Summary
Murine sinistra muscolo papillare ventricolare può essere usato per studiare la contrattilità cardiaca in vitro. Questo articolo descrive in dettaglio l'isolamento e protocolli sperimentali per studiare le caratteristiche contrattili cardiaci.
Abstract
Muscoli papillari isolati dai cuori adulte di topo possono essere utilizzati per studiare la contrattilità cardiaca durante le diverse condizioni patologiche / fisiologiche. Le caratteristiche contrattili possono essere valutate in maniera indipendente da influenze esterne, quali tono vascolare o lo stato neuroumorale. Raffigura un approccio scientifico tra le misurazioni di cellule singole con isolate miociti cardiaci e studi in vivo, come l'ecocardiografia. Così, preparazioni muscolo papillare servire come un modello eccellente per studiare la fisiologia cardiaca / patofisiologia e può essere utilizzato per le indagini come la modulazione da agenti farmacologici o l'esplorazione di modelli animali transgenici. Qui, descriviamo un metodo per isolare l'anteriore sinistra muscolo papillare murino di indagare la contrattilità cardiaca in un setup bagno di organo. A differenza di un preparato striscia muscolare isolato dalla parete ventricolare, il muscolo papillare può essere preparato in toto senza danneggiare il muscolo tissuuna e severamente. Il setup bagno organo è composto da diversi elettrodi attrezzate camere a bagno d'organo a temperatura controllata, gasati e. Il muscolo papillare isolato è fissato nella camera bagno di organo e stimolato elettricamente. La forza di contrazione evocata viene registrata utilizzando un trasduttore di pressione e parametri quali contrazione forza ampiezza e contraggono la cinetica vengono analizzati. Diversi protocolli sperimentali possono essere eseguite per indagare la contrattilità e calcio-dipendente dalla frequenza e curve dose-risposta di agenti contrattili come catecolamine o altri farmaci. Inoltre, le condizioni patologiche come l'ischemia acuta possono essere simulati.
Introduction
L'indagine di proteine come canali ionici che si riferiscono loro ruolo per la contrattilità cardiaca è essenziale per scoprire differenti meccanismi patogenetici e di stabilire nuove strategie terapeutiche per le malattie cardiache come l'ischemia e insufficienza cardiaca.
Funzione contrattile dei cardiomiociti mammiferi è noto per essere modulata da vari canali ionici, trasportatori e altre proteine. Potenziale d'azione evocato attivazione di tensione dipendente sarcolemmal tipo L di Ca 2+ canali porta a Ca 2+ afflusso dallo spazio extracellulare e successivamente Ca2 + indotta rilascio di Ca 2+ (CICR) 1, che innesca la contrazione cellulare 2. Ca 2+ -Segnalazione gioca un ruolo centrale nella contrattilità cardiaca e l'adattamento allo stress fisiologico o patologico. Catecolamine attivano i recettori beta-adrenergici cardiaci, stimolando così ciclasi (AC) che sintetizza cAMP. L'attivazione, Protein chinasi A (PKA) fosforila diverse proteine associate intracellulari e di membrana come L-tipo Ca 2+ canali, fosfolambano e recettori rianodinici conseguente modifica di Ca 2+ transitori e cardiaco contrattilità 1,3,4. cAMP è degradata dalla fosfodiesterasi (PDE). L'attivazione dei recettori Gs-accoppiati diversi beta-adrenergici porta anche ad accumulo di cAMP.
La tecnica di misurazione contrattilità in isolati strisce muscolari ventricolare è ben definito per le più grandi mammiferi 5-8. Sulla base della possibilità di gene targeting in topi è importante stabilire metodi per analizzare murino fisiologia cardiaca. Tuttavia, i dati esistenti sulle proprietà fisiologiche di preparati muscolari isolate in topi variano a seconda delle condizioni sperimentali 9-12.
Il metodo descritto è utilizzato per analizzare contrattilità cardiaca ventricolare sinistra pre muscolo papillareparations in vitro. Investigation della contrattilità cardiaca viene eseguita in assenza di influenze modificanti contrattilità cardiaca in vivo, come la pressione sanguigna, stimolazione neuroumorale e stress fisico o metabolica. Il tasso di battito della preparazione contraente muscolo può essere rigorosamente definito e cambiato arbitrariamente. Twitch forza può essere analizzato nel contesto di stimoli specifici come concentrazione di calcio, battendo frequenza o temperatura. Inoltre, questo metodo può essere usato per studiare diversi componenti della via di segnalazione e di confrontare funzione cardiaca di modelli murini geneticamente modificati controllando condizioni sperimentali sopra menzionati.
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Protocol
NOTA: I passaggi fondamentali della procedura di isolamento sono mostrati in Figura 1 Tutti i passaggi sono descritti in dettaglio nel seguente protocollo.. Isolamento del muscolo papillare, il montaggio in organo da camera bagno, acquisizione e l'analisi viene effettuata in un lasso di tempo consecutivo e obbligatoria.
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legislazione tedesca in materia di protezione degli animali e sono state approvate dal Consiglio di esame etico dell'Università di Heidelberg.
1. Preparazione di Instrumentation
- Per contrattilità misurazioni utilizzare un setup vasca organo multichambered. Componenti di un ex vivo contrattilità configurazione bagno organo sono mostrati nella Figura 2.
NOTA: Per minimizzare la quantità di tempo tra la preparazione del muscolo papillare e l'inizio del protocollo sperimentale, impostare attrezzature e preparare buffer prima di raccogliere tissue.This sperimentali provides la maggior quantità di tempo che il tessuto rimane vitale per condurre esperimenti. - Avviare computer e apparecchiature di acquisizione dati. Attivare bagno organo di calore (preimpostato a 32 ° C) e lasciare unità alla temperatura preimpostata.
- Preparare l'apparecchiatura di acquisizione. Iniziare la registrazione dei dati come indicato nel manuale del software.
- Controllare e condurre calibrazione (se necessario) su ciascun canale e azzerare tutti i canali di standardizzare il segnale elettrico fornito dal rispettivo trasduttore di forza (associato a quel canale) a 2 g forza fornita da un peso certificata.
- Accendere approvvigionamento di gas (95% O 2/5% di CO 2) alle camere bagno organo. Continuamente gas tutte le camere durante l'intero misure di protocollo.
2. Preparazione di Tamponi e soluzioni fisiologiche
- Preparare una soluzione tampone Krebs-Henseleit per raggiungere concentrazioni finali di 119 mM NaCl; 25 NaHCO MM 3; 4.6 mM KCl; 11MM glucosio; 1 mM Na-pyruvate; 1.5 mM CaCl 2; 1.64 mM MgSO 4; 1.18 mM KH 2 PO 4 e regolare il pH a 7,4 (vedi Tabella 1 soluzione fisiologica).
- Preparare una soluzione tampone a parte Krebs-Henseleit da utilizzare durante l'isolamento come descritto al punto 2.1 con l'aggiunta di monoxime 30MM 2,3-butanedione (BDM) e 50 IE Eparina / ml. Raffreddare la soluzione a 4 ° C (vedere Tabella 1 Preparazione Soluzione). Per la simulazione ischemia, ischemia preparare soluzione come descritto nella Tabella 1.
- Per il protocollo del Ca 2 + - contrattilità dipendente, aggiungere Ca 2+ alla soluzione tampone Krebs-Henseleit a concentrazione finale richiesta.
NOTA: preparare queste soluzioni direttamente prima del suo utilizzo e Gass con CarboGen per evitare la precipitazione di Carbonato di Calcio. Soluzione Preriscaldare a 32 ° C prima dell'uso.
3. Preparazione del Gassing Tube e dissezione del piatto utilizzata durante il Excision Procedure papillare
- Collegare un gas morbidocantare tubo (diametro esterno 2-4 mm) per il collegamento del gas (ossigeno al 100%, CarboGen alternativamente) con l'esperto di lavoro.
- Creare un anello chiuso del tubo gassazione raccordo all'interno del piatto dissezione. Forare il tubo di gassificazione più volte che una ebollizione continua è assicurata. Questo tubo gassazione può essere utilizzato più volte.
- Preparare piatto dissezione con un elastomero di silicone nella parte inferiore (0,5 cm), in modo che i perni possono essere bloccati in esso. Questo piatto può essere utilizzato più volte.
4. Isolamento dei anteriore sinistra Muscolo papillare da topi
NOTA: Prima di iniziare l'isolamento del muscolo papillare, controllare che le linee di gas sono chiare di blocchi.
- Preparare configurazione vasca organo come menzionato nella sezione del protocollo 1-3 prima di iniziare la preparazione dei muscoli papillari. Preparare tutte le soluzioni al giorno dell'esperimento.
- Sacrifica il mouse (circa 8-12 settimane) da cervicale dislocazione According per linee guida istituzionali di lavoro di esperti e.
- Fissare l'animale in posizione supina fissando zampe anteriori e posteriori zampe su una tavola di dissezione, aprire il torace laterali su entrambi i lati tagliando attraverso le costole con forbici ossee affilate, poi tagliare la membrana con un taglio trasversale. Rimuovere il pericardio. Ora cuore e l'aorta sono accessibili.
- Fissare il cuore con una pinza smussato sul tronco vascolare vicino al cuore e separare il cuore rapidamente con le forbici dai polmoni e il tessuto circostante.
- Trasferire il cuore pulsante di una capsula di Petri riempite con una soluzione preparazione raffreddata gasati con l'ossigeno (punto 2.2). Lasciare che il cuore a battere e stimolare le contrazioni del cuore dolcemente via toccando l'apice cardiaco con una pinza.
- Non appena il cuore è completamente exsanguinous, trasferirlo al piatto dissezione riempito con soluzione di preparazione raffreddata (passo 2.2) e gasati con O 2. Da questo punto in uso uno stereomicroscopio.
- Fissare il heaRT con un piccolo perno attraverso il ventricolo destro in modo che il cuore è visto dalla dorsale (ventricolo destro si trova sul lato destro dalla vista dell'operatore).
- Utilizzando le forbici microchirurgiche separano entrambi gli atri a livello atrioventricolare, taglio tessuto connettivo dai ventricoli e scartare. Effettuare un taglio attraverso la parete ventricolare dalla valvola livello AV all'apice del cuore evitando ogni pressione meccanica.
- Aprire il ventricolo e fissare la parete libera lato sinistro con una pinza, avendo così uno sguardo a due ventricolo muscoli papillari sinistro.
- Leggermente tagliare il tessuto ventricolare laterali su entrambi i lati del muscolo papillare anteriore sinistra conservando una parte della vela valvolare sulla preparazione muscolo papillare ed evitare di toccare o allungamento del muscolo papillare quanto possibile. Sezionare il restante tessuto della parete ventricolare dal muscolo papillare.
- Fissare fili di seta (7/0, metrico 0,5) su entrambi i lati della preparazione muscolo papillarearazione, uno sulla vela valvolare ed una sulla parte muscolare. Fissare la preparazione nella camera bagno di organo pieno di soluzione del bagno organo e gasati con CarboGen, la temperatura a 32 ° C viene consigliata.
5. equilibrazione e stimolazione del muscolo papillare
- Stimolare la preparazione muscolo papillare con impulsi rettangolari (durata di 2 ms e corrente di 100 mA) a frequenza di 1 Hz stimolazione immediatamente dopo il fissaggio nel bagno organo.
- Assicurare un frequente ricambio della soluzione del bagno di organo, sia dal cambiamento continuo o da frequenti modifica manuale (ogni 5 min) a seconda dell'impostazione del tipo a bagno d'organo utilizzato.
- Aumentare gradualmente la pretesa fino a forza contrazione massima a raggiunto. Forza contrazione massima viene raggiunta quando l'aumento del precarico non è seguito da un ulteriore aumento nella forza contrazione.
- Dopo 45-60 minuti di equilibrio, avviare il protocollo sperimentale.
NOTA: Il protocollo sperimentale descritto di seguito comprende manovre standard per caratterizzare la contrattilità cardiaca in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Nella sezione rappresentante descriviamo questi protocolli in dettaglio anche mostrando i risultati di rappresentanza (vedi anche tabella 2).
- Registrazione ed analisi dei protocolli sperimentali
- Per la registrazione, utilizzare un software adatto con adeguata risoluzione temporale (velocità di acquisizione ≥ 1kHz).
- Analizzare parametri tra cui la forza contrazione ampiezza (altezza), il tempo di picco di tensione (TTP) e per metà tempo di rilassamento massimo (R 50 / tfall, rispettivamente) come indicato nel programma di software (come ad esempio Grafico 5.5 di ADInstruments, vedi Figura 4).
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Representative Results
Il protocollo di questo manoscritto per misure contrattilità isolati murini preparazioni muscolo papillare è sintonizzato per condizioni ottimali per ottenere risultati sperimentali riproducibili in condizioni fisiologiche. Per definire le condizioni sperimentali ottimali abbiamo eseguito esperimenti pilota variabili temperatura del bagno d'organo e la concentrazione di calcio extracellulare (vedi anche 12). Il protocollo qui descritto è stato eseguito con una concentrazione di calcio extracellulare 1,5 mM e una temperatura di 32 ° C.
Proprietà contrattilità basali
Per caratterizzare le proprietà contrattilità basale, parametri di forza contrazione ampiezza, contrazione frequenza, il tempo di picco (definito come il tempo richiesto per raggiungere la massima forza di contrazione a partire dal 5% basale) e relax 50 tempo (tempo di rilassamento mezzo massimale; definito come il tempo richiesto per raggiungere la metà della forza di rilassamento) vengono utilizzati in questo protocollo. Una traccia rappresentante di twpruriti e l'analisi di questi parametri sono illustrati nella Figura 3A-B.
Contrattilità calcio-dipendente
Concentrazione di calcio extracellulare determina in modo cruciale cardiaco accoppiamento eccitazione-contrazione e variando questo parametro, la sensibilità di calcio dell'apparato contrattile in cardiomiociti può essere valutato. Come mostrato in Figura 3C l'aumento dei valori di concentrazione di calcio extracellulari di transienti di calcio alterati e successivamente in alterato generazione di forza contrazione. Il calcio-concentrazione della soluzione extracellulare aumenta passo-passo (cioè tra 1,5 e 7 mm). Applicando questo protocollo, l'omeostasi del calcio per quanto riguarda la contrattilità calcio-dipendente del dell'apparato contrattile può essere valutato. Nella configurazione vasca organo utilizzato in questo manoscritto, la variazione della concentrazione di calcio extracellulare è stata eseguita modificando il solut vasca organoion portando manualmente per una breve interruzione della stimolazione e, successivamente, a un postrest potenziamento artificiale (vedi Forza potenziamento dopo l'intervallo non stimolazione).
Forza potenziamento dopo l'intervallo non stimolazione (PRP)
Alla fine di un ciclo di contrazione di calcio è sequestrato nel reticolo sarcoplasmatico (SR) prevalentemente da una pompa del calcio ATP-dipendente (SERCA, sarco-reticolo endoplasmatico calcio-ATPasi), riducendone così la concentrazione calcio citosolico durante diastole. Se l'intervallo di tempo tra due contrazioni viene ingrandita, più di calcio può essere reimmessa nel SR e successivamente più calcio può essere rilasciato durante la successiva eccitazione. Il protocollo postrest-potenziamento (PRP) descrive alterazioni dell'ampiezza forza contrazione dopo una stimolazione precedente, con periodo di riposo di una durata definita. Nell'uomo, ratto e nel tessuto cardiaco murino, è stato mostrato un aumento della forza di contrazione 10,12-14,16 (
Contrattilità dipendente dalla frequenza (FFR)
Relazione forza-frequenza descrive la correlazione tra tasso di battere e forza contrattile contrazione (effetto Bowditch) 18. Il rapporto di frequenza forza- differisce significativamente tra le specie di mammiferi e le condizioni sperimentali 19. Nei topi, ha dimostrato una correlazione specifica tra tasso di battitura e la forza di contrazione. A 32 ° C, un FFR negativo iniziale tra tassi di stimolazione di 0,1-1 Hz è stato mostrato, mentre la FFR ha dimostrato di essere positivo nel range di 1-4 Hz di stimolazione 9-12 (Figura 3E).
In mancanza di myocardium una correlazione negativa tra battendo votare e contrattilità viene descritto 20,21. In questo manoscritto, la stimolazione frequenza standard (1 Hz) si riduce a 0,1 Hz ea partire da lì, la stimolazione frequenza viene gradualmente aumentato a 5 Hz (0,2; 0,5; 1; 2; 3, 4, 5 Hz).
stimolazione beta-adrenergica
Catecolamine come adrenalina e noradrenalina sono ormoni che vengono rilasciati durante (patologiche) condizioni fisiologiche di stress che modulano forza contrattile cardiaco attraverso l'attivazione di beta-adrenergici. Applicazione iatrogena di catecolamine gioca un ruolo di primo piano nel trattamento clinico dei pazienti con insufficienza cardiaca acuta per migliorare inotropo cardiaco temporaneo. Questo effetto può anche essere visto e studiato in studi in vitro. Come un agonista di beta-adrenergici, isoprenalina aumenta forza contrattile contrazione. In vivo, un aumento della frequenza battendo verifica anche (effetto inotropo positivo), cheinoltre modula la risposta contrattile (effetto Bowditch, vedi anche il protocollo FFR sopra descritto). Utilizzando il metodo descritto qui, l'effetto inotropo di Isoprenalina può essere indagato a tasso fisso senza battere tal senso cronotropo (Figura 3F). La stimolazione della beta-adrenergici può essere ottenuto anche con altri ormoni come l'istamina. Nel tessuto ventricolare murino, applicazione dei risultati istamina in risposta bifasica contenente un primo effetto inotropo positivo, ma con una diminuzione transitoria in vigore contrazione come mostrato nella Figura 3G. Per questo motivo l'interpretazione dei dati misurati applicando dell'istamina sembra essere difficile; soprattutto sottostante recettore attivazione nei topi non è del tutto risolto.
Condizioni ischemiche
Acuta ischemia cardiaca è definita come una limitazione critica del flusso sanguigno che porta alla undersupply del tessuto cardiaco con ossigeno enutrienti con conseguente perdita della contrattilità, sviluppo di contrattura ischemica e morte cellulare. Per simulare l'ischemia in vitro, i muscoli sono esposti per 30 minuti per glucosio e la soluzione extracellulare priva di piruvato gorgogliare con il 95% N 2/5% di CO 2. Con questo approccio un impoverimento di ATP nei cardiomiociti dovrebbe essere indotta. Entro pochi minuti dopo l'inizio della ischemia-simulazione, un declino della forza contrazione si verifica con l'apparenza di una contrattura ischemica raffigurato come un aumento spontaneo della tensione precarico (Figura 3H).
Tabella 1: Componenti e concentrazioni delle soluzioni tampone utilizzate.
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Tabella 2: Elenco dei protocolli sperimentali suggerite per indagare la contrattilità cardiaca in isolate preparati muscoli papillari.
Figura 1. fasi principali della preparazione muscolare papillare. (A) dissezione di entrambi gli atri. (B) Vista anteriore del ventricolo sinistro muscolo papillare. (C) dissezione del muscolo papillare dalla parete ventricolare. (D) Fissaggio di due fili di seta prima della fissazione in camera bagno di organo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. configurazione bagno Organ. (A) Impostazione Schema del setup bagno di organo. Giacca acqua camere bagno organo dotate fritte di vetro di aerazione garantiscono il controllo della temperatura stabile. Per generare impulsi ad onda quadra elettrodi di campo sono fissati al supporto del tessuto. Un trasduttore di forza rileva la contrazione del muscolo amplificando così il segnale generato. Questo segnale viene filtrato e trasferito al computer da un convertitore A / D. Il segnale è quindi digitalizzato e può essere salvato per successive analisi. (B) Immagine di una singola preparazione muscolare papillare fissato nella camera bagno di organo dal setup bagno di organo (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Risultati rappresentativi delle misurazioni contrattilità murini anteriore sinistra muscoli papillari. (A) Analisi Rappresentante della forza contrazione di ampiezza, tempo di picco di tensione (TTP) e per metà tempo di rilassamento massimo (R 50) di un singolo contrazione. Registrazioni rappresentativi di contrazioni stimolate di murine preparati muscolo papillare sotto stimolazione basale con un tasso di battito di 1 Hz (B), durante l'aumento delle concentrazioni di calcio extracellulare (C), durante gli intervalli definiti di riposo (di potenziamento posta riposo, PRP) (D), o diverso tassi di stimolazione (rapporto forza-frequenza, FFR) (E) e dopo l'applicazione di concentrazioni crescenti di Isoprenaline- (F) o istamina-applicazione (G). Registrazione rappresentante di contrazioni stimolate e precarico durante ischemia-stimolazione (H).s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Analisi dei parametri contrattili. Caratterizzare funzione contrattile, parametri tra cui la forza contrazione ampiezza (altezza), il tempo di picco di tensione (TTP) e la metà massimale tempo di rilassamento (R 50 / tfall, rispettivamente) sono analizzate in questo protocollo utilizzando il software Grafico programma 5.5 (ADInstruments). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo manoscritto si descrive un metodo per indagare la contrattilità del muscolo papillare murino in vitro che può essere utilizzato per rispondere ad alcune domande scientifici relativi alla fisiologia del cuore e la patologia nei topi, nonché per sostenere l'analisi delle linee transgeniche e la scoperta di nuovi approcci farmaceutici per il trattamento di disfunzioni cardiache. Illustriamo l'uso di questo metodo per valutare le proprietà fisiologiche, patologiche e farmacologiche di contrattilità muscolare cardiaca (vedi Figura 3). Ulteriori applicazioni non illustrati qui includono la valutazione dei percorsi intracellulari utilizzando diversi agenti farmacologici (vedi anche 12).
Malattie cardiache come la cardiopatia ischemica e lo scompenso cardiaco mostrano un problema clinico eminente e rimangono la principale causa di mortalità e morbilità in tutto il mondo 22. Per molte proteine espresse nel cuore, il loro ruolo contrattilità cardiaca è still poco conosciuta o non studiata fino ad ora. La misura contrattilità su isolate muscoli papillari dimostra un approccio significativo e valido per studiare la contrattilità cardiaca in vitro in modelli murini.
Anche se il metodo è tecnicamente fattibile e mostra una buona riproducibilità, ci sono diversi passaggi critici necessari per assicurare il successo: primo, dopo aver isolato cuore, assicurano una soluzione gratuita sangue durante la procedura di preparazione per poter funzionare correttamente (visualizzazione). Un altro passo fondamentale è che la preparazione dei tessuti viene eseguita con cura per garantire la redditività evitando qualsiasi toccare o stiramento del muscolo papillare. Come descritto nella sezione Metodo cercare di mantenere la vela valvolare collegata al muscolo papillare di garantire un collegamento senza problemi del filo di seta. Dopo la fissazione della preparazione nella camera bagno di organo, cambiare la soluzione del bagno organo più volte durante i primi minuti per scovare il BDM. IncreaSE la pretesa della preparazione leggermente e gradualmente finché non si verifica più aumento della forza contrazione. Ci sono alcuni criteri di esclusione per la valutazione dei singoli protocolli come battiti aritmici e aumento spontaneo della pretensione come un segno per condizioni ischemiche. Diversi protocolli sperimentali come postrest potenziamento e relazione forza-frequenza possono essere eseguite con lo stesso campione preparato, mentre un nuovo campione preparato deve essere utilizzato per l'analisi degli effetti farmaco-mediati su contrattilità. Il protocollo di preparazione è ottimizzato per isolare il muscolo papillare anteriore sinistra. Adattamento del protocollo, anche il muscolo posteriore può essere utilizzato per questo metodo di misurazione della contrattilità.
Questo metodo di misurazione isolato muscolo papillare fornisce varie informazioni sulla calcio-, temperatura e dipendente dalla frequenza contrattilità, nonché circa la risposta contrattile dopo l'applicazione di agenti farmacologici o la simlamento di condizioni patologiche. Tuttavia, l'interpretazione e l'estrapolazione di questi risultati deve essere maneggiato con cura scientifica. Il metodo descritto è un modello in vitro di muscolo cardiaco, staccato dal suo ambiente normale e innervazione neurale. Pertanto, le condizioni sperimentali non sono fisiologici ei risultati ricevuti in questo protocollo non possono essere trasferiti senza interpretazione approfondita alla situazione in vivo. Ad esempio, il metodo non tiene conto dei cambiamenti della pressione sanguigna, ormoni o controllo neurale estrinseca. La fornitura di ossigeno e metaboliche integratori per la preparazione del bagno organo è limitata dalla diffusione. Un apporto insufficiente di ossigeno e metaboliche integratori porterebbe a condizioni di ischemia e risultati sperimentali in seguito non validi. Per evitare questo, le condizioni sperimentali devono essere ottimali, soprattutto per quanto riguarda l'ossigenazione, concentrazione di calcio e la temperatura della soluzione del bagno organo.Con le condizioni sperimentali del protocollo qui descritte, i risultati validi possono essere offerte.
In questo manoscritto è descritto un metodo per simulare condizioni ischemia-like. Inoltre alla simulazione di ipossia, tutti gli integratori energetici della soluzione del bagno organo sono esaurite per imitare lo stato ischemico in vivo nel miglior modo possibile. In contrasto con ipossia, è stato dimostrato che la riduzione simultanea di ossigeno ed energetico provoca cambiamenti dei transienti di calcio comparabili ad alterazioni visto in vivo 23.
La procedura descritta per l'isolamento del mouse del muscolo papillare può essere adattato ad altre specie, ad esempio, di ratto. Tuttavia, le condizioni ottimali di setup bagno organo potrebbe variare tra i diversi modelli animali e possono essere adattati. Parametri che possono avere bisogno di adattamento sono la temperatura e la concentrazione di calcio della soluzione fisiologica.
In summary, questo metodo contrattilità fornisce un approccio molto potente per valutare la fisiologia del cuore, fisiopatologia e farmacologia. Se utilizzato correttamente, fornisce la possibilità di studiare la contrattilità cardiaca in un ambiente isolato, ma ben controllata.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen rimodellante-Prozessen", FR 1638 / 1-2) e dalla DZHK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, una parte dei Centri tedeschi of Health Research , che è un BMBF (Ministero tedesco dell'Istruzione e della Ricerca), iniziativa).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Hazard statement H 302, solve in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Hazard statement H 315-H319-H335 |
| Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335 |
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