चूहे में कार्डिएक Inotropy की जांच के लिए पृथक इल्लों से भरा हुआ मांसपेशियों पर सिकुड़ना माप

Summary

Murine बाएं निलय मस्सेदार पेशी इन विट्रो में हृदय सिकुड़ना जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस लेख में विस्तार से अलगाव और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल हृदय सिकुड़ा विशेषताओं का अध्ययन करने का वर्णन है।

Abstract

वयस्क माउस दिलों से अलग मस्सेदार पेशी विभिन्न शारीरिक / रोग की स्थिति के दौरान हृदय सिकुड़ना अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सिकुड़ा विशेषताओं स्वतंत्र रूप से इस तरह के संवहनी चटक या neurohumoral स्थिति के रूप में बाहरी प्रभावों का मूल्यांकन किया जा सकता है। यह अलग हृदय myocytes के साथ एकल कक्ष मापन के बीच और इकोकार्डियोग्राफी तरह विवो अध्ययन में एक वैज्ञानिक दृष्टिकोण को दर्शाया गया है। एक शानदार मॉडल हृदय शरीर क्रिया विज्ञान / पैथोफ्य्सिओलोजी अध्ययन करने के लिए और औषधीय एजेंटों द्वारा मॉडुलन या ट्रांसजेनिक पशु मॉडल का अन्वेषण तरह की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता के रूप में इस प्रकार, मस्सेदार मांसपेशियों की तैयारी की सेवा। यहाँ, हम एक अंग स्नान सेटअप में हृदय सिकुड़ना जांच करने के लिए murine बाईं पूर्वकाल मस्सेदार मांसपेशियों को अलग-थलग करने की एक विधि का वर्णन है। वेंट्रिकुलर दीवार से अलग एक मांसपेशी पट्टी तैयारी के विपरीत, मस्सेदार मांसपेशियों मांसपेशी tissu को नुकसान पहुँचाए बिना पूर्ण रूप से तैयार किया जा सकतागंभीर रूप से ई। अंग स्नान सेटअप कई तापमान नियंत्रित, मार डाला और इलेक्ट्रोड सुसज्जित अंग स्नान कक्षों के होते हैं। पृथक मस्सेदार पेशी अंग स्नान कक्ष में तय की और विद्युत प्रेरित है। पैदा की चिकोटी बल इस तरह के बल आयाम चिकोटी और कैनेटीक्स विश्लेषण कर रहे हैं चिकोटी के रूप में एक दबाव transducer और मापदंडों का उपयोग कर दर्ज की गई है। विभिन्न प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल ऐसे catecholamines या अन्य दवाइयों के रूप में सिकुड़ा एजेंटों की कैल्शियम और आवृत्ति पर निर्भर सिकुड़ना और साथ ही खुराक प्रतिक्रिया घटता जांच करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, तीव्र ischemia तरह वैकृत शर्तों प्रेरित किया जा सकता है।

Introduction

हृदय सिकुड़ना के लिए उनकी भूमिका की चर्चा करते हुए आयन चैनलों की तरह प्रोटीन की जांच अलग pathomechanisms की खोज करने के लिए और इस तरह ischemia और दिल की विफलता के रूप में हृदय रोगों के लिए नए चिकित्सकीय रणनीति की स्थापना के लिए आवश्यक है।

स्तनधारी cardiomyocytes के सिकुड़ा समारोह विभिन्न आयन चैनल, ट्रांसपोर्टरों और अन्य प्रोटीन द्वारा संग्राहक जा करने के लिए जाना जाता है। संभावित कार्रवाई ²⁺ चैनलों को बाह्य अंतरिक्ष से सीए ² तांता की ओर जाता है और बाद में सीए ² के लिए सेलुलर संकुचन ² चलाता है जो सीए ² रिलीज (CICR) ^1, प्रेरित सीए वोल्टेज निर्भर sarcolemmal एल प्रकार की सक्रियता का असर रहा। शारीरिक और पैथोलोजिकल तनाव को हृदय सिकुड़ना और रूपांतर में एक केंद्रीय भूमिका निभाता -signaling सीए ^2। Catecholamines इस प्रकार शिविर synthesizes जो adenylyl साइक्लेस (एसी) उत्तेजक, हृदय β एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स को सक्रिय करें। सक्रिय किया जा रहा, proteiएन सीए ^{2 +} यात्रियों और हृदय सिकुड़ना ^1,3,4 के संशोधन में जिसके परिणामस्वरूप एल प्रकार सीए ² चैनलों, phospholamban और ryanodine रिसेप्टर्स की तरह अलग अलग intracellular और झिल्ली जुड़े प्रोटीन phosphorylates ए (PKA) kinase। शिविर फॉस्फोडाइस्टरेज़ (PDE) द्वारा अपमानित किया जाता है। Β-अद्रेनोसप्तोर्स के अलावा अन्य जी एस-युग्मित रिसेप्टर्स की सक्रियण भी शिविर का संचय होता है।

पृथक वेंट्रिकुलर पेशी स्ट्रिप्स में सिकुड़ना माप की तकनीक अच्छी तरह से बड़ा स्तनधारी प्रजातियों ^5-8 के लिए स्थापित किया गया है। जीन की संभावना चूहों में लक्षित के आधार पर यह murine हृदय शरीर विज्ञान का विश्लेषण करने के तरीकों को स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, चूहों में अलग पेशी तैयारियों के शारीरिक गुणों के बारे में मौजूदा डेटा प्रयोगात्मक शर्तों ^9-12 पर निर्भर करती है।

वर्णित विधि बाएं निलय मस्सेदार पेशी पूर्व के हृदय सिकुड़ना का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता हैइन विट्रो में parations। हृदय सिकुड़ना की जांच रक्तचाप, neurohumoral उत्तेजना और शारीरिक या चयापचय तनाव की तरह विवो में हृदय सिकुड़ना, संशोधित प्रभावों के अभाव में किया जाता है। करार पेशी तैयारी की पिटाई दर कड़ाई से परिभाषित किया है और मनमाने ढंग से बदला जा सकता है। चिकोटी बल विशिष्ट जैसे कैल्शियम एकाग्रता के रूप में उत्तेजनाओं, आवृत्ति या तापमान की धड़कन के संदर्भ में विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि अलग संकेतन मार्ग घटकों की जांच करने के लिए और उपरोक्त प्रयोगात्मक शर्तों को नियंत्रित करने से आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के हृदय प्रदर्शन की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

नोट: अलगाव की प्रक्रिया की बुनियादी कदम चित्रा 1 में दिखाया जाता है सभी चरणों का पालन प्रोटोकॉल में विस्तार से बताया गया है।। मस्सेदार मांसपेशी अलगाव, अंग स्नान कक्ष में बढ़ते, अधिग्रहण और विश्लेषण एक लगातार और अनिवार्य समयमान वेतनमान में किया जाता है।

सभी पशु प्रयोगों जानवरों के संरक्षण पर जर्मन कानून के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और हीडलबर्ग विश्वविद्यालय के आचार समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया।

इंस्ट्रूमेंटेशन के 1. तैयारी

1. सिकुड़ना के लिए माप एक multichambered अंग स्नान सेटअप का उपयोग करें। एक पूर्व vivo सिकुड़ना अंग स्नान सेटअप के घटक चित्रा 2 में दिखाया गया है।
   नोट: मस्सेदार मांसपेशियों की तैयारी और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की शुरुआत के बीच समय की राशि है, की स्थापना उपकरण को कम करने और प्रयोगात्मक tissue.This एकत्रित प्रदान करता करने के बफ़र्स से पहले तैयार करने के लिएऊतक प्रयोगों का संचालन करने के लिए व्यवहार्य रहता है कि समय की सबसे बड़ी राशि तों।
2. कंप्यूटर और डाटा अधिग्रहण उपकरण स्टार्ट अप। अंग स्नान गर्मी (पूर्व निर्धारित करने के लिए 32 डिग्री सेल्सियस) पर मुड़ें और पूर्व निर्धारित तापमान करने के लिए इकाइयों की अनुमति देते हैं।
3. अधिग्रहण उपकरण तैयार करें। सॉफ्टवेयर के मैनुअल में वर्णित के रूप में डेटा रिकॉर्डिंग शुरू।
4. चेक और हर चैनल पर (यदि आवश्यक) अंशांकन आचरण और एक प्रमाणित वजन द्वारा आपूर्ति की 2-जी बल को (उस चैनल के साथ जुड़े) संबंधित बल ट्रांसड्यूसर से आपूर्ति बिजली के संकेत के मानकीकरण के लिए सभी चैनलों शून्य।
5. अंग स्नान कक्षों के लिए गैस की आपूर्ति (95% ₂ हे / 5% सीओ ₂₎ चालू करें। लगातार पूरे प्रोटोकॉल माप के दौरान सभी कक्षों गैस।

बफ़र और शारीरिक समाधान की 2. तैयारी

1. 119 मिमी NaCl के अंतिम सांद्रता को प्राप्त करने के लिए एक क्रेब्स-Henseleit बफर समाधान तैयार है; 25 मिमी ₃ NaHCO; 4.6 मिमी KCl; 11mm ग्लूकोज; 1 मिमी ना-Pyruvate; 1.5 मिमी CaCl _2; 1.64 मिमी ₄ MgSO; 1.18 मिमी के.एच. _{2 4} पीओ और (तालिका 1 शारीरिक समाधान देखें) 7.4 पीएच को समायोजित करें।
2. अतिरिक्त 30mm 2,3-Butanedione monoxime (BDM) और 50 आईई हेपरिन / एमएल के साथ 2.1 चरण में वर्णित के रूप में अलगाव के दौरान उपयोग करने के लिए अलग क्रेब्स-Henseleit बफर समाधान तैयार है। 4 डिग्री सेल्सियस (1 टेबल तैयारी समाधान देखें) को शांत समाधान। तालिका 1 में वर्णित के रूप में ischemia के अनुकरण के लिए, ischemia-समाधान तैयार है।
3. सीए ^{2 +} के प्रोटोकॉल के लिए ^- निर्भर सिकुड़ना, अनुरोध अंतिम एकाग्रता के लिए क्रेब्स-Henseleit बफर समाधान करने के लिए सीए ² जोड़ें।
   नोट: सीधे इसके उपयोग से पहले इन समाधान तैयार है और Calciumcarbonate की वर्षा से बचने के लिए carbogen साथ Gass। उपयोग करने से पहले 32 डिग्री सेल्सियस तक prewarm समाधान।

इल्लों से भरा हुआ उच्छेदन प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल बक ट्यूब और विच्छेदन डिश की 3. तैयारी

1. एक नरम गैस कनेक्टविशेषज्ञ काम करने के साथ गैस कनेक्शन (100% ऑक्सीजन, वैकल्पिक carbogen) के लिए ट्यूब (बाहरी व्यास 2-4 मिमी) गाते हैं।
2. विच्छेदन डिश के अंदर फिटिंग बक ट्यूब के एक बंद अंगूठी बनाएँ। बक ट्यूब एक सतत बुदबुदाती आश्वासन दिया है कि कई बार पंचर। यह बक ट्यूब कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है।
3. पिन इसे में अटक जा सकता है, ताकि नीचे (0.5 सेमी मोटी) पर एक सिलिकॉन elastomer के साथ विच्छेदन पकवान तैयार करें। यह पकवान कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है।

चूहे से वाम पूर्वकाल इल्लों से भरा हुआ स्नायु 4. अलगाव

नोट: मस्सेदार पेशी के अलगाव शुरू करने से पहले, गैस लाइनों रुकावटों का स्पष्ट कर रहे हैं कि जाँच करें।

1. मस्सेदार मांसपेशियों की तैयारी शुरू करने से पहले प्रोटोकॉल अनुभाग में 1-3 के रूप में उल्लेख अंग स्नान सेटअप तैयार करें। प्रयोग के दिन पर सभी समाधान तैयार करें।
2. ग्रीवा अव्यवस्था accordi द्वारा (लगभग 8-12 सप्ताह पुराने) माउस बलिदानविशेषज्ञ काम और संस्थागत दिशा निर्देशों के एनजी।
3. Forepaws फिक्सिंग से पृष्ठीय स्थिति में पशु ठीक करने और एक विच्छेदन बोर्ड पर पंजे हिन्द, तेज हड्डी कैंची से पसलियों के माध्यम से काटने से दोनों पक्षों पर छाती पार्श्व खोलने, तो एक आड़ा कटौती के साथ डायाफ्राम काटा। पेरीकार्डियम निकालें। अब दिल और महाधमनी पहुंच रहे हैं।
4. दिल के करीब संवहनी truncus पर कुंद संदंश के साथ दिल को ठीक करने और फेफड़ों से कैंची और आसपास के ऊतकों के साथ जल्दी से दिल अलग।
5. ऑक्सीजन (2.2 कदम) के साथ मार डाला ठंडा तैयारी समाधान के साथ भरा एक पेट्री डिश के लिए दिल की धड़कन स्थानांतरण। दिल की धड़कन और संदंश के साथ हृदय सुप्रीम छू के माध्यम से धीरे हृदय के संकुचन को उत्तेजित करने की अनुमति दें।
6. जैसे ही दिल पूरी तरह से exsanguinous है, ओ ₂ के साथ ठंडा तैयारी समाधान (2.2 कदम) से भरा है और मार डाला विच्छेदन डिश को हस्तांतरण। उपयोग पर यह कदम एक stereomicroscope से।
7. Hea फिक्सदिल (सही वेंट्रिकल ऑपरेटर की दृष्टि से सही पक्ष पर स्थित है) पृष्ठीय से देखा जाता है, ताकि सही वेंट्रिकल के माध्यम से एक छोटा सा पिन के साथ RT।
8. का प्रयोग microsurgical कैंची निलय से ऊतक को जोड़ने, एट्रियोवेंट्रीकुलर स्तर पर दोनों अटरिया में कटौती को अलग किया और त्यागें। किसी भी यांत्रिक दबाव से बचने के दिल के शीर्ष करने के लिए ए वी-वाल्व-स्तर से वेंट्रिकुलर दीवार के माध्यम से एक कट प्रदर्शन।
9. वेंट्रिकल खोलें और इस प्रकार बाएं निलय मस्सेदार मांसपेशियों दोनों पर एक नज़र रखने, संदंश के साथ बाईं तरफा मुक्त दीवार को ठीक।
10. थोड़ा मस्सेदार पेशी तैयारी पर वाल्वुलर पाल का एक हिस्सा संरक्षण बाईं पूर्वकाल मस्सेदार पेशी के दोनों किनारों पर निलय ऊतक पार्श्व दूर कटौती और छूने से बचें या जितना संभव हो उतना मस्सेदार मांसपेशी खींच। मस्सेदार पेशी से शेष वेंट्रिकुलर दीवार ऊतक काटना।
11. मस्सेदार पेशी प्रस्तुत करने के लिए दोनों पक्षों पर संलग्न रेशम धागे (7/0, मीट्रिक 0.5)aration, वाल्वुलर पाल पर एक और पहलवान भाग पर एक। तापमान 32 डिग्री सेल्सियस का सुझाव दिया है, के रूप में अंग स्नान समाधान से भरा है और carbogen के साथ मार डाला अंग स्नान कक्ष में तैयारी को ठीक करें।

इल्लों से भरा हुआ स्नायु 5. संतुलन और उत्तेजना

1. तुरंत अंग स्नान में निर्धारण के बाद 1 हर्ट्ज की उत्तेजना आवृत्ति पर आयताकार दालों (2 एमएस की अवधि और 100 मा की वर्तमान) के साथ मस्सेदार पेशी तैयारी उत्तेजित।
2. निरंतर परिवर्तन से या इस्तेमाल अंग स्नान प्रकार के सेटअप के अनुसार लगातार मैनुअल परिवर्तन (हर 5 मिनट) द्वारा, या तो अंग स्नान समाधान के एक लगातार परिवर्तन किया जाता है।
3. पर पहुंच में धीरे-धीरे अधिक से अधिक चिकोटी बल जब तक गुमान वृद्धि हुई है। गुमान की वृद्धि चिकोटी बल में एक और वृद्धि से पालन नहीं किया जाता है, जब अधिकतम चिकोटी बल पहुंच गया है।
4. संतुलन के 45-60 मिनट के बाद, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल शुरू करते हैं।

नोट: नीचे दिये प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत हृदय सिकुड़ना को चिह्नित करने के लिए मानक युद्धाभ्यास शामिल हैं। प्रतिनिधि भाग में हम भी प्रतिनिधि परिणाम दिखा विस्तार में इन प्रोटोकॉल का वर्णन (भी 2 टेबल देखें)।

1. रिकॉर्डिंग और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का विश्लेषण
   1. रिकॉर्डिंग के लिए, पर्याप्त अस्थायी समाधान (अधिग्रहण दर ≥ 1kHz) के साथ एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
   2. चिकोटी बल आयाम (ऊंचाई), तनाव (टीटीपी) और (उदाहरण के रूप में चित्रा 4 देखें, ADInstruments की 5.5 चार्ट) सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के रूप में उल्लेख आधा अधिक से अधिक विश्राम का समय (आर ₅₀ क्रमशः / TFall,) शिखर करने के लिए समय सहित मापदंडों का विश्लेषण।

Representative Results

पृथक murine मस्सेदार मांसपेशियों की तैयारियों का सिकुड़ना मापन के लिए इस पांडुलिपि के प्रोटोकॉल शारीरिक शर्तों के तहत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक परिणामों को प्राप्त करने के लिए इष्टतम स्थितियों को देखते है। इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों को परिभाषित करने के लिए हम अंग स्नान तापमान और बाह्य कैल्शियम एकाग्रता (भी ¹² देखें) बदलती पायलट प्रयोगों का प्रदर्शन किया। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल 1.5 मिमी कोशिकी कैल्शियम एकाग्रता और 32 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ प्रदर्शन किया गया था।

बेसल सिकुड़ना गुण

समय पीक करने के लिए, दर चिकोटी, चिकोटी बल आयाम के लिए बेसल सिकुड़ना गुण, मापदंडों को चिह्नित करने के लिए और आराम के 50 समय (आधा अधिक से अधिक विश्राम का समय (5% बेसल से शुरू अधिक से अधिक संकुचन बल तक पहुँचने के लिए आवश्यक समय के रूप में परिभाषित), के लिए आवश्यक समय के रूप में परिभाषित ) छूट बल के आधे तक पहुंचने इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कर रहे हैं। TW का एक प्रतिनिधि ट्रेसitches और इन मापदंडों का विश्लेषण चित्रा 3 ए-बी में सचित्र हैं।

कैल्शियम पर निर्भर सिकुड़ना

कोशिकी कैल्शियम एकाग्रता महत्वपूर्ण हृदय उत्तेजना-संकुचन युग्मन निर्धारित करता है और इस पैरामीटर अलग से, cardiomyocytes में सिकुड़ा तंत्र की कैल्शियम संवेदनशीलता का मूल्यांकन किया जा सकता है। चित्रा 3 सी में बदल चिकोटी बल पीढ़ी में बाद में बदल दिया कैल्शियम यात्रियों में कोशिकी कैल्शियम एकाग्रता परिणामों की वृद्धि और दिखाया गया है। कोशिकी समाधान की कैल्शियम एकाग्रता (7 मिमी 1.5 के बीच, यानी) कदम-दर-कदम बढ़ जाती है। इस प्रोटोकॉल को लागू करके, सिकुड़ा तंत्र की कैल्शियम पर निर्भर सिकुड़ना के बारे में कैल्शियम हेमोस्टेटिस मूल्यांकन किया जा सकता है। इस पांडुलिपि में इस्तेमाल अंग स्नान सेटअप में, बाह्य कैल्शियम एकाग्रता के परिवर्तन अंग स्नान solut बदलते द्वारा किया गया थाआयन मैन्युअल एक कृत्रिम postrest potentiation करने के लिए बाद में पेसिंग की एक छोटी सी रुकावट के लिए अग्रणी और (गैर पेसिंग अंतराल के बाद सेना potentiation देखें)।

गैर पेसिंग अंतराल के बाद सेना potentiation (पीआरपी)

एक संकुचन चक्र कैल्शियम के अंत में इस प्रकार पाद लंबा दौरान साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता कम करने, sarcoplasmatic मुख्य रूप से एक एटीपी निर्भर कैल्शियम पंप द्वारा जालिका (एसआर) (SERCA, SARCO-जालिका कैल्शियम ATPase) में तनहा है। दो संकुचन के बीच समय अंतराल बढ़ा है, और अधिक कैल्शियम एसआर में वापस पंप किया जा सकता है और बाद में अधिक कैल्शियम अगले उत्तेजना के दौरान जारी की जा सकती है। postrest-potentiation प्रोटोकॉल (पीआरपी) एक निर्धारित अवधि के बाकी अवधि के साथ पिछले एक उत्तेजना के बाद चिकोटी बल आयाम के परिवर्तन का वर्णन है। मानव में, चूहे के रूप में अच्छी तरह से murine हृदय के ऊतकों के रूप में, चिकोटी बल की एक वृद्धि दिखाया गया था ^10,12-14,16 ( 13,14,16,17 के हृदय के ऊतकों में नाकाम रहने में भी प्रतिकूल है कि जाना जाता है। इस प्रोटोकॉल इंट्रासेल्युलर दुकानों ^4,15 में डायस्टोलिक कैल्शियम संचय के समारोह का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

आवृत्ति पर निर्भर सिकुड़ना (FFR)

सेना आवृत्ति संबंध की धड़कन की दर और सिकुड़ा चिकोटी बल (Bowditch प्रभाव) ¹⁸ के बीच संबंध का वर्णन करता है। बल आवृत्ति संबंध काफी स्तनधारी प्रजातियों और प्रयोगात्मक शर्तों ¹⁹ के बीच अलग है। चूहों में, धड़कन की दर और संकुचन शक्ति के बीच एक विशेष संबंध दिखाई गई थी। FFR उत्तेजना ^9-12 (3E चित्रा) 1-4 हर्ट्ज की रेंज में सकारात्मक होना दिखाया गया था जबकि 32 डिग्री सेल्सियस, 0.1-1 हर्ट्ज की उत्तेजना दरों के बीच एक प्रारंभिक नकारात्मक FFR, दिखाया गया था।

नाकाम रहने myoca मेंदर पिटाई और सिकुड़ना ^20,21 वर्णित है के बीच एक नकारात्मक सहसंबंध rdium। इस पांडुलिपि में, मानक पेसिंग आवृत्ति (1 हर्ट्ज) 0.1 हर्ट्ज तक कम हो जाता है और वहाँ से शुरू, पेसिंग आवृत्ति संवर्द्धित 5 हर्ट्ज के लिए उठाया है (0.2; 0.5; 1, 2, 3, 4, 5 हर्ट्ज)।

β एड्रीनर्जिक उत्तेजना

एड्रेनालाईन और noradrenaline तरह Catecholamines β-अद्रेनोसप्तोर्स की सक्रियता के द्वारा हृदय सिकुड़ा बल नियमन (patho-) शारीरिक तनाव की स्थिति के दौरान जारी किया जाता है, जो हार्मोन हैं। Catecholamines की Iatrogenic आवेदन अस्थायी रूप से हृदय inotropy बढ़ाने के लिए तीव्र दिल की विफलता के साथ रोगियों का चिकित्सीय उपचार में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। इस आशय भी देखा है और इन विट्रो अध्ययन में जांच की जा सकती है। Β-अद्रेनोसप्तोर्स की एक agonist के रूप में, Isoprenaline सिकुड़ा चिकोटी बल बढ़ जाती है। Vivo में, धड़कन आवृत्ति में वृद्धि भी होती है (सकारात्मक inotropic प्रभाव), जोइसके अतिरिक्त सिकुड़ा प्रतिक्रिया (Bowditch प्रभाव भी FFR प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित देखें) modulates। यहाँ वर्णित विधि का प्रयोग, Isoprenaline की inotropic प्रभाव है कि क्रोनोट्रॉपिक प्रभाव (3F चित्रा) के बिना एक निश्चित की धड़कन दर पर जांच की जा सकती है। β-अद्रेनोसप्तोर्स की उत्तेजना भी इस तरह के हिस्टामिन के रूप में अन्य हार्मोन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। Murine निलय ऊतक में, एक प्रारंभिक सकारात्मक inotropic प्रभाव होता है, लेकिन चिकोटी बल में एक क्षणिक गिरावट के साथ चित्रा 3 जी में दिखाया गया है जो एक Biphasic जवाब में हिस्टामिन परिणामों के आवेदन। कारण है कि हिस्टामिन के आवेदन के द्वारा मापा डेटा की एक व्याख्या मुश्किल प्रतीत हो रहा है; विशेष रूप से चूहों में अंतर्निहित रिसेप्टर सक्रियण पूरी तरह हल नहीं है।

इस्केमिक की स्थिति

तीव्र हृदय ischemia ऑक्सीजन के साथ हृदय के ऊतकों की undersupply के लिए अग्रणी रक्त के प्रवाह का एक महत्वपूर्ण सीमा के रूप में परिभाषित किया गया है औरसिकुड़ना की हानि, इस्कीमिक contracture और कोशिका मृत्यु के विकास में जिसके परिणामस्वरूप पोषक तत्वों। इन विट्रो में ischemia अनुकरण करने के लिए, मांसपेशियों glucose- करने के लिए 30 मिनट के लिए सामने आ रहे हैं और पाइरूवेट मुक्त कोशिकी समाधान 95% एन _2/5% सीओ ₂ के साथ bubbled। उस दृष्टिकोण के साथ cardiomyocytes में एटीपी की कमी प्रेरित किया जाना चाहिए। Ischemia-अनुकरण शुरू करने के बाद कुछ ही मिनटों के भीतर, चिकोटी बल की गिरावट प्रीलोड तनाव (चित्रा 3H) में एक सहज वृद्धि के रूप में कल्पना एक इस्कीमिक contracture की उपस्थिति के साथ होता है।

तालिका 1: अवयव और इस्तेमाल किया बफर समाधान की सांद्रता।

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तालिका 2: सुझाव प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की सूची पृथक मस्सेदार पेशी तैयारी में हृदय सिकुड़ना जांच करने के लिए।

चित्रा मस्सेदार पेशी तैयारी 1. महत्वपूर्ण कदम। दोनों अटरिया (ए) विच्छेदन। बाएं निलय पूर्वकाल मस्सेदार पेशी पर (बी) देखें। वेंट्रिकुलर दीवार से मस्सेदार पेशी के (सी) विच्छेदन। (डी) अंग स्नान कक्ष में निर्धारण से पहले दो रेशम धागे की कुर्की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2. अंग स्नान सेटअप। अंग स्नान सेटअप के (ए) योजनाबद्ध सेटिंग। वातन कांच frits से लैस जल जैकेट अंग स्नान कक्षों स्थिर तापमान नियंत्रण प्रदान करते हैं। वर्ग तरंग दालों उत्पन्न करने के क्षेत्र इलेक्ट्रोड ऊतक समर्थन से जुड़े होते हैं। एक बल ट्रांसड्यूसर जिससे उत्पन्न संकेत amplifying मांसपेशियों के संकुचन होश। यह संकेत फ़िल्टर और एक ए / डी कनवर्टर से वापस कंप्यूटर को सौंप दिया है। संकेत तो डिजीटल है और बाद में विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है। अंग स्नान सेटअप (सी) से अंग स्नान कक्ष में तय एक भी मस्सेदार पेशी तैयारी (बी) चित्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा murine बाईं पूर्वकाल मस्सेदार मांसपेशियों का सिकुड़ना माप 3. प्रतिनिधि परिणाम है। (ए) चिकोटी बल आयाम के प्रतिनिधि विश्लेषण, समय तनाव (टीटीपी) और एक भी चिकोटी के आधे से अधिक से अधिक विश्राम का समय (आर ₅₀₎ शिखर करने के लिए। परिभाषित आराम कर रही अंतराल (पोस्ट बाकी potentiation, पीआरपी) (डी), या अलग दौरान, कोशिकी कैल्शियम की सांद्रता (सी) में वृद्धि के दौरान 1 हर्ट्ज (बी) के एक पिटाई की दर के साथ बेसल उत्तेजना के तहत murine मस्सेदार पेशी तैयारी के उत्तेजित twitches के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग, उत्तेजना दर (बल आवृत्ति संबंध, FFR) (ई) और Isoprenaline- (एफ) या Histamine आवेदन (जी) की सांद्रता में वृद्धि के बाद आवेदन। Ischemia-उत्तेजना (एच) के दौरान उत्तेजित twitches और प्रीलोड के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग।एस: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सिकुड़ा मापदंडों के चित्रा 4. विश्लेषण। चिकोटी बल आयाम (ऊंचाई), तनाव (टीटीपी) शिखर करने के लिए समय और आधा अधिक से अधिक विश्राम का समय (आर क्रमश: ₅₀ / TFall,) सहित मापदंडों के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण कर रहे हैं, सिकुड़ा समारोह को चिह्नित करने के लिए कार्यक्रम चार्ट 5.5 (ADInstruments)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस पांडुलिपि में हम चूहों में दिल फिजियोलॉजी और विकृति से संबंधित कई वैज्ञानिक सवालों के जवाब देने के साथ ही ट्रांसजेनिक लाइनों का विश्लेषण और नई दवा दृष्टिकोण की खोज का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो इन विट्रो में murine मस्सेदार मांसपेशियों का सिकुड़ना जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन दिल रोग के इलाज के लिए। हम हृदय की मांसपेशी सिकुड़ना की, शारीरिक रोग और औषधीय गुणों का आकलन करने के लिए इस विधि का उपयोग का वर्णन (चित्र 3 देखें)। अतिरिक्त आवेदन यहाँ सचित्र विभिन्न औषधीय एजेंटों का उपयोग कर इंट्रासेल्युलर रास्ते के मूल्यांकन में शामिल नहीं है (यह भी ¹² देखें)।

ऐसे इस्कीमिक हृदय रोग और दिल की विफलता के रूप में हृदय रोगों एक प्रख्यात नैदानिक ​​समस्या को प्रदर्शित करने और दुनिया भर में ²² मृत्यु दर और रुग्णता के लिए प्रमुख कारण बने हुए हैं। दिल में व्यक्त कई प्रोटीन के लिए, हृदय सिकुड़ना के लिए उनकी भूमिका stil हैएल खराब समझ या अब तक अध्ययन नहीं किया। पृथक मस्सेदार मांसपेशियों पर सिकुड़ना माप माउस मॉडल में इन विट्रो में हृदय सिकुड़ना अध्ययन करने के लिए एक सार्थक और वैध दृष्टिकोण को दर्शाता है।

विधि इसकी सफलता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं, तकनीकी रूप से संभव है और एक अच्छा reproducibility से पता चलता है: सबसे पहले, दिल को अलग-थलग करने के बाद ठीक से (दृश्य) के लिए काम करने के लिए सक्षम होने के लिए तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान एक रक्त मुक्त समाधान किया जाता है। एक और महत्वपूर्ण कदम ऊतक तैयारी किसी भी छू से बचने या मस्सेदार मांसपेशियों में खिंचाव से व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से किया जाता है। विधि अनुभाग में वर्णित है रेशम के धागे का एक परेशानी से मुक्त लगाव सुनिश्चित करने के लिए मस्सेदार पेशी से जुड़ा वाल्वुलर पाल रखने का प्रयास करें। अंग स्नान कक्ष में तैयारी के निर्धारण के बाद, BDM बाहर निकलवाने के लिए पहले मिनट के दौरान अंग स्नान समाधान के लिए कई बार बदल जाते हैं। Increaचिकोटी बल का कोई अधिक वृद्धि होती है जब तक थोड़ा और धीरे-धीरे तैयारी का गुमान se। ऐसे arrhythmic धड़कता है और इस्कीमिक की स्थिति के लिए एक संकेत के रूप में गुमान की सहज वृद्धि के रूप में एक प्रोटोकॉल के मूल्यांकन के लिए कुछ बहिष्कार मानदंड हैं। एक नए तैयारी नमूना सिकुड़ना पर दवा की मध्यस्थता प्रभाव के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जबकि इस तरह के postrest potentiation और बल आवृत्ति संबंध के रूप में कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, एक ही तैयारी नमूने के साथ किया जा सकता है। तैयारी प्रोटोकॉल बाईं पूर्वकाल मस्सेदार मांसपेशियों को अलग-थलग करने के लिए अनुकूलित है। प्रोटोकॉल अनुकूल, भी पीछे मांसपेशियों सिकुड़ना माप की इस पद्धति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

पृथक मस्सेदार पेशी माप का यह तरीका विभिन्न कैल्शियम, तापमान और आवृत्ति पर निर्भर सिकुड़ना के बारे में जानकारी के साथ ही बारे में औषधीय एजेंटों या सिम लगाने के बाद सिकुड़ा प्रतिक्रिया प्रदान करता हैरोग की स्थिति की आबादी। हालांकि, इन परिणामों की व्याख्या और एक्सट्रपलेशन वैज्ञानिक सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। वर्णित विधि अपने सामान्य वातावरण और तंत्रिका इन्नेर्वतिओन से काट दिया हृदय की मांसपेशी के इन विट्रो मॉडल है। इसलिए, प्रयोगात्मक शर्तों शारीरिक नहीं कर रहे हैं और इस प्रोटोकॉल में प्राप्त परिणामों विवो में स्थिति के लिए में गहराई से व्याख्या के बिना स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विधि रक्तचाप, हार्मोन या बाह्य तंत्रिका नियंत्रण में परिवर्तन खाते में नहीं ले करता है। अंग स्नान में तैयारी के लिए ऑक्सीजन और चयापचय की खुराक की आपूर्ति प्रसार द्वारा सीमित है। ऑक्सीजन और चयापचय की खुराक की अपर्याप्त आपूर्ति इस्कीमिक की स्थिति और बाद में अमान्य प्रयोगात्मक परिणामों के लिए नेतृत्व करेंगे। इससे बचने के लिए, प्रयोगात्मक शर्तों विशेष रूप से अंग स्नान समाधान की ऑक्सीजन, कैल्शियम की एकाग्रता और तापमान के विषय में, इष्टतम होना चाहिए।प्रोटोकॉल की प्रयोगात्मक शर्तों यहाँ वर्णित के साथ, मान्य परिणाम afforded जा सकता है।

इस पांडुलिपि में ischemia जैसी स्थितियों का अनुकरण करने की एक विधि वर्णित है। इसके अतिरिक्त हाइपोक्सिया का अनुकरण करने के लिए, अंग स्नान समाधान के सभी ऊर्जावान की खुराक के रूप में संभव के रूप में अच्छा विवो में इस्कीमिक राज्य नकल करने के लिए समाप्त हो रहे थे। हाइपोक्सिया के विपरीत, यह ऑक्सीजन और ऊर्जा आपूर्ति के एक साथ कमी विवो ²³ में देखा परिवर्तन करने के लिए तुलनीय कैल्शियम यात्रियों में परिवर्तन की ओर जाता है कि दिखाया गया था।

माउस मस्सेदार पेशी के अलगाव के लिए वर्णित प्रक्रिया अन्य प्रजातियों, जैसे, चूहे लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि अंग स्नान सेटअप का इष्टतम स्थितियों विभिन्न पशु मॉडलों के बीच अलग-अलग हो सकता है और अनुकूलित किया जा सकता है। अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है कि मापदंडों के तापमान और शारीरिक समाधान की कैल्शियम एकाग्रता हैं।

Summar मेंवाई, इस सिकुड़ना विधि दिल शरीर क्रिया विज्ञान, pathophysiology और औषध का आकलन करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है। ठीक से इस्तेमाल किया, यह एक अलग लेकिन अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में हृदय सिकुड़ना अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Sigma-Aldrich	D9434
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	223506
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I5879	Hazard statement H 302, solve in DMSO
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Isoprenaline hydrochloride	Sigma-Aldrich	I5627	Hazard statement H 315-H319-H335
Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml	ratiopharm	PZN 3874685
Histamine dihydrochloride	Sigma-Aldrich	H7250	Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335