Summary
Músculo papilar ventricular izquierdo murino se puede utilizar para investigar la contractilidad cardíaca in vitro. En este artículo se describe en detalle el aislamiento y los protocolos experimentales para estudiar las características contráctiles cardiacas.
Abstract
Del músculo papilar aislado a partir de corazones de ratón adulto se puede utilizar para estudiar la contractilidad cardíaca durante las diferentes fisiológicas / condiciones patológicas. Las características contráctiles se pueden evaluar de manera independiente de las influencias externas, como el tono vascular o el estado neurohormonal. Representa un enfoque científico entre las mediciones de células individuales con miocitos cardíacos aislados y los estudios in vivo, como la ecocardiografía. Por lo tanto, preparaciones de músculo papilar sirven como un excelente modelo para estudiar la fisiología cardiaca / fisiopatología y puede ser utilizado para investigaciones como la modulación por agentes farmacológicos o la exploración de modelos de animales transgénicos. Aquí se describe un método para aislar el músculo papilar anterior izquierda murino para investigar la contractilidad cardíaca en una configuración de baño de órganos. En contraste con una preparación tira de músculo aislado de la pared ventricular, el músculo papilar se puede preparar in toto sin dañar el músculo tissue severamente. La configuración de baño de órganos consiste en varias cámaras de baño de órganos de electrodos equipado con control de temperatura, gaseados y. El músculo papilar aislado se fija en la cámara de baño de órganos y estimuló eléctricamente. La fuerza de contracción evocada se registra utilizando un transductor de presión y parámetros tales como contracción fuerza de la amplitud y la contracción se analizan cinética. Diferentes protocolos experimentales se pueden realizar para investigar el calcio y la contractilidad dependiente de la frecuencia, así como curvas dosis-respuesta de los agentes contráctiles tales como catecolaminas u otros productos farmacéuticos. Además, las condiciones patológicas como la isquemia aguda pueden ser simulados.
Introduction
La investigación de las proteínas como los canales iónicos referencia su papel de la contractilidad cardíaca es esencial para descubrir diferentes mecanismos patogénicos y establecer nuevas estrategias terapéuticas para las enfermedades cardiacas como la isquemia y la insuficiencia cardíaca.
La función contráctil de los cardiomiocitos de mamífero se sabe que está modulada por diversos canales iónicos, transportadores y otras proteínas. Potencial de acción evocados activación de tensión depende del sarcolema de tipo L de Ca 2 + canales conduce a Ca 2 + afluencia desde el espacio extracelular y posteriormente a Ca 2 + inducida por Ca 2 + liberación (CICR) 1, lo que desencadena la contracción celular 2. Ca 2 + -señalización juega un papel central en la contractilidad cardíaca y la adaptación al estrés fisiológico o patológico. Las catecolaminas activan los receptores beta-adrenérgicos cardíacos, estimulando así la adenilciclasa (AC) que sintetiza cAMP. Al estar activada, protein quinasa A (PKA) fosforila diferentes intracelulares y de membrana proteínas asociadas como de tipo L de Ca 2 + canales, fosfolamban y receptores de rianodina que resulta en la modificación de Ca 2 + transitorios y 1,3,4 contractilidad cardíaca. cAMP se degrada por la fosfodiesterasa (PDE). La activación de los receptores acoplados a Gs distintos de beta-adrenoceptores también conduce a la acumulación de cAMP.
La técnica de las mediciones de contractilidad en tiras de músculo ventricular aislado está bien establecido para las especies de mamíferos más grandes 5-8. En base a la posibilidad de orientación de genes en ratones es importante establecer métodos para analizar la fisiología cardiaca murino. Sin embargo, los datos existentes sobre las propiedades fisiológicas de las preparaciones musculares aisladas en ratones difieren dependiendo de las condiciones experimentales 9-12.
El método descrito se utiliza para analizar la contractilidad cardíaca de pre músculo papilar ventricular izquierdoprepara- in vitro. Investigación de la contractilidad cardiaca se lleva a cabo en ausencia de influencias que modifican la contractilidad cardiaca in vivo, como la presión arterial, la estimulación neurohumoral y estrés físico o metabólico. La tasa de latidos de la preparación muscular contratación puede ser rigurosamente definido y cambió arbitrariamente. Twitch fuerza puede ser analizado en el contexto de estímulos específicos tales como la concentración de calcio, superando la frecuencia o la temperatura. Además, este método puede ser utilizado para investigar diferentes componentes de la vía de señalización y para comparar el rendimiento cardíaco de modelos de ratones modificados genéticamente mediante el control de las condiciones experimentales mencionadas anteriormente.
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Protocol
NOTA: Los pasos básicos del procedimiento de aislamiento se muestra en la Figura 1 Todas las etapas se describen en detalle en el siguiente protocolo.. El aislamiento del músculo papilar, de montaje en cámara de baño de órganos, la adquisición y el análisis se realiza en un plazo de tiempo consecutivo y obligatoria.
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la legislación alemana sobre protección de los animales y fueron aprobadas por la Junta de Revisión Ética de la Universidad de Heidelberg.
1. Preparación de Instrumentación
- Para la contractilidad mediciones utilizan una configuración de baño de órganos multicompartimentalizado. Componentes de una instalación de la contractilidad ex vivo baño de órganos se muestran en la Figura 2.
NOTA: Para reducir al mínimo la cantidad de tiempo entre la preparación del músculo papilar y el comienzo del protocolo experimental, configurar equipos y preparar tampones antes de recoger tissue.This experimentales provides la mayor cantidad de tiempo que el tejido permanece viable para llevar a cabo experimentos. - Poner en marcha los equipos informáticos y adquisición de datos. Encienda el calor baño de órganos (preajustado a 32 ° C) y permitir que las unidades a temperatura preestablecida.
- Preparar el equipo de adquisición. Iniciar la grabación de datos como se menciona en el manual del software.
- Comprobar y realizar la calibración (si es necesario) en cada canal y poner a cero todos los canales de normalizar la señal eléctrica suministrada desde el transductor de fuerza respectiva (asociado a ese canal) a una fuerza de 2 g suministrado por un peso certificado.
- Abra el suministro de gas (95% O 2/5% de CO 2) a las cámaras de baño de órganos. Gas continuamente todas las cámaras durante todo el protocolo de mediciones.
2. Preparación de tampones y soluciones fisiológicas
- Preparar una solución de tampón de Krebs-Henseleit para lograr concentraciones finales de NaCl 119 mM; 25 mM NaHCO 3; KCl 4,6 mM; Glucosa 11 mM; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl 2; 1,64 mM MgSO4; 1,18 mM KH 2 PO 4 y ajustar el pH a 7,4 (véase la Tabla 1 solución fisiológica).
- Prepare la solución tampón de Krebs-Henseleit separado para utilizar durante el aislamiento como se describe en el paso 2.1 con adicional monoxima 30 mM 2,3 butanodiona (BDM) y 50 IE de heparina / ml. Solución Enfriar a 4 ° C (ver Tabla 1 solución de Preparación). Para la simulación isquemia, isquemia preparar-solución como se describe en la Tabla 1.
- Para el protocolo del Ca 2 + - contractilidad dependiente, añadir Ca 2 + a la solución de tampón de Krebs-Henseleit a una concentración final requerida.
NOTA: preparar estas soluciones directamente antes de su uso y Gass con carbógeno para evitar la precipitación de carbonato cálcico. Precalentar la solución a 32 ° C antes de usar.
3. Preparación del Tubo y Disección gasificación de vajilla utilizada durante el procedimiento de escisión papilar
- Conecte un gas suavecantar tubo (diámetro externo de 2.4 mm) para la conexión de gas (oxígeno al 100%, carbógeno alternativamente) con trabajo de expertos.
- Crear un anillo cerrado del tubo de gasificación apropiado en el interior del plato de disección. Perforar el tubo de gasificación varias veces que un burbujeo continuo está asegurada. Este tubo de gasificación se puede utilizar varias veces.
- Preparar plato de disección con un elastómero de silicona en la parte inferior (0,5 cm de espesor), de modo que los pines se pueden pegar en ella. Este plato se puede utilizar varias veces.
4. Aislamiento del anterior izquierda papilar muscular de ratones
NOTA: Antes de comenzar el aislamiento del músculo papilar, compruebe que las líneas de gas están libres de obstrucciones.
- Preparar configuración baño de órganos como se menciona en la sección de protocolo desde 1 hasta 3 antes de iniciar la preparación de los músculos papilares. Preparar todas las soluciones en el día de la prueba.
- Sacrificar el ratón (aproximadamente 8-12 semanas de edad) por accordi dislocación cervicalng de trabajo de expertos y las directrices institucionales.
- Fijar el animal en posición dorsal mediante la fijación de las patas delanteras y traseras patas en una tabla de disección, abrir el tórax lateral en ambos lados por el corte a través de las costillas con unas tijeras afiladas de hueso, luego se corta el diafragma con un corte transversal. Retire el pericardio. Ahora el corazón y la aorta son accesibles.
- Fijar el corazón con unas pinzas romas en el tronco vascular cerca del corazón y separar el corazón rápidamente con las tijeras de los pulmones y el tejido circundante.
- Transferir el corazón que late a un plato de Petri llena con una solución de preparación enfriado gaseados con oxígeno (paso 2.2). Deje que el corazón lata y estimular las contracciones del corazón suavemente a través de tocar el vértice cardiaco con fórceps.
- Tan pronto el corazón es completamente exsanguinous, la transferencia a la placa de disección lleno de solución preparación enfriada (paso 2.2) y gaseados con O 2. A partir de este paso en el uso de un microscopio estereoscópico.
- Fijar el heata con una aguja pequeña a través del ventrículo derecho para que el corazón se ve desde dorsal (ventrículo derecho se encuentra en la parte derecha de la vista del operador).
- Usando tijeras de microcirugía separan ambas aurículas en el nivel auriculoventricular, corte la conexión de tejido de los ventrículos y descartan. Realizar un corte a través de la pared ventricular desde el nivel de la válvula AV a la punta del corazón evitando cualquier presión mecánica.
- Abra el ventrículo y fijar la pared libre del lado izquierdo con una pinza, teniendo así un vistazo a ambos músculos papilares del ventrículo izquierdo.
- Ligeramente cortar el tejido ventricular lateral en ambos lados del músculo papilar anterior izquierda conservando una parte de la vela valvular en la preparación del músculo papilar y evitar tocar o estirar el músculo papilar tanto como sea posible. Diseccionar el tejido de la pared ventricular restante del músculo papilar.
- Adjuntar hilos de seda (7/0, métrica 0,5) en ambos lados de la preparación del músculo papilarprepa-, uno en la vela valvular y uno en la parte muscular. Fijar la preparación en la cámara de baño de órganos lleno de solución del baño de órganos y gaseados con carbógeno, como se sugiere la temperatura de 32 ° C.
5. Equilibrio y estimulación del músculo papilar
- Estimular la preparación músculo papilar con pulsos rectangulares (duración de 2 ms y corriente de 100 mA) en la frecuencia de estimulación de 1 Hz inmediatamente después de la fijación en el baño de órganos.
- Asegurar un cambio frecuente de la solución del baño de órganos, ya sea por el cambio continuo o por el cambio manual de frecuente (cada 5 min) de acuerdo con la configuración del tipo de baño de órganos utilizado.
- Poco a poco aumentar la pretensión hasta que la fuerza de contracción máxima en llegar. Fuerza de contracción máxima se alcanza cuando el aumento de la pretensión no es seguido por un aumento adicional en la fuerza de contracción.
- Después de 45-60 min de equilibración, comenzar el protocolo experimental.
NOTA: El protocolo experimental descrito a continuación comprende maniobras estándar para caracterizar la contractilidad cardíaca bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. En la sección representativa describimos estos protocolos en detalle que también muestra resultados representativos (véase también el cuadro 2).
- Grabación y análisis de los protocolos experimentales
- Para la grabación, utilice un software adecuado con resolución temporal adecuada (velocidad de adquisición ≥ 1 kHz).
- Analizar parámetros incluyendo la fuerza de contracción de amplitud (altura), tiempo hasta el pico de tensión (TTP) y la mitad del tiempo de relajación máxima (R 50 / TFall, respectivamente) como se menciona en el programa de software (como ejemplo gráfico 5.5 de ADInstruments, véase la Figura 4).
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Representative Results
El protocolo de este manuscrito para las mediciones de contractilidad del músculo papilar murinos preparaciones aisladas se sintoniza en condiciones óptimas para lograr resultados experimentales reproducibles en condiciones fisiológicas. Para definir las condiciones experimentales óptimas hemos realizado experimentos piloto variables temperatura del baño de órganos y la concentración de calcio extracelular (véase también 12). El protocolo aquí descrito se realizó con una concentración de calcio extracelular de 1,5 mM y una temperatura de 32 ° C.
Propiedades de la contractilidad basal
Para caracterizar las propiedades de la contractilidad basales, los parámetros para la fuerza de contracción de amplitud, la tasa de contracción, tiempo hasta el pico (definido como el tiempo requerido para alcanzar la fuerza de contracción máxima a partir de 5% basal) y la relajación 50 tiempo (tiempo de relajación media máxima; definida como el tiempo requerido para llegar a la mitad de la fuerza de relajación) se utilizan en este protocolo. Un rastro representante de twpica y el análisis de estos parámetros se ilustran en la Figura 3A-B.
La contractilidad de calcio dependiente
Concentración de calcio extracelular determina crucialmente acoplamiento excitación-contracción cardiaca y mediante la variación de este parámetro, la sensibilidad al calcio del aparato contráctil en cardiomiocitos se puede evaluar. Como se muestra en la Figura 3C el aumento de los resultados concentración de calcio extracelular en los transitorios de calcio alterados y, posteriormente, en la generación de fuerza de contracción alterada. La concentración de calcio de la solución extracelular se incrementa paso a paso (es decir, entre 1,5 a 7 mm). Mediante la aplicación de este protocolo, la homeostasis del calcio sobre la contractilidad dependiente de calcio del aparato contráctil puede ser evaluada. En la configuración de baño de órganos utilizado en este manuscrito, se realizó el cambio de la concentración de calcio extracelular cambiando el solut baño de órganosiones conduce manualmente a una breve interrupción del ritmo y, posteriormente, a una potenciación postrest artificial (véase Fuerza potenciación después de intervalo de no estimulación).
La potenciación de la Fuerza después de intervalo de no estimulación (PRP)
Al final de un ciclo de contracción de calcio está secuestrado en retículo sarcoplásmico (SR) predominantemente por una bomba de calcio ATP-dependiente (SERCA, retículo endoplásmico sarco-calcio-ATPasa), disminuyendo así la concentración de calcio citosólico durante la diástole. Si se amplía el intervalo de tiempo entre dos contracciones, más calcio puede ser bombeada de nuevo en la SR y, posteriormente, más calcio puede ser liberado durante el próximo excitación. El protocolo postrest-potenciación (PRP) se describen alteraciones de la amplitud de la fuerza de contracción después de una estimulación previa con período de descanso de una duración definida. En humanos, rata, así como en el tejido cardíaco murino, un aumento de la fuerza de contracción se demostró 10,12-14,16 (
Contractilidad dependiente de la frecuencia (FFR)
Relación fuerza-frecuencia describe la correlación entre la tasa de latir y la fuerza de contracción contráctil (efecto Bowditch) 18. La relación fuerza-frecuencia difiere significativamente entre las especies de mamíferos y condiciones experimentales 19. En ratones, se demostró una correlación específica entre la tasa de latidos y la fuerza de contracción. A 32 ° C, se demostró una FFR negativo inicial entre tasas de estimulación de 0,1 a 1 Hz, mientras que el FFR demostró ser positiva en el intervalo de 1-4 Hz estimulación de 9 a 12 (Figura 3E).
En su defecto myocardium una correlación negativa entre la tasa de latir y la contractilidad está descrita 20,21. En este manuscrito, el ritmo de frecuencia estándar (1 Hz) se reduce a 0,1 Hz y a partir de ahí, la frecuencia de estimulación se incrementalmente elevó a 5 Hz (0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 Hz).
estimulación ß-adrenérgicos
Catecolaminas como la adrenalina y la noradrenalina son hormonas que se liberan durante (patógenos) condiciones de estrés fisiológico que modulan la fuerza contráctil cardiaca por la activación de la beta-adrenérgicos. Aplicación iatrogénica de catecolaminas juega un papel destacado en el tratamiento clínico de los pacientes con insuficiencia cardíaca aguda para mejorar inotropismo cardiaco temporalmente. Este efecto también puede ser visto y investigó en estudios in vitro. Como un agonista de beta-adrenoceptores, isoprenalina aumenta la fuerza de contracción contráctil. In vivo, un aumento en la frecuencia superando también se produce (efecto inotrópico positivo), queademás, modula la respuesta contráctil (efecto Bowditch, ver también el protocolo descrito anteriormente FFR). Utilizando el método descrito aquí, el efecto inotrópico de isoprenalina se puede investigar a un ritmo fijo sin que vencer a efecto cronotrópico (Figura 3F). La estimulación de beta-adrenoceptores también se puede lograr por otras hormonas tales como la histamina. En el tejido ventricular murino, la aplicación de los resultados de la histamina en una respuesta bifásica que contiene un efecto inotrópico positivo inicial, pero con un descenso transitorio en la fuerza de contracción como se muestra en la Figura 3G. Por esa razón una interpretación de los datos medidos mediante la aplicación de histamina parece ser difícil; especialmente el receptor de activación subyacente en ratones no está completamente resuelto.
Condiciones isquémicas
Isquemia cardiaca aguda se define como una limitación crítica de flujo de sangre que conduce a insuficiente de tejido cardiaco con el oxígeno ynutrientes resulta en la pérdida de la contractilidad, el desarrollo de contractura isquémica y muerte celular. Para simular la isquemia in vitro, los músculos están expuestos durante 30 minutos para glucosa y solución extracelular-piruvato libre burbujear con 95% N 2/5% de CO 2. Con ese enfoque un agotamiento de ATP en los cardiomiocitos se debe inducir. Dentro de pocos minutos después de comenzar la isquemia-simulación, una disminución de la fuerza de contracción se produce con apariencia de una contractura isquémica en la foto como un incremento espontáneo en la tensión de precarga (Figura 3H).
Tabla 1: Componentes y concentraciones de las soluciones tampón utilizadas.
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Tabla 2: Lista de los protocolos experimentales sugeridas para investigar la contractilidad cardiaca en preparaciones de músculo papilar aisladas.
Figura 1. Pasos clave de la preparación del músculo papilar. (A) La disección de ambas aurículas. (B) Ver en el músculo papilar anterior del ventrículo izquierdo. (C) La disección del músculo papilar de la pared ventricular. (D) La unión de dos hilos de seda antes de la fijación en la cámara de baño de órganos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. Configuración del baño de órganos. (A) Ajuste Esquema de la configuración de baño de órganos. Camisa de agua cámaras de baño de órganos dotados de fritas de vidrio de aireación proporcionan un control de temperatura estable. Para generar pulsos de onda cuadrada electrodos de campo están unidos al soporte del tejido. Un transductor de fuerza detecta la contracción del músculo que amplifica la señal generada. Esta señal se filtra y se transfiere de nuevo a la computadora mediante un convertidor A / D. La señal es entonces digitalizados y se pueden guardar para análisis posteriores. (B) Imagen de una sola preparación músculo papilar fija en la cámara de baño de órganos de la configuración de baño de órganos (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Los resultados representativos de las mediciones de la contractilidad de los músculos papilares anterior izquierda murinos. (A) Análisis Representante de la fuerza de contracción de amplitud, tiempo hasta el pico de tensión (TTP) y la mitad del tiempo de relajación máxima (R 50) de un solo tirón. Grabaciones representativos de contracciones estimuladas de preparaciones de músculo papilar murinos bajo estimulación basal con una tasa de latidos de 1 Hz (B), durante el aumento de las concentraciones de calcio extracelulares (C), durante intervalos definidos de descanso (potenciación de post resto, PRP) (D), o diferente tasas de estimulación (relación fuerza-frecuencia, FFR) (E) y después de la aplicación de concentraciones crecientes de Isoprenaline- (F) o la histamina-aplicación (g). Grabación Representante de contracciones estimuladas y precarga durante la isquemia-estimulación (H).s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis de parámetros contráctiles. Para caracterizar la función contráctil, parámetros incluyendo la fuerza de contracción de amplitud (altura), tiempo hasta el pico de tensión (TTP) y la mitad del máximo tiempo de relajación (R 50 / TFall, respectivamente) se analizan en este protocolo con el software Gráfico programa 5.5 (ADInstruments). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este manuscrito se describe un método para investigar la contractilidad del músculo papilar murino in vitro que puede ser usado para responder a varias preguntas científicas relacionadas con la fisiología del corazón y de la patología en ratones así como para apoyar el análisis de las líneas transgénicas y el descubrimiento de nuevos enfoques farmacéuticos para el tratamiento de disfunciones cardíacas. Se ilustra el uso de este método para evaluar las propiedades fisiológicas, patológicas y farmacológicas de la contractilidad del músculo cardiaco (ver Fig 3). Aplicaciones adicionales no ilustrados aquí incluyen la evaluación de las vías intracelulares utilizando diferentes agentes farmacológicos (véase también 12).
Enfermedades cardiacas, como la cardiopatía isquémica y la insuficiencia cardiaca presentan un problema clínico eminente y siguen siendo la principal causa de mortalidad y morbilidad en todo el mundo 22. Para muchas proteínas expresadas en el corazón, su rol en la contractilidad cardíaca es still mal entendido o no estudiado hasta ahora. La medición de la contractilidad de los músculos papilares aislados demuestra un enfoque significativo y válido para estudiar la contractilidad cardíaca in vitro en modelos de ratón.
Aunque el método es técnicamente factible y muestra una buena reproducibilidad, hay varios pasos críticos necesarios para garantizar su éxito: en primer lugar, después de aislar el corazón, garantizar una solución libre de sangre durante el procedimiento de preparación para poder funcionar correctamente (visualización). Otro paso crítico es que la preparación del tejido se lleva a cabo cuidadosamente para asegurar la viabilidad evitando cualquier contacto o estiramiento del músculo papilar. Como se describe en la sección método de tratar de mantener la vela valvular conectado al músculo papilar para asegurar una unión libre de problemas del hilo de seda. Después de la fijación de la preparación en la cámara de baño de órganos, cambiar la solución del baño de órganos en varias ocasiones durante los primeros minutos para eliminar la BDM. IncreaSE La pretensión de la preparación ligeramente y poco a poco hasta que se produce no más aumento de la fuerza de contracción. Hay algunos criterios de exclusión para la evaluación de los protocolos individuales tales como latidos arrítmicos y aumento espontáneo de la pretensión como una señal para las condiciones isquémicas. Varios protocolos experimentales tales como la potenciación postrest y la relación fuerza-frecuencia se pueden realizar con la misma preparación de la muestra, mientras que una nueva preparación de muestras se debe utilizar para el análisis de los efectos mediados por las drogas sobre la contractilidad. El protocolo de preparación está optimizado para aislar el músculo papilar anterior izquierda. Adaptar el protocolo, también el músculo posterior puede ser utilizado para este método de mediciones de contractilidad.
Este método de medición del músculo papilar aislado proporciona diversa información sobre el calcio, la temperatura y dependiente de la frecuencia de la contractilidad, así como sobre la respuesta contráctil después de aplicar agentes farmacológicos o la simulación de condiciones patológicas. Sin embargo, la interpretación y la extrapolación de estos resultados debe ser manejado con cuidado científico. El método descrito es un modelo in vitro del músculo cardíaco, desconectado de su entorno normal y la inervación neural. Por lo tanto, las condiciones experimentales no son fisiológica y los resultados recibidos en este protocolo no se pueden transferir sin interpretación en profundidad a la situación in vivo. Por ejemplo, el método no tiene en cuenta los cambios en la presión arterial, las hormonas o el control de los nervios extrínsecos. El suministro de suplementos de oxígeno y metabólicas para la preparación en el baño de órganos está limitada por difusión. Un suministro insuficiente de suplementos de oxígeno y metabólicas llevaría a condiciones isquémicas y los resultados experimentales posteriormente no válidos. Para evitar esto, las condiciones experimentales deben ser óptimas, especialmente en relación con la oxigenación, concentración de calcio y la temperatura de la solución de baño de órganos.Con las condiciones experimentales del protocolo descrito aquí, resultados válidos se pueden permitir.
En este manuscrito se describe un método de simulación de condiciones de isquemia-similares. Adicionalmente a la simulación de la hipoxia, todos los suplementos energéticos de la solución del baño de órganos se agotaron para imitar el estado isquémico en vivo lo mejor posible. En contraste con la hipoxia, se ha demostrado que el agotamiento simultáneo de suministro de oxígeno y energía conduce a cambios en los transitorios de calcio comparables a las alteraciones observadas in vivo 23.
El procedimiento descrito para el aislamiento de ratón músculo papilar se puede adaptar a otras especies, por ejemplo, rata. Sin embargo las condiciones óptimas de la configuración del baño de órganos podrían variar entre los diferentes modelos animales y puede ser adaptada. Los parámetros que pueden necesitar la adaptación son la temperatura y la concentración de calcio de la solución fisiológica.
En summary, este método contractilidad ofrece un enfoque muy poderosa para evaluar la fisiología del corazón, fisiopatología y farmacología. Cuando se utiliza correctamente, ofrece la posibilidad de estudiar la contractilidad cardíaca en un entorno aislado pero bien controlado.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (de KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelación-Prozessen", FR 1638 / 1-2) y por el (Centro DZHK Alemán de Investigaciones Cardiovasculares, una parte de los centros alemanes de Investigación en Salud , que es un BMBF (Ministerio alemán de Educación e Investigación) de iniciativa).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Hazard statement H 302, solve in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Hazard statement H 315-H319-H335 |
| Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335 |
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