Summary
Murint venstre ventrikel papillær muskel kan anvendes til at undersøge hjertets kontraktilitet in vitro. Denne artikel beskriver i detaljer isolation og forsøgsprotokoller til at studere hjerte-kontraktile egenskaber.
Abstract
Papillærmuskel isoleret fra voksne mus hjerter kan anvendes til at studere hjertets kontraktilitet under forskellige fysiologiske / patologiske tilstande. De kontraktile egenskaber kan vurderes uafhængigt af ydre påvirkninger såsom vaskulær tonus eller neurohumorale status. Det forestiller en videnskabelig tilgang mellem enkelt celle målinger med isolerede hjertemyocytter og in vivo studier som ekkokardiografi. Således papillærmuskel præparater tjene som en glimrende model til at studere hjertets fysiologi / patofysiologi og kan anvendes til undersøgelser som modulationen af farmakologiske midler eller udforskning af transgene dyremodeller. Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af murine venstre forreste papillærmuskel at undersøge hjertets kontraktilitet i et organbad setup. I modsætning til en muskelstrimlen præparat isoleret fra den ventrikulære væg, kan papillærmusklen fremstilles i toto uden at beskadige musklen tissue alvorligt. Organbadet setup består af flere temperaturkontrollerede, gasset og elektrodernes udstyret organbad kamre. Det isolerede papillarmuskel er fastgjort i organbadet kammeret og elektrisk stimuleret. Den fremkaldte twitch kraft registreres ved hjælp af en tryktransducer og parametre såsom spjæt kraftamplituden og spjæt kinetik analyseres. Forskellige forsøgsprotokoller kan udføres for at undersøge calcium- og frekvensafhængig kontraktilitet samt dosisresponskurver af kontraktile midler, såsom katekolaminer eller andre lægemidler. Derudover kan patologiske tilstande som akut iskæmi simuleres.
Introduction
Undersøgelsen af proteiner som ionkanaler henviser deres rolle for hjerte-kontraktilitet er afgørende for at opdage forskellige patomekanismer og fastsætte nye terapeutiske strategier for hjertesygdomme såsom iskæmi og hjertesvigt.
Kontraktile funktion af mammale cardiomyocytter vides at blive moduleret af forskellige ionkanaler, transportører og andre proteiner. Potentiel handling fremkaldt aktivering af spænding afhængig sarcolemmal L-typen Ca 2 + kanaler fører til Ca2 + indstrømning fra ekstracellulære rum og senere til Ca 2 + induceret Ca 2+ frigivelse (CICR) 1, som udløser cellulære 2 sammentrækning. Ca 2+ -signaling spiller en central rolle i hjertets sammentrækningsevne og tilpasning til fysiologisk eller patologisk stress. Katekolaminer aktiverer hjerte- p-adrenerge receptorer og derved stimulere adenylylcyklase (AC), som syntetiserer cAMP. Aktiveres, Protein kinase A (PKA) phosphorylerer forskellige intracellulære og membran associerede proteiner ligesom L-type Ca 2 + kanaler, phospholamban og ryanodine receptorer resulterer i ændring af Ca 2 + transienter og hjerte-kontraktilitet 1,3,4. cAMP nedbrydes af phosphodiesterase (PDE). Aktivering af andre end p-adrenoceptorer Gs-koblede receptorer fører også til akkumulering af cAMP.
Teknikken med kontraktilitet målinger i isolerede ventrikulære muskelstrimler er veletableret for større pattedyrarter 5-8. Baseret på muligheden for gen-targeting i mus er det vigtigt at etablere metoder til at analysere murine cardiac fysiologi. Men eksisterende data om de fysiologiske egenskaber af isolerede præparater muskel i mus varierer afhængigt af eksperimentelle betingelser 9-12.
Den beskrevne metode anvendes til at analysere hjertets kontraktilitet af venstre ventrikels papillærmuskel prepræparater in vitro. Undersøgelse af hjertets kontraktilitet udføres i fravær af påvirkninger ændring hjertets kontraktilitet in vivo, ligesom blodtryk, neurohumoral stimulering og fysisk eller metabolisk stress. Den bankende sats for den ordregivende muskel præparat kan strengt defineres og ændres vilkårligt. Spjæt kraft kan analyseres i sammenhæng med specifikke stimuli såsom calcium koncentration, slå frekvens eller temperatur. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at undersøge forskellige signalvej komponenter, og at sammenligne hjertets funktion af genetisk modificerede musemodeller ved at styre eksperimentelle betingelser nævnt ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: De grundlæggende trin i isoleringsproceduren er vist i figur 1 Alle trin er beskrevet detaljeret i den følgende protokol.. Papillærmusklen isolation, montering i organbadet kammer, indsamling og analyse udføres i en fortløbende og obligatorisk tidshorisont.
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med tysk lovgivning om beskyttelse af dyr, og blev godkendt af den etiske Review Board for universitetet i Heidelberg.
1. Fremstilling af Instrumentation
- For kontraktilitet målinger bruger en flerkammer organbadet setup. Komponenter i en ex vivo kontraktilitet organbad opsætning er vist i figur 2.
BEMÆRK: For at minimere mængden af tid mellem udarbejdelsen af papillærmusklen og begyndelsen af forsøgsprotokollen, der er nedsat udstyr og forberede buffere forud for indsamlingen af eksperimentelle tissue.This provides den største mængde tid, at vævet forbliver rentabelt at udføre eksperimenter. - Start computeren, og dataopsamling udstyr. Tænd Organbadet varme (forudindstillet til 32 ° C), og lad enheder til forudindstillede temperatur.
- Forbered købet udstyr. Begynder at optage data som nævnt i softwaren manual.
- Kontroller og foretage kalibrering (om nødvendigt) på hver kanal og nul alle kanaler at standardisere det elektriske signal tilføres fra de respektive krafttransducer (forbundet med denne kanal) til en 2-g kraft leveret af en certificeret vægt.
- Tænd gasforsyningen (95% O 2/5% CO2) til organbad kamre. Kontinuerligt gas alle kamre under hele protokol målinger.
2. Fremstilling af buffere og fysiologiske opløsninger
- Forbered en Krebs-Henseleit buffer løsning til at opnå endelige koncentrationer på 119 mM NaCl; 25 mM NaHCO3; 4.6 mM KCI; 11mm glucose; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl2; 1,64 mM MgSO4; 1,18 mM KH 2 PO 4 og justere pH til 7,4 (se tabel 1 fysiologisk opløsning).
- Forbered separat Krebs-Henseleit buffer løsning til at bruge under isolation som beskrevet i trin 2.1 med yderligere 30 mM 2,3-butandion monoxim (BDM) og 50 IE heparin / ml. Cool opløsning til 4 ° C (se tabel 1 Fremstilling opløsning). For iskæmi simulation, forberede iskæmi-opløsning som beskrevet i tabel 1.
- Til protokollen af Ca 2 + - afhængig kontraktilitet, tilføj Ca2 + til Krebs-Henseleit bufferopløsning til anmodet endelig koncentration.
BEMÆRK: forberede disse løsninger direkte for dens brug og gass med carbogen at undgå udfældning af calciumcarbonat. Forvarm løsning på 32 ° C før brug.
3. Forberedelse af gasningen Tube og Dissektion Dish bruges under papillære Excision Procedure
- Tilslut en blød gassynge rør (ydre diameter 2-4 mm) til gas-forbindelse (100% ilt, carbogen alternativt) med ekspert arbejder.
- Opret en lukket ring af gasning rørfitting inde dissektion skålen. Punktere gasning røret flere gange, at en kontinuerlig boblende er sikret. Denne gasning rør kan bruges flere gange.
- Forbered dissektion skål med en silikoneelastomer nederst (0,5 cm tyk), således at stifterne kan blive hængende i den. Denne ret kan bruges flere gange.
4. Isolering af venstre forreste papillærmuskel fra mus
BEMÆRK: Før du starter isolation papillærmusklen, kontrollere, at gasledningerne er fri for blokeringer.
- Forbered Organbadet setup som nævnt i protokollen afsnit 1-3, før du starter forberedelsen af de papillære muskler. Forberede alle løsninger på dagen af forsøget.
- Ofre mus (8-12 uger gamle) ved cervikal dislokation according til ekspert arbejde og institutionelle retningslinier.
- Fastgør dyret i dorsale position ved fastsættelse af forpoterne og Hind poter på en dissektion bord, åbne thorax laterale på begge sider ved at skære gennem ribbenene med skarpe knogle saks, derefter skæres membranen med et tværgående snit. Fjern pericardium. Nu hjerte og aorta er tilgængelige.
- Fastgør hjerte med stump pincet på den vaskulære truncus tæt på hjertet og adskille hjertet hurtigt med en saks fra lungerne og det omgivende væv.
- Overfør det bankende hjerte til en petriskål fyldt med afkølet forberedelse løsning gasset med ilt (trin 2.2). Lad hjertet til at slå og stimulere hjerte sammentrækninger sagte via berøring af hjerte-spids med en pincet.
- Så snart hjertet er helt exsanguinous, overføre det til dissektion fad fyldt med afkølet forberedelse løsning (trin 2.2) og gasset med O 2. Fra dette trin på brug et stereomikroskop.
- Fastgør heart med en lille nål gennem højre hjertekammer, således at hjertet er set fra dorsale (højre hjertekammer er beliggende på højre side fra operatørens visning).
- Brug af microsurgical saks adskille begge forkamre på atrioventrikulær niveau, klippe forbinder væv fra hjertekamrene og kassér. Udfør et snit gennem ventrikelvæggen fra AV-ventil-plan til hjertespidsen undgå mekanisk tryk.
- Åbn ventriklen og løse venstre-sidet fri væg med pincet, og dermed have et kig på både venstre ventrikulære papillære muskler.
- Lidt skåret væk den ventrikulære væv laterale på begge sider af den venstre forreste papillærmusklen bevare en del af valvulær sejl på papillærmusklen forberedelse og undgå at røre eller strække papillærmusklen så meget som muligt. Dissekere resterende ventrikelvæg væv fra papillærmusklen.
- Vedhæft silketråde (7/0, metrisk 0,5) på begge sider af papillærmusklen prepredelsen, en på valvulær sejl og en på muskulære del. Fastgør forberedelse i organbadet kammer fyldt med organbadet løsning og gasset med carbogen, da temperaturen 32 ° C er foreslået.
5. Ligevægtsindstilling og Stimulering af papillærmusklen
- Stimulere papillære forberedelse musklen med rektangulære pulser (varighed på 2 ms og strøm på 100 mA) ved stimulation frekvens på 1 Hz umiddelbart efter optagelsen i organbadet.
- Sikre en hyppig ændring af organbadet løsning, enten ved kontinuerlig forandring eller ved hyppig manuel ændring (hver 5 min) i henhold til opsætningen af organbadet type, der anvendes.
- Gradvist øge verdensrige indtil maksimal spjæt kraft i nået. Maksimal spjæt kraft nås, når stigningen i forspændingen ikke efterfulgt af en yderligere forstærkning i twitch kraft.
- Efter 45-60 minutters ækvilibrering starte forsøgsprotokollen.
BEMÆRK: forsøgsprotokol skitseret nedenfor omfatter standard manøvrer til at karakterisere hjertekontraktiliteten under fysiologiske og patofysiologiske forhold. I den repræsentative afsnit beskrives disse protokoller i detaljer viser også repræsentative resultater (se også tabel 2).
- Registrering og analyse af forsøgsprotokoller
- Til optagelse, brug en passende software med tilstrækkelig tidsmæssig opløsning (erhvervelse på ≥ 1 kHz).
- Analyser parametre, herunder spjæt force amplitude (højde), tid til peak spænding (TTP) og halv maksimal afslapning tid (R 50 / TFall henholdsvis) som nævnt i programmet (som eksempel Figur 5.5 i ADInstruments, se figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen for dette håndskrift for kontraktilitet målinger af isolerede murine papillære muskel præparater er indstillet til optimale betingelser for at opnå reproducerbare forsøgsresultater under fysiologiske betingelser. For at definere optimale eksperimentelle betingelser, vi udførte pilotforsøg varierende organbadet temperatur og ekstracellulær koncentration calcium (se også 12). Den her beskrevne protokol blev udført med et ekstracellulært calcium koncentration på 1,5 mM og en temperatur på 32 ° C.
Basal kontraktilitet egenskaber
For at karakterisere basale kontraktilitet egenskaber, parametre for spjæt kraftamplituden, spjæt, tid til top (defineret som den tid, der kræves for at nå maksimal kontraktion kraft ud fra 5% basal) og afslapning 50 tid (halv maksimal afslapning tid; defineret som tid, der kræves til nå halvdelen af afslapning kraft) anvendes i denne protokol. Et repræsentativt spor af twklør og analyse af disse parametre er illustreret i figur 3A-B.
Calcium-afhængige kontraktilitet
Ekstracellulært calcium koncentration afgørende bestemmer hjertets excitation-kontraktion kobling og ved at variere denne parameter kan calciumfølsomheden kontraktile apparat i cardiomyocytter evalueres. Som vist i figur 3C forstærkning af den ekstracellulære calciumkoncentration resulterer i ændrede calcium transienter og efterfølgende i ændret ryk force generation. Calcium-koncentrationen af den ekstracellulære opløsning forøges trin-for-trin (dvs. mellem 1,5 til 7 mM). Ved at anvende denne protokol, kan calciumhomeostasen om calcium-afhængige kontraktilitet af kontraktile apparat evalueres. I organbadet opspændingssituationen i dette manuskript, blev ændringen af den ekstracellulære calciumkoncentration udføres ved at ændre organbadet solution manuelt fører til en kort afbrydelse af pacing og efterfølgende til en kunstig postrest potensering (se Kraft potensering efter ikke-stimuleringsinterval).
Kraft potensering efter ikke- stimuleringsinterval (PRP)
Ved afslutningen af en sammentrækning cyklus calcium afsondres i sarcoplasmatic reticulum (SR) overvejende af en ATP-afhængig kalciumpumpe (SERCA, Sarco-endoplasmatisk reticulum calcium-ATPase), og dermed sænke den cytosoliske calciumkoncentration under diastole. Hvis tidsintervallet mellem to sammentrækninger er forstørret, kan mere calcium pumpes tilbage i SR og efterfølgende mere calcium kan frigives i løbet af næste excitation. Den postrest-potensering protokol (PRP) beskriver ændringer af twitch force amplitude efter en tidligere stimulering med hvileperiode på en defineret varighed. I mennesker, rotter samt i murine hjertevæv, en udvidelse af twitch kraft blev vist 10,12-14,16 (
Frekvensafhængig kontraktilitet (FFR)
Kraft-frekvens forhold beskriver sammenhængen mellem at slå sats og kontraktile spjæt kraft (Bowditch effekt) 18. Den kraft- frekvens forhold betydeligt forskellig pattedyrarter og eksperimentelle betingelser 19. Hos mus blev bestemt korrelation mellem slaghastighed og sammentrækning styrke vist. Ved 32 ° C, blev en indledende negativ FFR mellem stimulering satser på 0,1-1 Hz vist, hvorimod FFR viste sig at være positiv i intervallet 1-4 Hz stimulering 9-12 (Figur 3E).
Ved ikke myocardium en negativ sammenhæng mellem at slå sats og kontraktilitet beskrives 20,21. I dette manuskript, er standard pacing-frekvens (1 Hz) reduceret til 0,1 Hz og starte derfra, er pacing-frekvensen trinvist hævet til 5 Hz (0,2; 0,5; 1, 2, 3, 4, 5 Hz).
p-adrenerg stimulation
Katekolaminer som adrenalin og noradrenalin er hormoner, der frigives i løbet af (sygdomsfremkaldende) fysiologiske stress betingelser modulerende hjertefunktionen sammentrækningskraft ved aktivering af p-adrenoceptorer. Iatrogen anvendelse af katekolaminer spiller en fremtrædende rolle i den kliniske behandling af patienter med akut hjertesvigt at forbedre hjerte-inotropi midlertidigt. Denne virkning kan også ses og undersøgt i in vitro-studier. Som en agonist af beta-adrenoceptorer, isoprenalin øger kontraktile kraft ryk. In vivo, en stigning i slagfrekvens forekommer også (positiv inotrop virkning), somDerudover modulerer kontraktile respons (Bowditch virkning, se også FFR protokollen beskrevet ovenfor). Ved den her beskrevne fremgangsmåde kan inotrope virkning Isoprenaline blive undersøgt på en fast slaghastighed uden at chronotrope virkning (figur 3F). Stimulering af p-adrenoceptorer kan også opnås ved andre hormoner såsom histamin. I murine ventrikelvæv, anvendelse af histamin resulterer i en tofaset reaktion, der indeholder en første positiv inotrop virkning, men med en forbigående nedgang i spjæt kraft som vist i figur 3G. Derfor vil en fortolkning af målte data ved anvendelse af histamin synes at være vanskeligt; især den underliggende receptor-aktivering i mus er ikke helt løst.
Iskæmiske tilstande
Akut hjerteiskæmi defineres som en kritisk begrænsning af blodgennemstrømning fører til underforsyning af hjertevæv med ilt ognæringsstoffer resulterer i tab af kontraktilitet, udvikling af iskæmisk kontraktur og celledød. For at simulere iskæmi in vitro, er muskler udsat for 30 min til glucose- og pyruvat-fri ekstracellulær opløsning gennemboblet med 95% N2 / 5% CO2. Med denne tilgang en udtynding af ATP i cardiomyocytter skal fremkaldes. Inden for få minutter efter start af iskæmi-simulation, et fald på twitch kraft opstår med fremkomsten af et iskæmisk kontraktur afbilledet som en spontan stigning i preload spænding (Figur 3H).
Tabel 1: Komponenter og koncentrationer af de anvendte pufferopløsninger.
/>
Tabel 2: Liste over foreslåede forsøgsprotokoller at undersøge hjertekontraktiliteten i isolerede papillærmuskel præparater.
Figur 1. De vigtigste trin i papillærmusklen præparat. (A) Dissektion af begge forkamre. (B) Vis på venstre ventrikel forreste papillærmuskel. (C) Dissektion af papillærmusklen fra den ventrikulære væg. (D) Fastgørelse af to silketråde før fiksering i organbadet kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
6fig2.jpg "/>
Figur 2. Organ bad opsætning. (A) Skematisk indstilling af organbadet opsætningen. Vand jakke Organbadet kamre udstyret med beluftning glasfritter giver stabil temperatur kontrol. For at generere firkantpulser feltelektroder er bundet til vævet support. En krafttransducer registrerer sammentrækning af musklen og derved amplificere det genererede signal. Dette signal filtreres og overføres tilbage til computeren ved hjælp af en A / D-konverter. Signalet er derefter digitaliseret og kan gemmes til senere analyser. (B) Billede af en enkelt papillarmuskel forberedelse fastsat i organbadet kammer fra organbadet opsætningen (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
pg "/>
Figur 3. Repræsentative resultater af kontraktilitet målinger af murine venstre forreste papillarmuskler. (A) repræsentant analyse af spjæt kraftamplituden, tid til peak spænding (TTP) og halvmaksimal relaksationstid (R 50) af en enkelt trækning. Repræsentative optagelser af stimulerede sitren i murine papillærmuskel præparater under basal stimulation med et bankende på 1 Hz (B), under stigende ekstracellulære calcium-koncentrationer (C), under definerede hvilende intervaller (post hvile potensering PRP) (D), eller forskellige stimulation satser (kraft-frekvens relation, FFR) (E) og efter anvendelse af stigende koncentrationer af Isoprenaline- (F) eller Histamin-program (G). Repræsentativ registrering af stimulerede trækninger og forbelastning under iskæmi-stimulation (H).s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Analyse af kontraktile parametre. At karakterisere kontraktile funktion, parametre, herunder spjæt force amplitude (højde), tid til peak spænding (TTP) og halv maksimal afslapning tid (R 50 / TFall henholdsvis) analyseres i denne protokol ved hjælp af softwaren Programmet Figur 5.5 (ADInstruments). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en fremgangsmåde til at undersøge kontraktilitet murine papillarmuskel in vitro, som kan bruges til at besvare en række videnskabelige spørgsmål i forbindelse med hjerte fysiologi og patologi hos mus samt at støtte analysen af transgene linier og opdagelsen af nye farmaceutiske metoder til behandling af hjerteproblemer dysfunktioner. Vi illustrerer anvendelsen af denne metode til at vurdere fysiologiske, patologiske og farmakologiske egenskaber af hjertemusklens kontraktilitet (se figur 3). Yderligere programmer ikke illustreret her omfatter evaluering af intracellulære veje ved hjælp af forskellige farmakologiske midler (se også 12).
Hjertesygdomme, såsom iskæmisk hjertesygdom og hjerteinsufficiens vise en eminent klinisk problem og forbliver den førende årsag til dødelighed og sygelighed i hele verden 22. For mange proteiner udtrykt i hjertet, deres rolle for hjerte-kontraktilitet er still dårligt forstået eller ikke undersøgt indtil nu. Kontraktilitet måling på isolerede papillærmuskler viser en meningsfuld og anvendelig metode til at studere hjertets kontraktilitet in vitro i musemodeller.
Selvom metoden er teknisk muligt, og viser en god reproducerbarhed, er der flere kritiske trin, der er nødvendige for at sikre dens succes: Først efter at isolere hjerte, sikre en blod gratis løsning under proceduren forberedelse til at være i stand til at fungere korrekt (visualisering). Et andet afgørende skridt er, at forberedelse væv udføres omhyggeligt for at sikre levedygtighed ved at undgå enhver berøring eller strækning af papillærmusklen. Som beskrevet i metodeafsnittet forsøge at holde valvulær sejl tilsluttet papillærmusklen at sikre en fejlfri fastgørelse af silketråd. Efter fiksering af præparatet i organbadet kammer, ændre organbadet løsning flere gange i løbet af de første minutter til at skylle ud af BDM. IncreaSE forspændingen af præparatet lidt og gradvist, indtil der ikke mere stigning i ryk kraft opstår. Der er nogle eksklusionskriterier for evaluering af de enkelte protokoller såsom arytmiske beats og spontan forøgelse af verdensrige som et tegn for iskæmiske tilstande. Flere eksperimentelle protokoller såsom postrest potensering og kraft-frekvens forhold kan udføres med samme prøveforberedelse, mens en ny prøveforberedelse bør anvendes til analyse af narkotika-medierede virkninger på kontraktilitet. Fremstillingen protokollen er optimeret til at isolere venstre forreste papillærmuskel. Tilpasning af protokollen, også den bageste muskel kan anvendes til denne form for kontraktilitet målinger.
Denne metode til isolerede muskel måling papillær giver forskellige oplysninger om calcium-, temperatur- og frekvens-afhængige kontraktilitet, samt om den kontraktile respons efter anvendelse farmakologiske midler eller simulation af patologiske tilstande. Brug fortolkningen og ekstrapolation af disse resultater imidlertid skal håndteres med omhu videnskabelige. Den beskrevne fremgangsmåde er en in vitro model af hjertemusklen, afbrudt fra sin normale miljø og neural innervation. Derfor er de eksperimentelle betingelser ikke er fysiologiske og de modtagne i denne protokol resultater kan ikke overdrages uden dybdegående tolkning til situationen in vivo. For eksempel giver metoden ikke hensyn til ændringer i blodtryk, hormoner eller ydre neurale kontrol. Forsyningen af ilt og metaboliske kosttilskud til forberedelse i organbadet er begrænset af diffusion. En utilstrækkelig forsyning af ilt og metaboliske kosttilskud ville føre til iskæmiske forhold og efterfølgende ugyldige eksperimentelle resultater. For at undgå dette bør de eksperimentelle betingelser være optimal, især hvad angår iltning, koncentration af calcium og temperatur organbadet løsning.Med de eksperimentelle betingelser for protokollen beskrevet her, kan gyldige resultater gives.
I dette manuskript er beskrevet en fremgangsmåde til at simulere iskæmi-lignende betingelser. Derudover til simulering af hypoxi, blev alle energiske tilskud af organbadet opløsning forarmet at efterligne den iskæmiske tilstand in vivo så godt som muligt. I modsætning til hypoksi, blev det vist, at den samtidige udtømning af oxygen og energiforsyning fører til ændringer i calcium transienter kan sammenlignes med ændringer ses in vivo 23.
Beskrevet for isolering af muse papillærmuskel procedure kan tilpasses til andre arter, f.eks rotte. Men de optimale betingelser for organbadet setup kunne variere mellem forskellige dyremodeller og kan tilpasses. Parametre, der kan have behov for tilpasning er temperaturen og calcium koncentrationen af fysiologisk opløsning.
I summary, denne kontraktilitet metode giver en meget kraftfuld tilgang til at vurdere hjerte fysiologi, patofysiologi og farmakologi. Når de anvendes korrekt, giver det mulighed for at studere hjertets kontraktilitet i en isoleret, men godt kontrolleret miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Ombygning-Prozessen", FR 1638 / 1-2) og af DZHK (tysk center for Cardiovascular Research, en del af de tyske Centres of Health Research , som er en BMBF (tyske ministerium for uddannelse og forskning) initiativet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Hazard statement H 302, solve in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Hazard statement H 315-H319-H335 |
| Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335 |
References
- Endoh, M. Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers. Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Bers, D., Despa, S. M. Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response. Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).
- Bers, D. M. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
- Pieske, B., et al. al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium. Basic Res Cardiol. 92, Suppl 1. 75-86 (1997).
- Corbin, J. Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart. Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).
- Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip. Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).
- Näbauer, M., et al. Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts. Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).
- Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle. J Physiol. 507, 175-184 (1998).
- Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).
- Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type. Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).
- Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice. JMCC. 74, 307-317 (2014).
- Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation. J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).
- Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure. Basic Res Cardiol. 97, Suppl 1. 163-171 (2002).
- Koch-Weser, J., Blinks, J. R. The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility. Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).
- Bocalini, D. S. Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay. Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).
- Juggi, J. S. Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart. J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).
- Lakatta, E. G. Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy. Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).
- Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human. Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).
- Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. The force-interval relationship in human myocardium. J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).
- Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3rd, Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium. JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).
- Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud. Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).
- Lee, J. A., Allen, D. G. Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle. Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).
