Isoprenaline- (F) أو الهستامين التطبيق (G). تسجيل التمثيلي للتشنجات حفز والتحميل المسبق خلال نقص التروية التحفيز (H).الصورة: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. تحليل المعلمات مقلص. لتوصيف وظيفة مقلص، ويتم تحليل المعلمات بما في ذلك القوة نشل السعة (الارتفاع)، والوقت لذروتها التوتر (TTP) ونصف القصوى الوقت الاسترخاء (R ₅₀ / TFall، على التوالي) في هذا البروتوكول باستخدام برنامج مخطط البرنامج 5.5 (ADInstruments). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه المخطوطة وصفنا أسلوبا للتحقيق في انقباض العضلات الحليمية الفئران في المختبر والتي يمكن استخدامها للإجابة على عدة أسئلة علمية تتعلق فسيولوجيا القلب وأمراض في الفئران وكذلك لدعم تحليل خطوط المعدلة وراثيا واكتشاف نهج الأدوية الجديدة لعلاج الخلل في القلب. نحن لتوضيح استخدام هذا الأسلوب لتقييم الخصائص الفسيولوجية، المرضية والدوائية من انقباض عضلة القلب (انظر الشكل 3). تطبيقات إضافية لم يتضح هنا تشمل تقييم مسارات الخلايا باستخدام وكلاء الدوائية المختلفة (انظر أيضا ^12).

أمراض القلب مثل أمراض نقص تروية القلب وفشل القلب عرض مشكلة السريرية البارزة وتظل السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في جميع أنحاء العالم ^22. بالنسبة لكثير من البروتينات التي أعرب عنها في القلب، ودورها لانقباض القلب هو لا يزال خارجل مفهومة أو لم تدرس حتى الآن. يوضح قياس انقباض في العضلات الحليمية معزولة نهجا مفيدا وصالحا لدراسة انقباض القلب في المختبر في نماذج الماوس.

على الرغم من أن هذه الطريقة مجدية تقنيا ويظهر استنساخ جيدة، وهناك العديد من الخطوات الهامة اللازمة لضمان نجاحها: أولا، بعد عزل القلب، وضمان حل الحرة الدم أثناء إجراء اعدادها لتكون قادرة على العمل بشكل صحيح (التصور). خطوة حاسمة أخرى هي أن إعداد الأنسجة يتم تنفيذ بعناية لضمان الجدوى من خلال تجنب أي لمس أو شد العضلات الحليمية. كما هو موضح في القسم طريقة محاولة للحفاظ على الشراع صمامي متصلا العضلات الحليمية لضمان مرفق خالية من المتاعب من خيط الحرير. بعد تثبيت للإعداد في غرفة حمام الجهاز، قم بتغيير حل حمام الجهاز عدة مرات خلال الدقائق الأولى لطرد BDM. Increaسه ادعاء من إعداد قليلا وتدريجيا حتى يحدث لا مزيد من زيادة القوة نشل. هناك بعض المعايير الاستبعاد لتقييم البروتوكولات واحدة مثل عدم اتساق نبضات القلب يدق وزيادة تلقائية للادعاء كعلامة للظروف الدماغية. العديد من البروتوكولات التجريبية مثل التقوية postrest وعلاقة قوة التردد لا يمكن أن يؤديها مع عينة إعداد نفسها، في حين ينبغي أن تستخدم عينة إعداد جديدة لتحليل الآثار بوساطة المخدرات على انقباض. هو الأمثل لإعداد بروتوكول لعزل العضلات الحليمية الأمامية اليسرى. تكييف البروتوكول، وكذلك العضلات الخلفية ويمكن استخدام هذه الطريقة في قياس انقباض.

هذه الطريقة في قياس العضلات الحليمية معزولة يوفر معلومات متنوعة حول الكالسيوم، و للحرارة التي تعتمد على تردد انقباض فضلا عن استجابة مقلص بعد تطبيق كلاء الدوائية أو سيمulation من الحالات المرضية. ومع ذلك، فإن تفسير واستقراء هذه النتائج يجب أن يتم التعامل معها بحذر العلمية. الطريقة الموضحة هو نموذج في المختبر من عضلة القلب، قطع من بيئتها الطبيعية وتعصيب العصبي. ولذلك، فإن الظروف التجريبية ليست الفسيولوجية والنتائج الواردة في هذا البروتوكول لا يمكن نقلها دون تفسير معمق للوضع في الجسم الحي. على سبيل المثال، الطريقة لا تأخذ في الاعتبار التغيرات في ضغط الدم والهرمونات أو التحكم العصبي خارجي. إمدادات الأوكسجين والأيض المكملات الغذائية لإعداد في الحمام الجهاز محدودة بسبب نشرها. ومن شأن إمدادات غير كافية من الأوكسجين والأيض المكملات الغذائية يؤدي إلى ظروف نقص تروية والنتائج التجريبية غير صالحة في وقت لاحق. لتجنب ذلك، يجب أن تكون الشروط التجريبية الأمثل، خاصة فيما يتعلق الأوكسجين، وتركيز الكالسيوم ودرجة الحرارة من الحل حمام الجهاز.مع الظروف التجريبية للبروتوكول وصفها هنا، يمكن أن تتاح نتائج صحيحة.

في هذه المخطوطة يوصف طريقة لمحاكاة الظروف مثل نقص التروية. بالإضافة إلى ذلك لمحاكاة نقص الأكسجة، تم استنفاد جميع الملاحق حيوية من الحل حمام جهاز لمحاكاة الدولة الدماغية في الجسم الحي جيدة قدر الإمكان. وعلى النقيض من نقص الأكسجين، وتبين أن استنزاف وقت واحد من الأكسجين وإمدادات الطاقة يؤدي إلى تغيرات في العابرين الكالسيوم تضاهي التعديلات ينظر في الجسم الحي ^23.

الإجراء الموضح لعزل الماوس العضلات الحليمية يمكن تكييفها مع الأنواع الأخرى، على سبيل المثال، الفئران. لكن الظروف المثلى للجهاز الإعداد الحمام يمكن أن تختلف بين نماذج حيوانية مختلفة ويمكن تكييفها. المعلمات التي قد تحتاج إلى التكيف هي درجة الحرارة وتركيز الكالسيوم من الحل الفسيولوجية.

في summarذ، يوفر هذا الأسلوب انقباض طريقة فعالة جدا لتقييم فسيولوجيا القلب والفيزيولوجيا المرضية والصيدلة. عندما تستخدم بشكل صحيح، لأنها توفر القدرة على دراسة انقباض القلب في بيئة معزولة ولكن تسيطر عليها بشكل جيد.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	Hazard statement H 302, solve in DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Isoprenaline hydrochloride	Sigma-Aldrich	I5627	Hazard statement H 315-H319-H335
Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml	ratiopharm	PZN 3874685
Histamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	H7250	Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335