Summary
Murine venstre ventrikkel papillær muskel kan brukes til å undersøke kardial kontraktilitet in vitro. Denne artikkelen beskriver i detalj isolering og eksperimentelle protokoller for å undersøke hjerte kontraktile egenskaper.
Abstract
Papillære muskel isolert fra voksne mus hjerter kan brukes til å studere hjertets kontraktilitet i ulike fysiologiske / patologiske tilstander. Sammentrekningene egenskaper kan vurderes uavhengig av ytre påvirkninger som for eksempel vaskulær tonus eller neurohumoral status. Det viser en vitenskapelig tilnærming mellom encellete målinger med isolerte hjertemuskelceller og in vivo studier som ekkokardiografi. Således papillære muskelpreparater tjene som en utmerket modell for å studere kardial fysiologi / patofysiologi og kan anvendes for undersøkelser som modulasjonen av farmakologiske midler eller utforskningen av transgene dyremodeller. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å isolere den murine venstre fremre papillarmuskel å undersøke hjertets kontraktilitet i et organbad oppsett. I motsetning til en muskel strimmel forberedelse isolert fra den ventrikulære veggen, kan den papillære muskelfremstilles in toto uten å skade muskelen tissue alvorlig. Orgelet bad oppsettet består av flere temperaturkontrollerte, gasset og elektrode utstyrt organ bade kamre. Det isolerte papillarmuskel er festet i organbadet kammeret og elektrisk stimulert. Den fremkalte rykk Kraften registreres ved hjelp av en trykktransduser og parametere som rykk og napp kraft amplitude kinetikken blir analysert. Forskjellige eksperimentelle protokoller kan bli utført for å undersøke kalsium- og frekvensavhengig kontraktilitet samt doseresponskurver av kontraktile midler slik som katekolaminer eller andre farmasøytiske midler. I tillegg kan patologiske tilstander som akutt iskemi simuleres.
Introduction
Undersøkelsen av proteiner som ionekanaler referer deres rolle for hjertets kontraktilitet er viktig å oppdage forskjellige pathomechanisms og for å etablere nye terapeutiske strategier for hjertesykdommer slik som iskemi og hjertesvikt.
Kontraktile funksjon av pattedyr kardiomyocytter er kjent for å bli modulert ved forskjellige ionekanaler, transportører og andre proteiner. Aksjonspotensial fremkalt aktivering av spenningsavhengige sarcolemmal L-type Ca 2+ kanaler fører til Ca 2+ tilstrømningen fra ekstracellulære rom og senere til Ca 2+ -indusert Ca 2+ frigjøring (CICR) 1, som utløser cellular sammentrekning to. Ca 2+ -signaling spiller en sentral rolle i hjertekontraksjonen og tilpasning til fysiologisk eller patologisk stress. Katekolaminer aktivere kardiale p-adrenerge reseptorer, og dermed stimulere adenylylcyklase (AC) som syntetiserer cAMP. Aktiveres, Proteinkonn kinase A (PKA) phosphorylates ulike intracellulære og membran assosierte proteiner som L-type Ca 2+ kanaler, phospholamban og ryanodine reseptorer resulterer i endring av Ca 2 + transienter og hjertekontraktilitet 1,3,4. cAMP forringes av fosfodiesterase (PDE). Aktivering av Gs-koblete reseptorer enn p-adrenerge reseptorer også fører til akkumulering av cAMP.
Teknikken med kontraktilitet målinger i isolerte ventrikulære muskelstriper er vel etablert for større pattedyr 5-8. På bakgrunn av muligheten for målretting genet i mus er det viktig å etablere metoder for å analysere murine hjerte fysiologi. Men eksisterende data om de fysiologiske egenskapene til isolerte muskel preparater i mus varierer avhengig av eksperimentelle forhold 9-12.
Den beskrevne metoden brukes til å analysere hjertets kontraktilitet av venstre ventrikkel papillær muskel preparations in vitro. Undersøkelse av hjertets kontraktilitet utføres i fravær av påvirkning modifiser hjertets kontraktilitet in vivo, slik som blodtrykk, neurohumoral stimulering og fysisk eller metabolsk stress. Juling frekvensen av oppdragsgiver muskel forberedelse kan være strengt definert og endret vilkårlig. Nappe kraft kan analyseres i sammenheng med spesifikke stimuli slik som kalsiumkonsentrasjon, slo frekvens eller temperatur. I tillegg kan denne fremgangsmåte benyttes til å undersøke ulike komponenter signalveien, og til å sammenligne hjertefunksjon av genetisk modifiserte musemodeller ved å kontrollere forsøksbetingelser som er nevnt ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: De grunnleggende trinn i isoleringsprosedyren er vist i figur 1. Alle trinn er beskrevet i detalj i den følgende protokoll.. Papillemuskel isolering, montering i organbad kammer, innsamling og analyse er utført i en sammenhengende og obligatorisk tidsskala.
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til tysk lovgivning om vern av dyr og ble godkjent av Etisk Review Board of Universitetet i Heidelberg.
1. Utarbeidelse av Instrumentation
- For kontraktilitet målinger bruke en multichambered organbad oppsett. Komponenter av en ex vivo contractility organbad oppsettet er vist i figur 2.
MERK: For å minimere mengden tid mellom utarbeidelsen av papillær muskel og begynnelsen av forsøksprotokoll, sette opp utstyr og forberede buffere før samle eksperimentelle tissue.This innsamlingsløses den største mengden av tid at vevet fortsatt er forsvarlig å utføre eksperimenter. - Start maskinen og datainnsamlingsutstyr. Slå på organbad varme (forhåndsinnstilt til 32 ° C) og la enhetene til innstilt temperatur.
- Forberede anskaffelse av utstyr. Start opptak data som nevnt i programvarehåndboken.
- Kontroller og gjennomføre kalibrering (om nødvendig) på hver kanal og null alle kanaler for å standardisere det elektriske signal som tilføres fra de respektive krafttransduktor (assosiert med denne kanalen) til en 2 g kraft som leveres av en sertifisert vekt.
- Slå på gasstilførselen (95% O 2/5% CO2) til organbadet kamre. Kontinuerlig gass alle kamrene under hele protokoll målinger.
2. Utarbeidelse av buffere og fysiologiske Solutions
- Forbered en Krebs-Henseleit buffer løsning for å oppnå sluttkonsentrasjoner på 119 mM NaCl; 25 mM NaHCO3; 4,6 mm KCl; 11mm glukose; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl2; 1,64 mM MgSO4; 1,18 mM KH 2PO 4 og juster pH til 7,4 (se tabell 1 Fysiologisk oppløsning).
- Forbered separat Krebs-Henseleit buffer-oppløsning til bruk ved isolering som beskrevet i trinn 2.1 med ytterligere 30 mM 2,3-butandionmonoksim (BDM) og 50 IE heparin / ml. Avkjøl løsningen til 4 ° C (se tabell 1 Fremstilling løsning). For ischemi simulering, fremstille ischemi-løsning som beskrevet i tabell 1.
- For protokollen til Ca 2 + - avhengige kontraktilitet, tilsett Ca 2+ i Krebs-Henseleit bufferoppløsning til ønskede sluttkonsentrasjon.
MERK: forberede disse løsningene direkte før bruken og gass med carbogen å unngå utfelling av Calciumcarbonate. Prewarm løsning til 32 ° C før bruk.
3. Klargjøring av Gassing Tube og Dissection oppvask brukt under Papillary Eksisjon Prosedyre
- Koble en myk gasssynge rør (utvendig diameter 2-4 mm) til gass tilkobling (100% oksygen, carbogen alternativt) med ekspert jobber.
- Lag en lukket ring av gassing rør montering inne i disseksjon parabolen. Punktere gassing røret flere ganger at en sammenhengende bobler er sikret. Dette gassing rør kan benyttes flere ganger.
- Forbered disseksjon parabolen med en silisium elastomer nederst (0,5 cm tykk), slik at pinnene kan bli sittende fast i den. Denne retten kan brukes flere ganger.
4. Isolering av Venstre Anterior papillarmuskel fra Mus
MERK: Før du starter isolering av papillemuskel, sjekk at gass linjene er klare for blokkeringer.
- Forbered organbad oppsett som nevnt i protokollen § 1-3 før utarbeidelsen av papillemusklene. Forbered alle løsninger på dagen for forsøket.
- Ofre mus (ca 8-12 uker gammel) ved halshugging according til ekspert arbeids- og institusjonelle retningslinjer.
- Fix dyret i ryggposisjon ved å fikse forpotene og hind labbene på en disseksjon bord, åpne thorax side på begge sider ved å kutte gjennom ribbene med skarpe bein saks, og deretter klippe membranen med en tverrgående kutt. Fjern hjerteposen. Nå hjertet og aorta er tilgjengelige.
- Fest hjerte med sløv tang på vaskulær truncus nær hjertet og skille hjertet raskt med saks fra lungene og omkringliggende vev.
- Overfør det bankende hjertet til en petriskål fylt med avkjølt forberedelse løsning gasset med oksygen (trinn 2.2). La hjertet til å slå og stimulere hjerte sammentrekninger mykt via berøre hjerte apex med pinsett.
- Så snart hjertet er helt exsanguinous, overføre den til disseksjon tallerken fylt med avkjølt fremstillingen oppløsning (trinn 2.2) og gasset med O 2. Fra dette trinnet på bruk et stereomikroskop.
- Fest heart med en liten nål gjennom høyre ventrikkel slik at hjertet er sett fra rygg (høyre ventrikkel ligger på høyre side fra fører visning).
- Bruke mikro saks skille begge atriene på atrioventricular nivå, kuttet koble vev fra ventriklene og kast. Utføre et snitt gjennom den ventrikulære veggen fra AV-ventil-nivå til spissen av hjerte unngår enhver mekanisk trykk.
- Åpne ventrikkel og fikse venstre-sidig fri vegg med pinsett, og dermed ha en titt på både venstre ventrikkel papillemusklene.
- Litt klippe bort den ventrikulære vevet lateralt på begge sider av den venstre fremre papillarmuskel bevare en del av ventil seil på papillærmuskelen fremstillingen og unngå å berøre eller strekke den papillære muskel så mye som mulig. Dissekere værende ventrikulære veggen vev fra papillær muskel.
- Fest silke (7/0, metrisk 0,5) på begge sider av papillarmuskel prepFraskilling, en på klaffe seil og en på det muskulære delen. Fest preparatet i organbadet kammer fylt med organbadet løsning og gasset med karbogen, når temperaturen 32 ° C er foreslått.
5. Ekvilibrering og Stimulering av papillarmuskel
- Stimulere den papillære muskel preparat med rektangulære pulser (varighet 2 ms og strøm på 100 mA) ved stimulering frekvens på 1 Hz umiddelbart etter fiksering i organbadet.
- Sikre en hyppig endring av orgelet bad løsning, enten ved kontinuerlig endring eller ved hyppig manuell endring (hvert 5 min) i henhold til oppsettet av organbad typen som brukes.
- Gradvis øke pretensjon inntil maksimal rykk kraft i nådd. Maksimal rykk kraft er nådd når økningen av pretensjon ikke følges av en ytterligere styrking i rykk kraft.
- Etter 45-60 min av likevekt, starter den eksperimentelle protokollen.
MERK: Den eksperimentelle protokollen beskrevet nedenfor omfatter standard manøvrer for å karakter hjertekontraksjonen under fysiologiske og patofysiologiske forhold. I representative delen beskriver vi disse protokollene i detalj viser også representative resultater (se også tabell 2).
- Registrering og analyse av forsøksprotokoller
- For opptak, bruk egnet programvare med tilstrekkelig tidsmessig oppløsning (erverv hastighet ≥ 1 kHz).
- Analysere parametere inkludert rykk kraft amplitude (høyde), tid til maksimal spenning (TTP) og halvparten av maksimal avslapning tid (R 50 / TFall, henholdsvis) som nevnt i programmet (som eksempel Figur 5.5 av ADInstruments, se figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen fra dette manuskriptet for kontraktilitet målinger av isolerte murine papillarmuskel forberedelser er innstilt til optimale forhold for å oppnå reproduserbare eksperimentelle resultater under fysiologiske forhold. For å definere optimale forsøksbetingelser vi gjennomført pilotforsøk varierende organbad temperatur og ekstracellulært kalsium konsentrasjon (se også 12). Protokollen er beskrevet her ble utført med en ekstracellulær kalsiumkonsentrasjon på 1,5 mM og en temperatur på 32 ° C.
Basal kontraktilitet eiendommer
For å karakterisere basal sammentrekningsegenskaper, parametere for rykk kraft amplitude, twitch hastighet, tiden til maksimal (definert som den tid som kreves for å nå maksimal kontraksjon kraft starte fra 5% basal) og avslapning 50 tid (halv maksimal relaksasjonstid, definert som tiden som kreves for å nå halvparten av velvære kraft) er brukt i denne protokollen. En representant spor av twklør og analysen av disse parametrene er illustrert på figur 3A-B.
Kalsiumavhengig kontraktilitet
Ekstracellulære kalsiumkonsentrasjon i avgjørende grad bestemmer hjerte eksitasjon-sammentrekning kobling og ved å variere denne parameteren, kan kalsiumfølsomheten for kontraktile apparat i kardiomyocytter evalueres. Som vist i figur 3C styrking av de ekstracellulære kalsiumkonsentrasjon resulterer i endrede kalsium transienter og deretter i endrede trekning kraft generasjon. Den kalsium-konsentrasjonen av den ekstracellulære oppløsningen økes trinn for trinn (dvs. mellom 1,5 til 7 mM). Ved å bruke denne protokollen, kan det kalsiumhomeostase om kalsiumavhengig kontraktilitet av det kontraktile apparat skal evalueres. I organbadet oppsettet som brukes i dette manuskriptet, ble endringen av den ekstracellulære kalsiumkonsentrasjonen utføres ved å endre organbadet solution manuelt fører til en kort avbrudd i pacing og senere til en kunstig postrest potensering (se Force potensering etter ikke-pacing intervall).
Force potensering etter ikke-pacing intervall (PRP)
Ved slutten av en syklus sammentrekning kalsium blir sekvestrert i sarcoplasmatic retikulum (ER) hovedsakelig av en ATP-avhengige kalsium pumpe (SERCA, Sarco endoplasmatiske retikulum-kalsium-ATPase), for således å senke cytosolisk kalsiumkonsentrasjonen under diastole. Dersom tidsintervallet mellom to riene blir forstørret, kan mer kalsium pumpes tilbake inn i SR, og deretter mer kalsium kan frigis i løpet av de neste eksitasjon. Den postrest-potense protokollen (PRP) beskriver endringer i rykk kraft amplitude etter en tidligere stimulering med hvileperiode på en definert varighet. I human, rotte, så vel som i murine hjertevev, en økning av den kraft trekning ble vist 10,12-14,16 (
Frekvensavhengig kontraktilitet (FFR)
Force-frekvens forhold beskriver sammenhengen mellom slo rate og kontraktile rykk kraft (Bowditch effekt) 18. Den kraft: frekvens forhold signifikant forskjellig mellom pattedyrarter og eksperimentelle forhold 19. Hos mus ble det en bestemt sammenheng mellom slagfrekvens og sammentrekning styrke vist. Ved 32 ° C, ble en innledende negativ FFR mellom stimuleringshastigheter på 0,1-1 Hz er vist, mens den FFR ble vist å være positive i området 1-4 Hz for stimulering 9-12 (figur 3E).
I sviktende myocardium en negativ korrelasjon mellom slo rate og kontraktilitet er beskrevet 20,21. I dette manuskriptet, er standard pacing-frekvens (1 Hz) redusert til 0,1 Hz og starter derfra, er pacing-frekvensen gradvis hevet til 5 Hz (0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 Hz).
p-adrenerge stimulering
Katekolaminer som adrenalin og noradrenalin er hormoner som frigjøres under (patho-) fysiologiske stressbetingelser modulerhjertesammentrekningskraft ved aktivering av p-adrenerge reseptorer. Iatrogenic anvendelse av katekolaminer spiller en fremtredende rolle i klinisk behandling av pasienter med akutt hjertesvikt å forbedre hjerte inotropi midlertidig. Denne effekten kan også bli sett og undersøkt i in vitro studier. Som en agonist av p-adrenerge reseptorer, øker isoprenalin kontraktil kraft rykk. In vivo, en økning i å slå frekvens også forekommer (positiv inotrop effekt), hvilkeni tillegg modulerer den kontraktile respons (Bowditch effekt, se også FFR protokollen beskrevet ovenfor). Ved å bruke den fremgangsmåten som er beskrevet her, kan den inotrope effekt av isoprenalin bli undersøkt ved å slå en fast hastighet uten at kronotrop effekt (figur 3F). Stimulering av p-adrenerge reseptorer kan også oppnås ved andre hormoner slik som histamin. I murine ventrikulær vev, anvendelse av histamin resulterer i en bifasisk respons som inneholder en første positiv inotrop effekt, men med et forbigående fall i rykk kraft, som vist på figur 3G. Av den grunn en tolkning av data målt ved bruk av histamin synes å være vanskelig; spesielt den underliggende reseptor-aktivering i mus ikke er helt løst.
Iskemiske betingelser
Akutt hjerte-ischemi er definert som en kritisk begrensning av blodstrømmen som fører til undersupply av hjertevevet med oksygen ognæringsstoffer som resulterer i tap av kontraktilitet, utvikling av iskemisk kontraktur og celledød. For å simulere ischemi in vitro, blir musklene utsettes i 30 minutter for å glukose- og pyruvat-fri ekstracellulær løsning gjennomboblet med 95% N2 / 5% CO2. Med det opplegget uttømming av ATP i cardiomyocytes bør induseres. Innen få minutter etter start av iskemi-simulering, oppstår en nedgang i rykk kraft med utseendet til en iskemisk kontraktur avbildet som en spontan økning i preload spenningen (figur 3 H).
Tabell 1: Komponenter og konsentrasjoner av de anvendte bufferoppløsninger.
/>
Tabell 2: Liste over foreslåtte eksperimentelle protokoller for å undersøke hjertets kontraktilitet i isolerte papillarmuskel forberedelser.
Figur 1. Hoved trinnene i papillarmuskel forberedelse. (A) Disseksjon av både atriene. (B) Vis på venstre ventrikkel anterior papillarmuskel. (C) Disseksjon av papillær muskel fra den ventrikulære veggen. (D) Montering av to silke før fiksering i organbad kammeret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6fig2.jpg "/>
Figur 2. Organ bad oppsett. (A) Skjematisk innstilling av orgelet bad oppsett. Vann jakke organ badekamre utstyrt med lufteglass frits gi stabil temperaturkontroll. For å generere firkantbølge-pulser feltelektrodene er festet til vevet støtte. En kraft transduseren avføler sammentrekning av muskelen for derved å forsterke det genererte signal. Dette signalet blir filtrert og overført tilbake til datamaskinen ved hjelp av en A / D-omformer. Signalet er deretter digitalisert og kan lagres for senere analyser. (B) Bilde av en enkelt papillarmuskel forberedelse fast i organbadet kammeret fra organbad setup (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
pg "/>
Figur 3. Representative resultatene av kontraktilitet målinger av murine venstre fremre papillarmusklene. (A) Representant analyse av rykk kraft amplitude, Tid til maksimal spenning (TTP) og halvparten av maksimal avslapning tid (R 50) av en enkelt napp. Representative opptak av stimulert rykninger av murine papillarmuskel forberedelsene henhold basal stimulering med juling hastighet på 1 Hz (B), under økende ekstracellulære kalsiumkonsentrasjoner (C), under definerte hvileintervaller (post resten potensering, PRP) (D), eller annen stimuleringsfrekvens (force-frekvens relasjon, FFR) (E) og etter anvendelse av økende konsentrasjoner av Isoprenaline- (F) eller Histamin-søknad (G). Representant opptak av stimulerte rykninger og forspenning under iskemi-stimulering (H).s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Analyse av kontraktile parametere. Å karakter kontraktile funksjon, parametere inkludert rykk kraft amplitude (høyde), tid til maksimal spenning (TTP) og halvparten av maksimal avslapning tid (R 50 / TFall, henholdsvis) er analysert i denne protokollen bruker programvaren Programmet Chart 5.5 (ADInstruments). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet beskriver vi en fremgangsmåte for å undersøke kontraktilitet av murine papillære muskel in vitro, som kan brukes til å svare på flere vitenskapelige spørsmål relatert til hjerte fysiologi og patologi hos mus, samt å understøtte analyse av transgene linjer og oppdagelsen av nye farmasøytiske tilnærminger å behandle hjerte dysfunksjoner. Vi illustrerer bruken av denne metoden for å vurdere fysiologiske, patologiske og farmakologiske egenskapene til hjertemuskelen kontraktilitet (se figur 3). Andre programmer som ikke er illustrert her inkluderer evaluering av intracellulære trasé ved hjelp av ulike farmakologiske midler (se også 12).
Hjertesykdommer såsom ischemisk hjertesykdom og hjertesvikt viser en fremragende klinisk problem og forblir den ledende årsaken til dødelighet og sykelighet i verden 22. For mange proteiner uttrykt i hjertet, er deres rolle for hjertekontraksjonen still dårlig forstått eller ikke studert før nå. Kontraktilitet måling på isolerte papillarmusklene viser en meningsfylt og gyldig metode for å studere hjertets kontraktilitet in vitro hos mus.
Selv om metoden er teknisk mulig, og viser en god reproduserbarhet, er det flere viktige trinn som er nødvendige for å sikre dens suksess: For det første, etter isolering av hjertet, sikre en blod fri løsning under fremstillingsprosedyren til å være i stand til å fungere ordentlig (visualisering). Et annet kritisk punkt er at vevet forberedelse utføres nøye for å sikre levedyktighet ved å unngå enhver berøring eller strekking av papillær muskel. Som beskrevet i fremgangsmåten seksjonen forsøker å holde ventil seil som er koblet til den papillære muskelen for å sikre en feilfri fastgjøring av silketråd. Etter fiksering av preparatet i organbadet kammeret, endrer organbadet oppløsningen flere ganger i løpet av de første minutter for å spyle ut BDM. IncreaSE pretensjon av kjemikaliet litt og gradvis til det ikke mer økning på napp kraft oppstår. Det er noen eksklusjonskriteriene for vurdering av de enkelte protokoller som arrhythmic beats og spontan økning av pretensjon som et tegn for iskemiske forhold. Flere eksperimentelle protokoller som postrest potensering og kraft-frekvens forhold kan utføres med det samme preparatet prøven, mens en ny prøve preparatet skal brukes for analyse av medikament-medierte effekter på kontraktilitet. Fremstillingen protokollen er optimalisert for å isolere den venstre fremre papillær muskel. Tilpasning av protokoll, også det bakre muskel kan anvendes for denne metode for kontraktilitet målinger.
Denne metoden for isolerte papillarmuskel måling gir forskjellig informasjon om kalsium-, temperatur- og frekvensavhengig kontraktilitet samt om kontraktilresponsen etter påføring farmakologiske midler eller simgler av patologiske tilstander. Imidlertid må tolkning og ekstrapolering av disse resultatene skal håndteres med vitenskapelig omsorg. Den beskrevne metode er en in vitro modell for hjertemuskelen, koplet fra sitt normale miljø og neural innervasjon. Derfor de eksperimentelle forholdene ikke er fysiologiske og de mottatte i denne protokollen resultatene kan ikke overdras uten dyptgående tolkning av situasjonen i vivo. For eksempel ikke metoden tar ikke hensyn til endringer i blodtrykk, hormoner eller ytre nevrale kontroll. Tilførselen av oksygen og metabolske kosttilskudd for fremstilling i organbadet er begrenset av diffusjon. En utilstrekkelig tilførsel av oksygen og metabolske tillegg ville føre til iskemiske tilstander og deretter ugyldige eksperimentelle resultater. For å unngå dette, bør forsøksbetingelsene være optimal, spesielt når det gjelder oksygenering, kalsiumkonsentrasjon og temperatur i organbadet løsningen.Med de eksperimentelle betingelsene for protokollen som er beskrevet her, kan gyldige resultater gis.
I dette manuskriptet en metode for å simulere iskemi-lignende tilstander, er beskrevet. I tillegg til simulering av hypoksi, ble alle energisk tilskudd av organbadet oppløsning utarmet for å etterligne den iskemiske tilstand in vivo så godt som mulig. I motsetning til hypoksi, ble det vist at den samtidige reduksjon av oksygen og energitilførsel fører til endringer i kalsium transienter sammenlignbare endringer sees in vivo 23.
Den fremgangsmåte som er beskrevet for isolering av muse-papillarmuskel kan tilpasses til andre arter, for eksempel, rotte. Men de optimale betingelser for organbadet oppsett kan variere mellom ulike dyremodeller, og kan tilpasses. Parametere som kan trenge tilpasning er temperaturen og kalsiumkonsentrasjonen i fysiologisk oppløsning.
I summary, gir dette kontraktilitet metoden en svært kraftig metode for å vurdere hjerte fysiologi, patofysiologi og farmakologi. Når det brukes riktig, gir det muligheten til å studere hjertets kontraktilitet i et isolert, men godt kontrollert miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelling-Prozessen", FR 1 638 / 1-2) og ved DZHK (tysk Senter for Cardiovascular Research, en del av de tyske Centres of Health Research , som er en BMBF (tysk Kunnskapsdepartementet) initiativ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Hazard statement H 302, solve in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Hazard statement H 315-H319-H335 |
| Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335 |
References
- Endoh, M. Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers. Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Bers, D., Despa, S. M. Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response. Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).
- Bers, D. M. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
- Pieske, B., et al. al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium. Basic Res Cardiol. 92, Suppl 1. 75-86 (1997).
- Corbin, J. Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart. Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).
- Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip. Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).
- Näbauer, M., et al. Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts. Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).
- Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle. J Physiol. 507, 175-184 (1998).
- Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).
- Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type. Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).
- Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice. JMCC. 74, 307-317 (2014).
- Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation. J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).
- Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure. Basic Res Cardiol. 97, Suppl 1. 163-171 (2002).
- Koch-Weser, J., Blinks, J. R. The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility. Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).
- Bocalini, D. S. Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay. Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).
- Juggi, J. S. Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart. J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).
- Lakatta, E. G. Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy. Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).
- Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human. Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).
- Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. The force-interval relationship in human myocardium. J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).
- Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3rd, Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium. JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).
- Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud. Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).
- Lee, J. A., Allen, D. G. Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle. Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).
