Summary
マウスの左心室の乳頭筋は 、インビトロで心筋収縮性を調べるために使用することができます。この記事では詳細に心臓収縮特性を研究するためのアイソレーションと実験プロトコルを説明しています。
Abstract
成体マウスの心臓から単離された乳頭筋は異なる生理学的/病理学的状態の間の心収縮性を研究するために使用することができます。収縮特性は、独立して、血管の緊張または神経液性状態などの外部の影響を評価することができます。これは、単離された心筋細胞を持つ単一セル測定の間及び心エコー検査などのインビボ研究で科学的なアプローチを示しています。従って、乳頭筋調製物は、心臓の生理機能/病態生理学を研究するための優れたモデルとして機能し、薬剤による調節またはトランスジェニック動物モデルの探査などの調査のために使用することができます。ここでは、器官槽の設定における心収縮性を調査するために、マウスの左前方の乳頭筋を単離する方法について説明します。心室壁から単離された筋肉片の調製とは対照的に、乳頭筋は、筋TISSUに損傷を与えることなく、 全体として調製することができます。E深刻。器官槽の設定は、複数の温度制御され、毒ガスと電極を装備した器官槽室で構成されています。孤立した乳頭筋は、器官槽室に固定され、電気的に刺激されます。誘発単収縮力は、圧力変換器と、このような力の大きさをけいれんおよび動態を分析する単収縮のようなパラメータを使用して記録されています。異なる実験プロトコルは、カルシウムおよび周波数依存収縮ならびにカテコールアミンや他の医薬品などの収縮剤の用量反応曲線を調査するために行うことができます。さらに、急性虚血のような病理学的状態をシミュレートすることができます。
Introduction
心臓の収縮のために自分の役割を参照するイオンチャネルのようなタンパク質の調査は異なる発症機序を発見し、そのような虚血および心不全などの心臓疾患のための新しい治療戦略を確立することが不可欠です。
哺乳動物の心筋細胞の収縮機能は、種々のイオンチャネル、輸送体および他のタンパク質によって調節することが知られています。活動電位は、Ca 2+チャネルは、細胞外空間からのCa 2+流入につながる電圧依存筋細胞膜のL型の活性化を誘発し、その後のCa 2+の細胞収縮2をトリガのCa 2+放出（CICR）1を 、誘発しました。生理学的または病理学的ストレスに対する心臓の収縮と適応に中心的な役割を果たしている-signaling の Ca 2+。カテコールアミンは、このようにキャンプを合成するアデニル酸シクラーゼ（AC）を刺激する、心臓βアドレナリン受容体を活性化します。活性化され、protein個のCa 2+トランジェントと心収縮の1,3,4の変更の結果、L型Ca 2+チャネル 、ホスホランバンとリアノジン受容体のような異なる細胞内および細胞膜結合タンパク質をリン酸化する（PKA）のキナーゼ。 cAMPはホスホジエステラーゼ（PDE）によって分解されます。 βアドレナリン受容体以外のGs共役受容体の活性化はまた、cAMPの蓄積をもたらします。
孤立した心室筋ストリップで収縮測定の技術が十分に大きい哺乳動物種5-8のために確立されています。マウスにおいて、遺伝子ターゲティングの可能性に基づいて、マウス心臓の生理機能を分析するための方法を確立することが重要です。しかし、マウスでは孤立した筋肉製剤の生理学的特性に関する既存のデータは、実験条件9-12によって異なります。
記載された方法は、左心室の乳頭筋の事前の心収縮性を分析するために使用されin vitroで parations。心収縮の調査は、血圧、神経液刺激および物理的または代謝的ストレスのようなin vivoでの心臓収縮を、修正の影響の非存在下で行われます。収縮筋調製物の叩解速度が厳密に定義され、任意に変更することができます。単収縮力は周波数または温度を破って、そのようなカルシウム濃度のような特定の刺激との関連で分析することができます。また、この方法は、異なるシグナル伝達経路の成分を調査すると、上記の実験条件を制御することにより、遺伝的に改変されたマウスモデルの心臓の性能を比較するために使用することができます。
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Protocol
注：単離手順の基本的なステップは、図1に示されているすべてのステップは、以下のプロトコルに詳細に記載されています。乳頭筋の分離、器官槽チャンバ内に取り付け、取得および分析は、連続し、強制タイムスケールで行われます。
全ての動物実験は、動物の保護に関するドイツの法律に従って行われ、ハイデルベルク大学の倫理審査委員会によって承認されました。
計装の調製
- 収縮の測定ではmultichambered器官槽の設定を使用します。 エキソビボ収縮器官浴のセットアップの構成要素は、 図2に示されています。
注：乳頭筋の準備と実験プロトコルの開始との間の時間、セットアップ機器を最小限に抑え、実験tissue.Thisを集めるの提供しにバッファを前に準備するために組織は、実験を行うために生存し続ける時間の最大量をエス。 - コンピュータとデータ収集機器を起動します。臓器風呂熱（32°Cまでのプリセット）をオンにし、設定温度にユニットを可能にします。
- 収集装置を準備します。ソフトウェアのマニュアルに記載されたように、データの記録を開始。
- チェックして、各チャンネルに（必要な場合）、キャリブレーションを実施し、認定重量により供給された2-Gの力に（そのチャネルに関連付けられている）は、それぞれの力変換器から供給される電気信号を標準化するために、すべてのチャネルをゼロに。
- 器官槽室へのガス供給（95％O 2/5％CO 2）をオンにします。連続プロトコル全体の測定中に全てのチャンバをガス。
緩衝液および生理的溶液の調製
- 119 mMの塩化ナトリウムの最終濃度を達成するクレブス - ヘンゼライト緩衝液を調製します。 25mMの炭酸水素ナトリウム; 4.6のKCl; 11mmのグルコース; 1 mMののNa-Pyruvate; 1.5 mMのCaCl 2を、 1.64 mMのは、4硫酸マグネシウム; 1.18 mMのKH 2 PO 4、（ 表1生理溶液を参照）pHを7.4に調整します。
- 追加の30mMの2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）と50 IEヘパリン/ mlのステップ2.1で説明したように、分離中に使用する独立したクレブス - ヘンゼライト緩衝液を準備します。 4℃（表1調製液を参照）クールソリューション。表1に記載したように、虚血のシミュレーションでは、虚血溶液を調製。
- Ca 2+のプロトコルの場合-依存収縮、要求された最終濃度にクレブス-ヘンゼライト緩衝液にの Ca 2+ を追加します。
注：直接、その使用前に、これらの溶液を調製し、炭酸カルシウムの沈殿を避けるために、カルボゲンでGASS。使用する前に、32℃に予熱するソリューションを提供します。
乳頭切除手順の間に使用されるガス発生チューブと解剖皿の調製
- ソフトガスを接続します専門家の作業とガス接続（あるいは100％の酸素、カルボゲン）にチューブ（外径2〜4ミリメートル）を歌います。
- 解剖皿の内側継手ガス発生管の閉じたリングを作成します。ガス発生管に連続発泡が保証されている数回穿刺。このガス放出管は、複数回使用することができます。
- ピンがそれに貼り付けることができるように、底部（0.5センチメートル厚）のシリコンエラストマーと解剖皿を準備します。この皿を数回使用することができます。
マウスの左前方乳頭筋の4.絶縁
注：乳頭筋の分離を開始する前に、ガスラインが閉塞の明確であることを確認してください。
- 乳頭筋の準備を開始する前に、プロトコルセクション1-3で述べたように、臓器浴の設定を準備します。実験の日にすべてのソリューションを準備します。
- 頸椎脱臼のaccordiによって（約8〜12週齢）のマウスを生け贄に捧げます専門家の作業と施設のガイドラインにNG。
- 前足を固定して仰臥位で動物を修正し、解剖ボードに足を後肢、鋭い骨はさみで肋骨を切断することにより、両側の胸部の横を開いて、横方向のカットとダイアフラムを切りました。心膜を削除します。今心臓と大動脈をアクセス可能です。
- 心臓に近い血管体幹の鈍ピンセットで心臓を修正して、肺と周囲の組織からハサミですぐに心を分離。
- 酸素（ステップ2.2）にガスを供給した冷却調製液で満たされたペトリ皿に拍動している心臓を転送します。ハートビートとピンセットで心臓頂点に触れる介して、そっと心の収縮を刺激することを許可します。
- すぐに心臓が完全にexsanguinousで、冷却された調製液（ステップ2.2）を充填し、O 2ガスを供給解剖皿に移します。使用上のこのステップ実体顕微鏡から。
- ょんを修正心が背側から見られるように右心室を通って小さなピンとRT（右心室は、オペレータのビューから右側に位置しています）。
- 顕微はさみを使用すると、房室レベルで両方の心房を分離心室から組織を接続切断して捨てます。任意の機械的な圧力を避ける心尖にAV-バルブレベルから心室壁を通してカットを実行します。
- 心室を開き、鉗子で左側の自由壁を固定し、このように両方の左心室乳頭筋を見てみました。
- 少し乳頭筋の準備の弁膜帆の一部を保存左前乳頭筋の両側の心室組織の横を離れてカットし、触れないように注意してくださいまたは、できるだけ多くの乳頭筋をストレッチ。乳頭筋からの残りの心室壁組織を解剖。
- 乳頭筋の準備の両側に取り付け絹糸（7/0、メートル法0.5）aration、弁膜帆上の1つの筋肉の部分に1つ。温度32°Cが提案されているように、臓器浴溶液を充填し、カルボゲンでガスを供給した器官槽室で準備を修正。
乳頭筋の5平衡と刺激
- 直ちに臓器浴中で固定した後、1ヘルツの刺激周波数の矩形パルス（2ミリ秒の持続時間および100 mAの電流）と乳頭筋調製物を刺激します。
- 使用オーガンバスタイプの設定に応じて連続的に変化したり、頻繁に手動で変更（5分ごと）のいずれかによって、臓器浴溶液の頻繁な変更を確認してください。
- 徐々に達しにおける最大単収縮力まで、プレテンションを上げます。プリテンションの増加は単収縮力のさらなる増強が続いていないときに最大単収縮力に達します。
- 平衡の45〜60分後、実験プロトコルを開始します。
注：以下のとおり実験プロトコルは、生理学的および病態生理学的条件の下で心臓の収縮を特徴づけるために、標準的な操縦を含みます。代表的なセクションでは、詳細には、これらのプロトコルを記述し、また（表2参照）代表的な結果を示します。
- 実験プロトコルの記録と分析
- 記録のために、十分な時間分解能（取得率≥1kHzの）で、適切なソフトウェアを使用しています。
- 単収縮力の大きさ（高さ）、ソフトウェアプログラムで述べたようにテンション（TTP）と最大値の半分緩和時間（それぞれ、R 50 / TFallを）ピークまでの時間（ 例として図4を参照してください 、ADInstrumentsの5.5チャート）などのパラメータを分析します。
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Representative Results
単離されたマウス乳頭筋調製物の収縮の測定のために、この原稿のプロトコルは、生理学的条件下で再現性のある実験の結果を達成するために最適な条件に調整されます。最適な実験条件を定義するために、我々は、器官浴温度および細胞外カルシウム濃度（12も参照）に変化するパイロット実験を行いました。ここで説明するプロトコルは、1.5mMの細胞外カルシウム濃度及び32℃の温度で行いました。
基礎収縮特性
時間をピークに、速度をけいれん、筋力振幅のための基礎収縮特性、パラメータを特徴付けるために、リラクゼーション50時間（半最大緩和時間（5％の基底から始まる最大収縮力に達するのに必要な時間として定義される）に必要な時間として定義されます）緩和力の半分に達し、このプロトコルで使用されています。 TWの代表的なトレース痒いこれらのパラメータの分析は、 図3A-Bに示されています。
カルシウム依存性収縮
細胞外カルシウム濃度は決定的心臓興奮収縮連関を決定し、このパラメータを変化させることにより、心筋細胞における収縮装置のカルシウム感受性を評価することができます。 図3Cに改変されたカルシウムトランジェントで、その後変更された単収縮力発生における細胞外カルシウム濃度の結果の増大を示します。細胞外液のカルシウム濃度が増加し、ステップバイステップ（ すなわち、7mMの1.5の間）です。このプロトコルを適用することによって、収縮装置のカルシウム依存性収縮に対するカルシウムの恒常性を評価することができます。本稿で使用される臓器浴の設定では、細胞外カルシウム濃度の変化は、臓器浴solutを変更することによって実行されましたイオンは、手動（非ペーシング間隔の後に強制的に増強を参照）ペーシングの短い中断にし、続いて人工postrest増強につながります。
非ペーシング間隔の後力増強（PRP）
収縮サイクルカルシウムの終わりに、このように拡張期に細胞質カルシウム濃度を低下させる、主にATP依存性カルシウムポンプ（SERCA、sarco - 小胞体カルシウムATPアーゼ）によってsarcoplasmatic胞体（SR）に隔離されます。 2収縮間の時間間隔を大きくすると、より多くのカルシウムがバックSRに圧送することができ、その後、より多くのカルシウムが次の励起の際に放出させることができます。 postrest-増強プロトコル（PRP）が定義された期間の残りの期間で前刺激した後の単収縮力の振幅の変化を説明しています。ヒト、ラットと同様にマウスの心臓組織内では、単収縮力の増強は、（10,12-14,16を示されました
周波数依存収縮（FFR）
フォース周波数関係は暴行率と収縮単収縮力（ボーディッチ効果）18との間の相関関係を説明しています。力-周波数の関係は大幅に哺乳動物種および実験条件19との間で異なります。マウスでは、拍動速度と収縮力との間の特定の相関が示されました。 FFRを刺激9-12の1-4ヘルツ（ 図3E）の範囲内で陽性であることが示されたのに対し、32℃で、0.1〜1ヘルツの刺激率の初期の負のFFRは、示されました。
失敗myocaで暴行率と収縮の間に負の相関が20,21に記載されている rdium。本稿では、標準的なペーシング周波数（1ヘルツ）が0.1 Hzに低減され、そこから出発して、ペーシング周波数を増分5ヘルツまで上昇させる（0.2; 0.5; 1; 2; 3; 4; 5ヘルツ）。
βアドレナリン作動性刺激
アドレナリンやノルアドレナリンなどのカテコールアミンは、βアドレナリン受容体の活性化により、心臓の収縮力を調節すること（病理）生理的ストレス状態の間に放出されるホルモンです。カテコールアミンの医原性の適用は、一時的に心臓の変力性を高めるために、急性心不全患者の臨床治療において重要な役割を果たしています。この効果は、見られ、in vitro試験で調査することができます。 βアドレナリン受容体のアゴニストとして、イソプレナリンは収縮単収縮力を増加させる。in vivoで 、暴行頻度の増加も発生します（陽性変力作用）、これはさらに収縮応答（ボーディッチ効果は、また、FFRプロトコルは、上記の参照）を変調します。ここに記載した方法を用いて、イソプレナリンの変力効果は、変時効果（ 図3F）なしで固定の叩解速度で調べることができます。 βアドレナリン受容体の刺激はまた、ヒスタミンなどの他のホルモンによって達成することができます。マウスの心室組織では、最初の陽性変力作用が含まれていますが、単収縮力の過渡低下と、図3Gに示すように、二相反応中のヒスタミン結果のアプリケーションです。そのため、ヒスタミンを適用することによって測定されたデータの解釈が困難であると思われます。特にマウスでの根本的な受容体活性化は完全に解決されていません。
虚血状態
急性心筋虚血は、酸素と心臓組織の供給不足をもたらす血流の重大な限界として定義され収縮性の喪失、虚血性拘縮および細胞死の開発をもたらす栄養素。 in vitroでの虚血をシミュレートするために、筋肉がグルコースを30分間暴露され、ピルビン酸を含まない細胞外溶液は、95％N 2/5％CO 2で泡立て。そのアプローチでは心筋細胞におけるATPの枯渇が誘導されるべきです。虚血シミュレーション開始後数分以内に、単収縮力の低下がプリロード張力（ 図3H）の自然増加として描か虚血性拘縮の外観で発生します。
表1：コンポーネントと使用される緩衝溶液の濃度。
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表2：提案した実験プロトコルの一覧は、単離された乳頭筋標本における心収縮性を調査します。
乳頭筋の準備の図1.重要なステップ。両方の心房の（A）解剖。 （B）は、左心室の前方乳頭筋上に表示します。 （C）心室壁から乳頭筋の解剖。 （D）器官槽室で固定する前に、2絹糸のアタッチメント。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2.器官槽の設定。（A）オーガンバスのセットアップの概略設定。通気ガラスフリットを備えたウォータージャケット器官浴チャンバは、安定した温度制御を提供します。方形波パルスを生成するために、フィールド電極は、組織支持体に結合されています。力変換器により生成された信号を増幅し、筋肉の収縮を検知します。この信号は、A / D変換器で濾過し、バックコンピュータに転送されます。信号は、デジタル化され、後の分析のために保存することができます。器官槽の設定（C）からの器官槽室に固定された単一の乳頭筋の準備の（B）の画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図マウスの左前方の乳頭筋の収縮の測定3。代表的な結果。（A）単収縮力の振幅の代表的な分析、時間はテンション（TTP）と、単一の単収縮の最大値の半分緩和時間（R 50）をピークに。定義された休止区間（ポスト残り増強、PRP）、（D）、または異なる時に、細胞外カルシウム濃度（C）を増加させる時に1ヘルツ（B）の叩解速度で基底刺激下マウス乳頭筋調製物の刺激痙攣の代表記録、刺激率（力周波数の関係、FFR）（E）とIsoprenaline-（F）またはヒスタミンのアプリケーション（G）の増加する濃度の後にアプリケーション。虚血刺激（H）中に刺激痙攣とプリロードの代表的な記録。S：//www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
収縮パラメータの図4.分析。収縮機能を特徴づけるために、単収縮力の大きさ（高さ）を含むパラメータは、テンション（TTP）と最大値の半分緩和時間（それぞれ、R 50 / TFallを）ピークまでの時間は、ソフトウェアを使用して、このプロトコルで分析されていますプログラムチャート5.5（ADInstruments）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、我々は、マウスの心臓生理学と病理学に関連するいくつかの科学的な質問に答えるだけでなく、トランスジェニック系統の分析と新たな医薬品のアプローチの発見をサポートするために使用することができ、in vitroでマウス乳頭筋の収縮性を調査する方法を説明心臓の機能不全を治療することができます。我々は、心臓の筋肉の収縮の、生理的な病理学的および薬理学的特性を評価するためのこの方法の使用を説明する（ 図3参照）。ここでは図示していない追加のアプリケーションは、別の薬剤を使用して、細胞内経路の評価を（も12参照）が挙げられます。
そのような虚血性心疾患や心不全などの心臓疾患が著名な臨床上の問題が表示され、世界中の22死亡率および罹患率のための主要な原因です。心臓で発現する多くのタンパク質は、心臓の収縮のための彼らの役割は、STILですlはよくわかっていないか、今まで勉強していません。孤立した乳頭筋の収縮の測定は、マウスモデルにおいてin vitroでの心臓収縮を研究する有意義かつ有効なアプローチを示しています。
この方法は技術的に可能であり、良好な再現性を示しているが、その成功を確保するために必要ないくつかの重要なステップがあります：まず、心を単離した後、適切に（可視化）を動作することができるように準備手順中に血液を含まない溶液を確保します。別の重要なステップは、組織標本は、任意のタッチを回避または乳頭筋の伸張によって生存率を確実にするために慎重に行われることです。方法のセクションで説明したように絹糸のトラブルフリーの添付ファイルを確実にするために、乳頭筋に接続弁膜帆を維持しようとします。器官槽室で準備を固定した後、BDMをフラッシュするために最初の数分間の間に臓器浴溶液を数回変更します。 Increa単収縮力のこれ以上の増加が発生しなくなるまで少し徐々に準備のプレテンションをSE。そのような不整脈ビートと虚血状態のための印としてプリテンションの自発的な増加など、単一のプロトコルを評価するためのいくつかの除外基準があります。新規作成サンプルが収縮に対する薬物媒介効果の分析のために使用されるべきである一方、そのようなpostrest増強力 - 周波数の関係のようないくつかの実験プロトコルは、同じ製剤サンプルを用いて行うことができます。調製プロトコルは、左前乳頭筋を分離するために最適化されます。プロトコルを適応、また後部の筋肉が収縮測定のこの方法のために使用することができます。
孤立した乳頭筋の測定この方法は、薬剤またはシムを適用した後カルシウム、温度および周波数依存の収縮と同様に収縮反応に関する様々な情報を提供します病理学的状態のピュレーション。しかし、これらの結果の解釈と外挿は、科学的な注意して処理する必要があります。記載の方法は、心筋、通常の環境から切り離されて、神経支配のインビトロモデルです。そのため、実験条件は、生理学的ではなく、このプロトコルで受信した結果は 、in vivo の状況との深い解釈されずに転送することはできません。例えば、この方法は、血圧、ホルモンまたは外因性の神経制御における変化を考慮に入れません。器官浴中で調製するための酸素および代謝サプリメントの供給は、拡散によって制限されます。酸素および代謝サプリメントの供給不足は、虚血状態、その後、無効な実験結果につながるであろう。これを回避するために、実験条件は、特に器官浴溶液の酸素、カルシウムの濃度および温度に関して、最適であるべきです。プロトコルの実験条件は、ここで説明すると、有効な結果を与えることができます。
本稿における虚血のような条件をシミュレートする方法について説明します。さらに、低酸素状態のシミュレーションに、臓器浴溶液のすべての精力的なサプリメントは、可能な限り良いin vivoでの虚血状態を模倣するために枯渇させました。低酸素症とは対照的に、それは、酸素とエネルギーの供給を同時に枯渇がインビボ23 に見られる変化に匹敵するカルシウムトランジェントの変化をもたらすことが示されました。
マウス乳頭筋の単離について記載した手順は、例えば、ラット、他の種に適合させることができます。しかし、臓器浴の設定の最適条件は、様々な動物モデルの間で変化する可能性があり、適合させることができます。適応が必要な場合がありますパラメータは、温度と生理的溶液のカルシウム濃度です。
summarでyが、この収縮法は、心臓生理学、病態生理と薬理学を評価するための非常に強力なアプローチを提供します。適切に使用すると、それは孤立したが、十分に制御された環境で、心収縮性を研究する能力を提供します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、ドイツ学術協会（KFO 196」Signaltransduktion BEI adaptativenウントmaladaptiven kardialenかいそう-Prozessen」、FR 1638 / 1-2）でと心血管研究DZHK（ドイツ語センター、医療研究のドイツ語センターの一部でサポートされていました、BMBF（教育研究のドイツ省）構想）です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Hazard statement H 302, solve in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Hazard statement H 315-H319-H335 |
| Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335 |
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