Summary
Murin sol ventrikül papiller kas in vitro kardiyak kontraktiliteyi araştırmak için kullanılabilir. Bu makalede ayrıntılı olarak izolasyon ve deneysel protokoller kalp kasılma özelliklerini incelemek için açıklar.
Abstract
Yetişkin fare kalpleri izole papiller kas farklı fizyolojik / patolojik koşullar kardiyak kontraktiliteyi incelemek için kullanılabilir. Kasılma özellikleri bağımsız gibi damar tonusunu veya nörohumoral durumu gibi dış etkilerden değerlendirilebilir. Bu izole kardiyak miyositler tek hücreli ölçümler arasında ve ekokardiyografi gibi in vivo çalışmalarda bilimsel bir yaklaşım gösteriyor. Mükemmel bir model kalp fizyolojisi / patofizyolojisini ve farmakolojik maddeler ile modülasyon ve transgenik hayvan modelleri keşfi gibi araştırmalar için kullanılabilir Dolayısıyla, papiller kas preparasyonlar vermektedir. Burada, bir organ banyosu kurulumunda kardiyak kontraktilite araştırmak için fare sol ön papiller kas izole bir yöntem açıklanmaktadır. Ventriküler duvara izole edilmiş bir kas şerit hazırlanmasında aksine, papiller kas, kas tissu zarar vermeden toto hazırlanabilirciddi e. Organ banyosu kurulumun birkaç ısı kontrollü, gazlanmış ve elektrot donatılmış organ banyosu daireden oluşur. İzole papiller kas organ banyosu odasında sabit ve elektriksel uyarılır. Uyarılmış seğirme gücü gibi kuvvet genliği seğirme ve kinetik analiz edilir seğirme gibi basınç dönüştürücü ve parametreler kullanılarak kaydedilir. Farklı deney protokolleri, katekolaminlerin ya da diğer ilaç olarak kontraktil ajanlar, kalsiyum ve frekansa bağlı kasılma yanı sıra doz-tepki eğrileri araştırmak için gerçekleştirilebilir. Ayrıca, akut iskemi gibi patolojik durumlar simüle edilebilir.
Introduction
Kalp kasılmasında için rollerini atıfta iyon kanalları gibi proteinlerin incelenmesi, farklı patomekanizmaların keşfetmek ve iskemi ve kalp yetmezliği gibi kalp hastalıkları için yeni tedavi stratejilerinin oluşturulması esastır.
Memeli kardiyomiyositlerde Kontraktil fonksiyonu çeşitli iyon kanalları, taşıyıcılar ve diğer proteinler ile modüle edilmesi bilinmektedir. Aksiyon potansiyeli 2+ kanalları dışı alandan Ca 2 + akını yol açar ve daha sonra Ca 2 + hücresel daralma 2. tetikler Ca 2 + salınımını (YÜÇAM) 1, -kaynaklı Ca voltaj bağımlı sarkolemmal L-tipi aktivasyonunu uyarılmış. Fizyolojik veya patolojik stres kalp kontraktilite ve adaptasyon merkezi bir rol oynar -signaling Ca 2 +. Katekolaminler böylece cAMP'yi sentezler adenilil siklaz (AC) uyarıcı, kalp β-adrenerjik reseptörleri aktive. Aktif hale, protein,n Ca 2 + transientler ve kardiyak kontraktilite 1,3,4 modifikasyonu ile sonuçlanan L-tipi Ca 2 + kanalları, fosfolamban'ın ve ryanodin reseptörleri gibi farklı hücre içi ve zar bağlı proteinleri fosforile A (PKA) kinaz. cAMP fosfodiesteraz (PDE) tarafından parçalanır. Β-adrenoseptörleri dışında Gs-bağlanmış reseptörlerin aktivasyonu, aynı zamanda, cAMP birikmesine yol açar.
Izole ventriküler kas şeritlerinde kontraktilite ölçümleri tekniği de daha memeli türler 5-8 için kurulmuştur. Genin olasılığı farelerde hedef dayanarak fare kalp fizyolojisi analiz yöntemleri kurmak önemlidir. Ancak, farelerde izole kas hazırlıkları fizyolojik özellikleri hakkında varolan verileri deneysel koşullara 9-12 bağlı olarak değişiklik gösterir.
Anlatılan yöntem sol ventrikül papiller kas öncesi kardiyak kontraktilite analiz etmek için kullanılırin vitro parations. Kardiyak kontraktilite incelenmesi kan basıncı, nörohümoral stimülasyonu ve fiziksel veya metabolik stres gibi in vivo olarak kardiyak kontraktiliteyi, modifiye etkilerin yokluğunda gerçekleştirilir. Müteahhitlik kas hazırlık dayak oranı titizlikle tanımlanmış ve keyfi değiştirilebilir. Seğirme kuvvet belirli kalsiyum konsantrasyonu gibi uyaranlara, frekans veya sıcaklık yenerek bağlamında analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem, farklı sinyal geçiş yolu bileşenlerinin veya araştırmak ve yukarıda belirtilen deney koşullarının kontrol edilmesi suretiyle genetik olarak modifiye edilmiş fare modellerinde kalp performansını karşılaştırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: izolasyon prosedürü temel adımları Şekil 1 'de belirtilen etaplar aşağıdaki protokolde ayrıntılı olarak tarif edilmiştir.. Papiller kas izolasyonu, organ banyosu odasında montaj, toplama ve analiz ardışık ve zorunlu zaman ölçeğini yapılır.
Tüm hayvan deneyleri hayvanların korunması Alman mevzuatına göre yapılmış ve Heidelberg Üniversitesi Etik Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
Enstrümantasyon hazırlanması 1.
- Kontraktilite için ölçümler multichambered organ banyosu kurulumu kullanın. Bir ex vivo kontraktilite organ banyosu kurulum bileşenleri, Şekil 2 de gösterilmiştir.
NOT: papiller kas hazırlanması ve deney protokolünde başlangıcı arasındaki süreyi kurmak ekipman en aza indirmek ve deneysel tissue.This toplama provid için tamponlar önce hazırlamak içinDoku deneyler için canlı kalır zaman büyük miktarda es. - Bilgisayar ve veri toplama ekipmanı başlatın. Organ banyosu ısı (önceden ayarlanmış 32 ° C) açın ve önceden sıcaklığa birimleri izin verir.
- Edinim ekipmanı hazırlayın. Yazılım kılavuzunda belirtildiği gibi verileri kaydetmeye başlayın.
- Giriş ve her kanalda (gerekirse) kalibrasyonu yapmak ve sertifikalı ağırlıkça verilen bir 2-g kuvvetine (yani, kanal ile ilişkili) karşılıklı kuvvet dönüştürücü temin elektrik sinyali standardize etmek için tüm kanallar sıfır.
- Organ banyosu odalarına gaz temini (% 95 O 2 /% 5 CO 2) açın. Sürekli tüm protokol ölçümleri sırasında tüm odaları gaz.
Tamponlar ve Fizyolojik Çözümler 2. Hazırlık
- 119 mM NaCI nihai konsantrasyonlar elde etmek için Krebs-Henseleit tampon çözeltisi hazırlayın; 25 mM NaHCO 3; 4,6 mM KCI; 11mm glukoz; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl2; 1.64 mM 4 MgSO; 1.18 mM KH 2 PO 4 ve (Tablo 1 Fizyolojik çözüm bakınız) 7.4 pH ayarlamak.
- Ek 30 mM 2,3-Butandion monoxime (BDM) ve 50 IE Heparin / ml ile adım 2.1 'de açıklandığı gibi izolasyonu sırasında kullanmak üzere ayrı Krebs-Henseleit tampon çözeltisi hazırlayın. 4 ° C (Tablo 1 Hazırlama çözeltisi bakınız) soğutun çözeltisi. Tablo 1 de tarif edildiği gibi işemi simülasyonu için, iskemi-solüsyon hazırlanır.
- Ca 2 + protokolü için - bağımlı kontraktilite, istenen nihai konsantrasyona Krebs-Henseleit tampon çözeltisine Ca 2+ ekleyin.
NOT: doğrudan kullanmadan önce bu çözümleri hazırlamak ve Calciumcarbonate çökmesini önlemek için karbojen ile Gass. Kullanmadan önce 32 ° C'ye kadar ön ısıtılması çözeltisi.
Papiller Eksizyon Prosedür sırasında kullanılan Gazlı Tüp ve Diseksiyon Dish 3. Hazırlık
- Yumuşak bir gaz bağlayınuzman çalışma ile gaz bağlantısı (% 100 oksijen, alternatif karbojen) tüp (dış çapı 2-4 mm) şarkı.
- Diseksiyon çanak içine uydurma gazlama tüpün kapalı halka oluşturun. Gazlama tüpü sürekli köpürme güvence birkaç kez delinme. Bu gazlaştırma içi tüpü birkaç kez kullanılabilir.
- Pimleri içine sıkışmış, böylece altta (0.5 cm kalınlığında) bir silikon elastomer diseksiyon çanak hazırlayın. Bu yemek birkaç kez kullanılabilir.
Fareler ile Sol Ön Papiller kas 4. İzolasyonu
NOT: papiller kas izolasyonu başlamadan önce, gaz hatları tıkanmalar açık olup olmadığını kontrol edin.
- Papiller kas hazırlık başlamadan önce protokol bölümünde 1-3 bahsedildiği gibi organ banyosu kurulumu hazırlayın. Deney günü tüm çözümleri hazırlayın.
- Servikal dislokasyon accordi tarafından (yaklaşık 8-12 haftalık) fare Kurbanuzman çalışma ve kurumsal kurallarına ng.
- Forepaws sabitleyerek dorsal pozisyonda hayvan düzeltmek ve bir diseksiyon gemide arka pençeleri, keskin kemik makasla kaburga ile keserek her iki tarafta toraks yanal açın, daha sonra bir çapraz kesim ile diyafram kesti. Perikard çıkarın. Şimdi kalp ve aort erişilebilir.
- Kalbine yakın damar trunkustan üzerinde künt forseps ile kalbi düzeltmek ve akciğerlerden makas ve çevresindeki doku ile hızlı bir şekilde kalbi ayırın.
- Oksijen (adım 2.2) ile gaz verilerek soğutulmuş hazırlık solüsyonu ile dolu bir Petri kabı kalpte aktarın. Kalp yendi ve forseps ile kardiyak apeks dokunmadan yoluyla usulca kalp kasılmalarını uyarmak için izin verin.
- En kısa sürede kalbi tamamen kansızdırlar olduğunu O 2 ile soğutulan hazırlık solüsyonu (adım 2.2) ile doldurulur ve gazlı diseksiyon çanak aktarın. Kullanımı konusunda bu aşamada bir stereomikroskopta itibaren.
- Hea FixKalp (sağ ventrikül operatörün görünümü sağ tarafta yer alan) dorsal görüldüğü şekilde sağ ventrikül ile küçük bir iğne ile rt.
- Kullanımı mikrocerrahi makas ventriküllerin doku bağlayan atriyoventriküler düzeyde hem atriyumları kesmek ayırmak ve atın. Herhangi bir mekanik basınç kaçınarak kalbin apeks AV-valf-seviyesinden ventrikül duvarından bir kesim yapın.
- Ventrikül açın ve dolayısıyla sol ventrikül papiller kas hem bakmak zorunda, forseps ile sol taraflı serbest duvarı sabitleyin.
- Biraz papiller kas hazırlama kapak yelken bir kısmını koruyarak sol ön papiller kas her iki tarafında ventrikül doku yanal kesip ve dokunaklı önlemek veya mümkün olduğunca papiller kas germe. Papiller kas kalan ventrikül duvar dokusu teşrih.
- Papiller kas hazırlık her iki tarafında takın ipek ipler (7/0, metrik 0.5)preparasyonu, kapak yelken biri ve kas parçası üzerinde tek. Sıcaklık 32 ° C olduğu ileri sürülmektedir, organ banyosu çözeltisi ile doldurulur ve karbojen gazı verilmiş organ banyosu odası içinde hazırlanmasını sabitleyin.
Papiller kas 5. Dengeleme ve Uyarım
- Hemen organ banyosunda fiksasyon sonra 1 Hz stimülasyon frekansında dikdörtgen darbeler (2 ms süresi ve 100 mA akım) ile papiller kas hazırlık Canlandıracak.
- Sürekli değişim ya da kullanılan organ banyosu Çeşidi kurulum göre sık manuel değişim (her 5 dk) yoluyla, organ banyosu çözeltisi sık değişiklik sağlayın.
- Ulaştı giderek maksimal seğirme kuvveti kadar gösteriş artırın. Gösteriş artış seğirme yürürlükte bir başka güçlendirme tarafından takip değilken maksimal seğirme gücü ulaşılır.
- Dengeleme 45-60 dakika sonra, deneysel protokol başlatın.
NOT: Aşağıda belirtilen deneysel protokol fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda kalp kasılmasını karakterize standart manevraları içermektedir. Temsili bölümde de temsili sonuçları gösteren ayrıntılı olarak bu protokolleri tanımlar (ayrıca bkz Tablo 2).
- Kayıt ve deneysel protokollerinin analizi
- Kayıt için yeterli temporal çözünürlük (satın alma oranı ≥ 1kHz) uygun bir yazılımı kullanın.
- Seğirme kuvvet genliği (yükseklik), gerginlik (TTP) ve (örnek olarak bakınız Şekil 4, ADInstruments ve 5.5 Grafik) yazılım programında belirtildiği gibi yarım maksimal gevşeme zamanı (R 50 sırasıyla / TFall) zirve zaman gibi parametreleri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İzole fare papiller kas hazırlıkları kontraktilite ölçümleri için bu yazının protokol fizyolojik koşullar altında tekrarlanabilir deneysel sonuçlar elde etmek için optimum koşullara ayarlanmıştır. Optimal deneysel koşullar tanımlamak için biz organ banyosu sıcaklığı ve hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu (ayrıca 12 bakınız) değişen Pilot deneyleri yaptık. Burada açıklanan protokol 1,5 mM hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu ile 32 ° C arasındaki bir sıcaklıkta gerçekleştirildi.
Bazal kontraktilite özellikleri
Zaman zirve, hızı seğirme, seğirme kuvvet genliği için bazal kontraktilite özelliklerini, parametrelerini karakterize etmek ve gevşeme 50 saat (yarım maksimal gevşeme zamanı (% 5 bazal itibaren maksimum kasılma kuvveti ulaşmak için gereken süre olarak tanımlanır); gerekli süre olarak tanımlandı ) gevşeme kuvveti yarısını ulaşmak bu protokolde kullanılır. Tw bir temsilci izkaşıntı ve bu parametrelerin analizi Şekil 3A-B'de gösterilmiştir.
Kalsiyum bağımlı kontraktilite
Hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu önemlisi kalp uyarım-kasılma kaplin belirler ve bu parametreyi değiştirerek, kardiyomiyositlerde kontraktil cihazının kalsiyum duyarlılığı değerlendirilebilir. Şekil 3C değişmiş seğirme kuvvet nesil sonradan değişmiş kalsiyum geçici hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu sonuçlarının güçlendirme ve görüldüğü gibi. Hücre dışı çözelti kalsiyum konsantrasyonu (7 mm 1.5 arasında, örneğin,) adım adım artırılır. Bu protokolü uygulayarak, kontraktil cihazının kalsiyuma bağımlı kasılma ile ilgili olarak kalsiyum homeostazı değerlendirilebilir. Bu yazıda kullanılan organ banyosu kurulumunda, hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu değişimi organ banyosu solut değiştirilerek gerçekleştirildiiyon elle yapay postrest potansiyasyonu sonradan pacing kısa bir kesinti giden ve (non-pace aradan sonra Kuvvetleri kuvvetlenmesine bakınız).
Olmayan pace aradan sonra Kuvvetleri potansiyasyon (PRP)
Bir daralma döngüsü kalsiyum sonunda bu şekilde diastolde sitozolik kalsiyum konsantrasyonunun düşürülmesi, sarcoplasmatic ağırlıklı bir ATP-bağımlı kalsiyum pompası ile retikulum (SR) (serca, sarko-endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz) içinde sekestre edilir. İki kasılmalar arasında zaman aralığı genişlemiş ise, daha fazla kalsiyum SR geri pompalanır ve daha sonra daha kalsiyum sonraki uyarma sırasında serbest bırakılabilir. Postrest-potensiyalizasyon protokolü (PRP) tanımlanmış bir süre dinlenme dönemi ile önceki stimülasyon sonrasında seğirme kuvvet genlik değişiklikleri açıklar. Insan, sıçan ve fare kalp doku olarak, seğirme bir kuvvet büyütme gördü 10,12-14,16 (
Frekans bağımlı kontraktilite (FFR)
Kuvvet-frekans ilişkisi yenerek oranı ve kasılma kuvveti seğirme (Bowditch etkisi) 18 arasındaki ilişkiyi açıklar. Kuvvet-frekans ilişkisi anlamlı memeli türler ve deneysel koşullar 19 arasında değişmektedir. Farelerde, dayak oranı ve kasılma gücü arasında belirli bir ilişki gördü. FFR stimülasyon 9-12 (Şekil 3E) 1-4 Hz aralığında pozitif olduğu gösterilmiştir, oysa 32 ° C 'de, 0,1-1 Hz uyarılması oranları arasında bir ilk negatif FFR, gördü.
Başarısız myoca içindehızını dayak ve kontraktilite 20,21 açıklanan arasında negatif korelasyon rdium. Bu yazıda, standart hızı-frekansı (1 Hz), 0.1 Hz indirgenir ve oradan itibaren pacing frekans adım adım 5 Hz yükseltilir (0.2; 0.5; 1, 2, 3, 4, 5 Hz).
beta-adrenerjik uyarı
Adrenalin ve noradrenalin gibi katekolaminlerin β-adrenoreseptörlerin aktivasyonu ile kalp kasılma gücü modüle (patolojik) fizyolojik stres koşullarında sırasında açığa çıkan hormonlardır. Katekolaminlerin Yatrojenik uygulama geçici kalp inotropiyi geliştirmek için akut kalp yetersizliği olan hastaların klinik tedavisinde önemli bir rol oynar. Bu etki, aynı zamanda görülebilir ve in vitro çalışmalarda araştırılabilir. Β-adrenoseptörlerinin bir agonisti olarak, İzoprenalin kontraktil seğirme gücünü daha da arttırır. İn vivo koşullarında, dayak sıklığında bir artış meydana gelir (pozitif inotropik tesir), buradaayrıca kasılma yanıtı (Bowditch etkisi, aynı zamanda FFR protokol yukarıda açıklanan bakınız) modüle eder. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, İzoprenalin inotropik etkisi, kronotropik etki (Şekil 3F) olmaksızın sabit dayak oranda araştırılabilir. Β-adrenoseptörlerinin uyarılması da histamin gibi diğer hormonlar tarafından elde edilebilir. Sıçangil ventriküler dokusunda, bir başlangıç pozitif bir inotropik tesiri içerir, ancak seyirme kuvvet geçici bir düşüş ile Şekil 3G de gösterildiği gibi bir iki fazlı cevap histamin sonuçların uygulanması. Bu nedenle histamin uygulaması ile ölçülen verilerin yorumlanması zor gibi görünüyor; Özellikle farelerde yatan reseptör aktivasyonu tamamen çözülmüş değil.
İskemik koşullar
Akut kardiyak iskemi oksijen ile kalp dokusunun bir yetersiz giden kan akımının sınırlı kritik olarak tanımlanmıştır vekontraktilite kaybı, iskemik kontraktürü, hücre ölümü ile sonuçlanan geliştirilmesi besin. In vitro olarak iskemi simüle etmek için, kas glukoz, 30 dakika maruz kalır ve pirüvat içermeyen hücre dışı çözelti, 95 N% 05/02 CO% 2 ile kabarmış. Bu yaklaşımla kardiyomiyositlerin ATP bir tükenmesi teşvik edilmelidir. Iskemi-simülasyon başladıktan sonra birkaç dakika içinde, seğirme kuvvet düşüş önyükleme gerilim (Şekil 3H) bir spontan artış olarak resmedilmiştir iskemik kontraktürü görünümü ile oluşur.
Tablo 1: Bileşenler ve kullanılan tampon çözeltilerin konsantrasyonları.
/>
Tablo 2: Önerilen deneysel protokollerin listesi izole papiller kas hazırlıkları kalp kasılmasını araştırmak.
Şekil papiller kas hazırlık 1. Kilit adımlar. Her iki kulakçıklar (A) Diseksiyon. Sol ventrikül anterior papiller kas (B) Görünüm. Ventriküler duvara papiller kas (C) Diseksiyon. (D) organ banyosu odasında tespitten önce iki ipek ipliği Ek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
6fig2.jpg "/>
Şekil 2. Organ banyosu kurulumu. Organ banyosu kurulumu (A) şematik bir ayar. Havalandırma cam hammaddesi karışımları ile donatılmış su ceketi organ banyosu odaları kararlı sıcaklık kontrolü sağlar. Kare dalga darbeleri üretmek için alan elektrotlar, doku destek bağlıdırlar. Bir güç dönüştürücü bu şekilde üretilen sinyalin amplifiye kas kasılmasını algılar. Bu sinyal, filtre edilmiş ve bir A / D konvertörü tarafından bilgisayara geri aktarılır. Daha sonra sinyal sayısallaştırılmış ve daha sonraki analizler için kaydedilebilir. Organ banyosu kurulumu (C) organ banyosu odasına sabit tek bir papiller kas hazırlık (B) Resim. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
pg "/>
Şekil fare sol ön papiller kasların kontraktilite ölçümleri 3. Temsilcisi sonuçları. (A) seğirme kuvvet genliği Temsilcisi analizi, Zaman gerginliği (TTP) ve tek bir seğirme yarım maksimal gevşeme zamanı (R 50) tepe. Tanımlı dinlenme aralıkları (post dinlenme kuvvetlenmesi, PRP) (D), ya da farklı sırasında, hücre dışı kalsiyum konsantrasyonlarını (C) artan sırasında 1 Hz (B) bir dayak oranıyla bazal stimülasyon altında fare papiller kas hazırlıkları uyarılan seyirmesi Temsilcisi kayıtları, stimülasyon oranları (kuvvet-frekans ilişkisi, FFR) (E) ve Isoprenaline- (F) ya da Histamin-uygulama (G) artan konsantrasyonları sonrası uygulama. Iskemi-stimülasyon (H) sırasında uyarılan seyirmesi ve ön Temsilcisi kaydı.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kasılma parametrelerinin Şekil 4. analizi. Seğirme kuvvet genliği (yükseklik), gerginlik (TTP) zirve zamanı ve yarım maksimal gevşeme zamanı (R sırasıyla 50 / TFall) de dahil olmak üzere parametreler yazılımı kullanarak bu protokolde incelendiğinde, kasılma fonksiyonunu karakterize etmek için Program Grafik 5.5 (ADInstruments). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda farelerde kalp fizyolojisi ve patoloji ile ilişkili çok sayıda bilimsel sorulara cevap olarak transgenik hatların analizi ve yeni farmasötik yaklaşımların keşfedilmesi desteklemek için kullanılabilir in vitro fare papiller kas kontraktilitesini araştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır Kalp bozuklukları tedavi etmek için. Biz kalp kası kasılma, fizyolojik, patolojik ve farmakolojik özelliklerini değerlendirmek için bu yöntemin kullanımını göstermektedir (Şekil 3'e bakın). Ek uygulamalar Burada gösterilen farklı farmakolojik maddeler kullanılarak hücre içi yollar değerlendirilmesini içermez (ayrıca 12 bakınız).
Iskemik kalp hastalığı ve kalp yetmezliği gibi kalp hastalıkları seçkin bir klinik sorun görüntülemek ve tüm dünyada 22 mortalite ve morbidite için önde gelen nedenidir kalır. Kalp ifade birçok protein için, kalp kasılmasında onların rolü hala olduğunul tam olarak anlaşılamamıştır veya şimdiye kadar okumamış. İzole papiller kaslar üzerinde kontraktilite ölçüm fare modellerinde in vitro kardiyak kontraktiliteyi incelemek için anlamlı ve geçerli bir yaklaşım gösteriyor.
Yöntem başarısını sağlamak için gerekli birçok kritik adımlar vardır, teknik olarak mümkün olduğu ve iyi bir tekrarlanabilirlik göstermesine rağmen: Birincisi, kalbi izole sonra, düzgün (görselleştirme) çalışabilmek için hazırlık prosedürü sırasında kan ücretsiz bir çözüm sunuyor. Başka kritik bir adım doku hazırlama herhangi dokunmadan kaçınarak veya papiller kas gerilmesi ile canlılığı sağlamak için özenle yapılır olmasıdır. Yöntem bölümünde açıklandığı gibi, ipek iplik sorunsuz bir eki sağlamak için papiller kas bağlı kapak yelken tutmaya çalışın. Organ banyosu odasında hazırlık tespit edildikten sonra, BDM dışarı floş ilk dakika boyunca organ banyosu çözüme birkaç kez değiştirin. Yükseltileceğiseğirme gücü artık bir artış meydana gelene kadar hafifçe ve yavaş yavaş hazırlık gösteriş se. Böyle aritmi yener ve iskemik koşullar için bir işaret olarak gösteriş kendiliğinden arttıkça tek protokollerin değerlendirilmesi için bazı dışlama ölçütü vardır. Yeni Hazırlama örneği kasılma madde aracılı etkilerin analizi için kullanılabilir oysa bu postrest potansiyasyonu ve kuvvet frekans ilişkisi gibi çeşitli deneysel protokol, aynı preparat örneği ile gerçekleştirilebilir. Hazırlık protokolü sol ön papiller kas izole etmek için optimize edilmiştir. Protokolü uyarlanması, posterior kas kasılması ölçümlerin bu yöntem için kullanılabilir.
İzole papiller kas ölçümü Bu yöntem, çeşitli kalsiyum, ısıya ve frekans bağımlı kontraktilite ile ilgili bilgilerin yanı sıra ilgili farmakolojik ajanları veya sim uyguladıktan sonra kontraktil tepkisi sağlarpatolojik durumların ulation. Ancak, bu sonuçların yorumlanması ve ekstrapolasyon bilimsel dikkatle ele alınması gerekiyor. Açıklanan yöntem normal çevre ve nöral inervasyon kopuk kalp kasının bir in vitro modeldir. Bu nedenle, deneysel koşullar fizyolojik değildir ve bu protokolde alınan sonuçlar in vivo duruma derinlemesine yorumlanması olmadan transfer edilemez. Örneğin, yöntem kan basıncı, hormon veya dışsal nöral kontrolünde değişiklikleri dikkate almaz. Organ banyosu içinde hazırlanması için, oksijen ve metabolik takviyeleri kaynağı difüzyon ile sınırlıdır. Oksijen ve metabolik takviyeleri yetersiz arz iskemik koşullarda ve daha sonra geçersiz deneysel sonuçlara yol açacak. Bunu önlemek için, deney koşulları, özellikle, organ banyosu çözeltisi oksijenasyon, kalsiyum konsantrasyonu ve sıcaklığı ile ilgili olarak, uygun olmalıdır.Protokol Deney koşulları Burada tanımlanan ile, geçerli bir sonuç elde edilebilir.
Bu yazıda, iskemik koşullarını taklit için bir yöntem tarif edilmektedir. Ayrıca hipoksi simülasyon, organ banyosu çözümünün tüm enerjik takviyeleri mümkün olduğunca iyi in vivo iskemik devleti taklit etmek tükenmiş. Hipoksi aksine, oksijen ve enerji kaynağının eş zamanlı tükenmesi vivo 23 görülen değişikliklere benzer kalsiyum geçici değişikliklere neden olduğu gösterilmiştir.
Fare papiller kas izolasyonu için tarif edilen prosedür, diğer türler, örneğin, sıçan adapte edilebilir. Ancak organ banyosu kurulumu optimal koşullar farklı hayvan modelleri arasında değişebilir ve adapte edilebilir. Adaptasyonunu gerekebilir parametreler sıcaklık ve fizyolojik çözelti kalsiyum konsantrasyonu vardır.
Summary Bu kontraktilite yöntemi, kalp fizyolojisi, patofizyoloji ve farmakoloji değerlendirmek için çok güçlü bir yaklaşım sağlar. Doğru kullanıldığında, bu bir izole ama iyi kontrollü bir ortamda kardiyak kontraktilite çalışma olanağı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.
Acknowledgments
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodeling-Prozessen", 1638 / 1-2 FR) tarafından Kalp ve Damar Araştırma, Sağlık Araştırma Merkezleri Alman bir kısmı için DZHK (Almanca Merkezi tarafından desteklenen Bir BMBF (Eğitim ve Araştırma Alman Bakanlığı) girişimi) olan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Hazard statement H 302, solve in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Hazard statement H 315-H319-H335 |
| Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335 |
References
- Endoh, M. Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers. Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Bers, D., Despa, S. M. Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response. Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).
- Bers, D. M. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
- Pieske, B., et al. al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium. Basic Res Cardiol. 92, Suppl 1. 75-86 (1997).
- Corbin, J. Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart. Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).
- Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip. Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).
- Näbauer, M., et al. Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts. Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).
- Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle. J Physiol. 507, 175-184 (1998).
- Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).
- Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type. Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).
- Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice. JMCC. 74, 307-317 (2014).
- Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation. J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).
- Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure. Basic Res Cardiol. 97, Suppl 1. 163-171 (2002).
- Koch-Weser, J., Blinks, J. R. The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility. Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).
- Bocalini, D. S. Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay. Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).
- Juggi, J. S. Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart. J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).
- Lakatta, E. G. Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy. Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).
- Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human. Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).
- Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. The force-interval relationship in human myocardium. J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).
- Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3rd, Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium. JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).
- Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud. Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).
- Lee, J. A., Allen, D. G. Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle. Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).
